1. BEVEZETÉS IRODALMI RÉSZ... 5

Átírás

1 1. BEVEZETÉS IDALMI ÉSZ Biokémiai reakciók és az enzimek Pirokatechin oxidáz (C, E.C ) Kvercetin 2,3-dioxigenáz (2,3QD, E.C ) Az 1H-3-hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz (Qdo) és 1H-3-hidroxi-4- oxokinaldin 2,4-dioxigenáz (Hod) (E.C és E.C ) Mangán-tartalmú szuperoxid dizmutáz enzim (MnSD, E.C ) Enzimatikus reakciók modellezése Pirokatechin oxidáz modellek Pirokatechinek autoxidációs reakciói Pirokatechináto-komplexek Szerves ligandumokkal képzett komplexek Kvercetin 2,3-dioxigenáz modellek Fotooxigénezési reakciók Báziskatalizált autooxidáció Fémtartalmú enzimmodellek Dioxigén-komplexek H-3-Hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz modellek MnSD utánzó vegyületek &e/.,7 =e6( Pirokatechin oxidáz modellek Kvercetin 2,3-dioxigenáz modellek H-3-Hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz (Qdo) és 1H-3-hidroxi-4- oxokinaldin 2,4-dioxigenáz (Hod) modellek MnSD utánzó vegyületek EEDMÉYEK ÉS ÉTÉKELÉSÜK Pirokatechin oxidáz modellek Pirokatechináto-réz(II) és cink(ii)-psh[hh itwivd A [Cu II (dbcat)(idpa)] 2 PSH[H itwivdpvv]huh]hwpqhd]qvtwivd A [Zn(dbcat)(idpa)] 2 PSH[H itwivdpvv]huh]hwh A [Zn(dbsq)(idpa)]Cl 4 PSH[H itwivdpvv]huh]hwpqhd]qvtwivd DbcatH 2 reakciója dioxigénnel [Cu II (dbcat)(idpa)] 2 jelenlétében DbcatH 2 reakciója dioxigénnel [Zn(dbcat)(idpa)] 2 jelenlétében Pirokatechin reakciója dioxigénnel TEMP szabad gyök jelenlétében Dioxigenáz modellreakciók éz(ii)- és réz(iii)-dioxigén adduktxph itwivd (Flavonoláto)- és (-benzoil-szaliciláto)réz(ii)-psh[hh itwivd [Cu II (fla)(bz-tac)]cl 4 PSH[H itwivdpvv]huh]hwpqhd]qvtwivd [Cu II (fla)(ipr-tac)]cl 4 PSH[H itwivdpvv]huh]hwpqhd]qvtwivd [Cu II (-bs)(bz-tac)]cl 4 PSH[H itwivdpvv]huh]hwh [Cu II (-bs)(ipr-tac)]cl 4 PSH[H itwivdpvv]huh]hwh

2 [Cu II (ind)(mco)] komple[h itwivdpvv]huh]hwh Flavonol reakciója dioxigénnel [Cu II (fla)(idpa)]cl 4 komplex jelenlétében éz(ii)-dioxigén adduktumok reakciója flavonollal A [Cu II (fla)(l-tac)]cl 4 (L = ipr, Bz) komplexek reakciója dioxigénnel [Cu II (ind)(mco)] komplex reakciója dioxigénnel xokinolin-származékok, illetve flavonol oxigénezési reakciója DPPH szabad gyök jelenlétében MnSD utánzó reakciók [Mn II (L) itwivd [Mn(L) 2 ] komplexek SD utánzó aktivitása Szuperoxid gyök-anion reakciója SD utánzó vegyületekkel BT reagens jelenlétében Szuperoxid gyök-anion reakciója SD utánzó vegyületekkel citokróm c(iii) reagens jelenlétében ÖSSZEFGLALÁS %HYH]HWpVpVFpLW ]pvh Alkalmazott kísérleti módszerek Új tudományos eredmények $WXGPiQ\VHUHGPpQ\HMHHQW VpJH KÍSÉLETI ÉSZ IDALMJEGYZÉK

3 1. Bevezetés $ ]YpHPpQ\ HV VUEDQ D YHJ\LSDUW WHV]L IHH VVp D UQ\H]HWL iupuw F G Q JEiLV PpUHW HV]HQQ\H]pVppUW 7pQ\ KJ\ D] XWyEEL pw pywl]hgehq kénytelenek voltunk szembesülni mindazokkal a hatásokkal, melyeknek a közvetlen forrása ez az iparág - közvetetten saját életmódunk, igényeink. Ha pusztán technológiai szempontból vizsgáljuk a környezetkárosító hatásokat, akkor beláthatjuk, hogy a legnagyobb problémát azok a melléktermékek jelentik, amelyek többnyire nem kerülnek IHKDV]QiiVUD pvvhvhwehq UQ\H]HW QHWLHWYHVDMiWpHWPLQ VpJ QHWUPEMi Épp ezért érthew KJ\DMHHQXWDWyLYDV]HPEHQWiPDV]WWWHJQDJ\EEHYiUiVKJ\ olyan eljárásokat találjanak, amelyek gyakorlatilag teljes szelektivitással és káros melléktermékek keletkezése nélkül szolgáltatják a kívánt terméket, természetesen minél kisebb energia-befektetés mellett. em kell messzire mennünk, hogy példát találjunk L\HQÄLGHiLVHMiUiVUD $PLQWDVDMiWWHUPpV]HWHV UQ\H]HW QD]p YLiJ Biológiai rendszerekben a kémiai átalakulások nagy kemo-, regio-, illetve sztereoszelektivitással játszódnak le. Erre szükség is van, ugyanis a molekuláris szinten WDSDV]WDKDWy FVHp\ HWpUpVH KDWiVD MHHQW V HKHW D V]HUYH]HWEHQ (pj FVD D genetikai információátadásra, illetve ennek kapcsán a mutáció jelenségére gondolnunk. A nagyfokú szelektivitás I pqw D] HY~FLy VUiQ LDDXW VSHFLiLV ÄELDWDL]iWUQD D]HQ]LPHQH V] QKHW (]HDIHKpUMpYDDPL\HQIDWU QHP IHKpUMH MHHJ VHJpGDQ\DJ VHJtWVpJpYH HVHWHQpQW DQp DWDL]iQD HJ\ DGWW UHDFLyW HKHW Yp WpYH D V]HUYH]HW V]iPiUD D V] VpJHV YHJ\ HW H itwiviw Bármilyen bonyolultak legyenek is az ilyen katalitikus reakciók, bizonyos W UYpQ\V]HU VpJH PLQGHQHVHWEHQ UYQDD]KDWy(]HIHWiUiVDPDQDSViJPiUFVD részben a biológia feladata. Pár évtizede egy új tudományág született, a bioszervetlen kémia, amelynek egyik célja éppen az, hogy a kémia nyelvén adjon egzakt magyarázatot biológiai jelenségekre. Ehhez kapcsolódik az enzimmodellezés is. Az enzimek aktív helyének közvetlen YL]VJiDWD P GpVL PHFKDQL]PXVX Pegértése sok esetben szinte megoldhatatlan. Az enzimfunkció megértéséhez ugyanakkor pont az aktív hely megismerésére, intermedierek kimutatására lenne szükség. Ilyen esetekben szerkezeti, és/vagy 3

4 funkcionális modellek tanulmányozása vezethet eredményre, hiszen a kémiában fejlett szerkezetvizsgálati és analitikai módszerek állnak rendelkezésre. Az oxidoreduktázok alkotják az enzimek egyik legnépesebb családját. A GJ]DWEDQ EHPXWDWiVUD HU PXQD FpMD QpKiQ\ HEEH D FVDiGED WDUW]y GL[LJHQi] [LGi] pv GL]PXWi] HQ]LP PGHMHLQH H itwivd pv PHJIHH enzimutánzó reakcióinak vizsgálata. A modellek között számos új, átmenetifémtartalmú komplexet találhatunk, néhány esetben igazodva az enzim sajátságaihoz IpP Qp YpJH]W Q PGHUHDFLyDW 0LQW D]W iwkdwmx D PHJIHH PGHH kapcsán egyrészt a feltételezett mechanizmusok bizonyítására, másrészt igen szelektív, KPJpQDWDLWLXVHMiUiVLGJ]iViUDQ\tLHKHW VpJ 4

5 2. Irodalmi rész 2.1. Biokémiai reakciók és az enzimek $] DHUE pwiupi phwp GpVHL VUiQ QIpH WiSDQ\DJDW DDtWDQD iw számukra hasznos terpphp PH\HE D]XWiQ IHpStWL VHMWMHLHW anabolizmus), vagy lebontásukkal (katabolizmus) energiát nyernek. Az átalakulási folyamatok összességét metabolizmusnak, vagy anyagcserének nevezzük (1. ábra). Energia TEMÉK TÁPAYAG Metabolizmus Katabolizmus (lebontás) Anabolizmus (szintézis) Enzimatikus reakciók sorozata S Z U B S Z T Á T U M 1. ábra. EnziPUHDFLyV]HUHSHD]p V]HUYH]HWHEHQ Enyhe körülmények között az egyes kémiai átalakulások nem, vagy csak csekély mértékben játszódnak le, mivel a reakciók aktiválási energiája általában nagy. Ezzel szemben a tapasztalatok azt mutatják, hogy a metaboll]pxv UpV]I\DPDWDL p V]HUYH]HWHEHQJ\UVDQPHQQHYpJEHDPLQDJ\V]iP~HQ]LPMHHQpWpQH V] QKHW Ez alapján az enzimh \DQ ELDWDL]iWUQD WHLQWKHW DPH\ek a reakciók aktiválási energiámiw HFV HQWYH HKHW Yp WHV]L D] J\UV HMiWV]yGiViW D PHJIHH biológiai környezetben. Az enzimek aminosavakból épülnek fel, vagyis a fehérjék családjába tartoznak. Molekulatömegük 1, Dalton-ig változhat [1]. Amennyiben csak DPLQVDYD DWMi HW HJ\V]HU IHKpUMpU EHV]p Q Sroteinek, apoenzimek), ha QHP IHKpUMH WHUPpV]HW UpV]W LV WDUWDPD]QD SUV]WHWLXV FVSUW DU összetett fehérjéku SUWHLGHKHQ]LPHYDQV]y(J\ YDJ\W EEVSHFLiLVXQaktív helyet WDUWDPD]QD PH\H D] HQ]LPIXQFLypUW IHH VH YDJ\Ls itt játszódik le egy adott 5

6 reakció katalízise. Ha egy enzim aktív helyén fémion található, akkor metalloenzimnek nevezzük (a fémet csak kofaktorként tartalmazó enzimeknél a fémtartalom nem mutat V]W FKLPHWULiWpVQHPIHWpWHQ D]DWtYKH\HQ W GLmeg). -HHP] M PpJKJ\FVDDGWWWtSXV~UHDFLyWDWDL]iQD(QQHDDSMiQD] alábbi csoportokba sorolhatók [2]: 1. Hidrolázok. Fehérjék peptidkötését, poliszacharidok glikozidkötését, vagy zsírok és foszfátok észterkötését hasítják hidrolízis reakciójuk katalízise révén. 2. xidoreduktázok. Ezek az enzimek redoxireakciókat katalizálnak, melyek során elektronok, vagy hidrogénatom kerül át egyik molekuláról a másikra. 3. Transzferázok. Egy meghatározott atomcsoport átvitelét katalizálják egyik molekuláról a másikra (pl. CH 3, -H 2, -CH, stb.). 4. Izomerázok. (] D] HQ]LPFVSUW QE ] iwuhqgh] GpVHV UHDFLyDW VHJtW H 5. Liázok. A szubsztrátum adott csoportját távolítják el nem hidrolitikus reakció során, vagyis eliminációs reakciókat katalizálnak. 6. Ligázok. Két molekula összekapcsolását katalizálják. A kapcsolt atomok szerint vannak C-, C- és C-C kötést kapcsoló ligázok. Az enzimek az átalakítandó vegyületre nézve is szelektívek. Az adott HQ]LPUHDFLyEDQ YiW]iVW V]HQYHG YHJ\ HWHWszubsztrátumnak nevezzük (1. ábra). E szelektivitást az enzimek aktív helyének, amely jellegzetes alakú üreges rész a PHXiQ EH V]WpULXV pv HHWUQLXV VDMiWViJDL EL]WVtWMi (]HQ D KH\HQ W GL PHJ pv DWLYiyGL D V]XEV]WUiWXP $ UHDFLy HMiWV]yGiViW YHW HQ D WHUPpH WiY]QDD]DWtYKH\U MetalloenzimH HVHWpEHQ D IpPLQ V]HUHSH YiW]y HJ\IH KDWiVW J\DUQDD]DWtYKH\HHWUQV]HUH]HWpUHPiVUpV]WDQQDWpUEHLHUHQGH] GpVpWLV befolyásolják. Általában elmondható, hogy a metalloenzimek nem annyira fémion-, mint inkább fehérjespecifikusak. A leggyakoribb fémek közé sorolható a vas, a mangán, a réz, a cink, a kalcium, a magnézium, a nátrium és a kálium. $ YHWH] IHMH]HWHEHQ az oxidoreduktázok családjába tartozó enzimek közül azok kerülnek bemutatásra, melyekhez kutatásaink kapcsolódtak. 6

7 Pirokatechin oxidáz (C, E.C ) Ez a növényi enzim azok közé a metalloenzimek közé tartozik, amelyek orto- GLIHQ V]iUPD]p [LGiFLyMiW DWDL]iMi D PHJIHH orto-kinonná, miközben hidrogén-perdoxid, vagy víz keletkezik (1) [3]. Ilyen reakciót képes katalizálni a tirozináz enzim is, amely ezen felül még hidroxiláz aktivitással is rendelkezik [3]. Az [LGiFLyVUiQHHWH] LQQV]iUPD]pDXWSLPHUL]iFLyVUHDFLyEDQSLUDWHFKLQ alapú melaninná alakulhatnak át, amelynek fontos szerepe van növények elhalt részeiben a patogének és rovarok elleni védekezésben [4]. H H Pirokatechin oxidáz H 2 2 (vagy H 2 ) (1) Az édesburgonyából (Ipomoea batatas) H QtWHWW HQ]LPU KJ\ PQPHU V]HUH]HW PHJiDStWWWi PHXDW PHJH M r és ellipszoid formájú (mérete Å). Szerkezetét B. Krebs és munkatársai EXAFS vizsgálatokkal azonosították [5]. A 2. ábrán látható, hogy az enzim magját négy α-helikális lánc alkotja, melyek közrefogják a két réziont tartalmazó aktív helyet. A hélixek által kialakított struktúrát (kavitást) két diszulfid-híd (Cis11 Cis28 és Cis27 Cis89) kapcsolja össze a nitrogénben gazdag -terminális résszel. 2. ábra. Az Ipomoea batatas-ból elkülönített pirokatechin oxidáz szerkezete (metforma) 7

8 Az aktív helyen található rézionok mindegyike három hisztdinhez kapcsolódik. A Cu(A)-ion a His88 (α 2 -hélix lánc), His109 és a His118 (α 3 -hélix lánc) imidazolos nitrogéatomjaihoz koordinálódik, a Cu(B)-ion a His240 (α 6 -hélix lánc), His244 és a His274 (α 7 -hélix lánc) aminosavakkal létesít koordinatív kötést (2. ábra). Az enzim metformájában a réz(ii)-ionok távolsága 2,9 Å. A hisztidinek mellett egy hidroxo-híd köti össze a rézionokat (Cu(A) 1,9 Å és Cu(B) 1,8 Å), így alakul ki a trigonális piramisos koordinációs övezet mindkét ion körül, ahol apikális pozícióban a His109, illetve a His240 található. Az egyes kötéstávolságokat az 1. táblázatban tüntettük fel. 1. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a C enzimben [5] Atompár Kötéshossz (Å) Atompár Kötéshossz (Å) Cu(A) His88 2,17 Cu(B) His240 2,08 Cu(A) His109 2,33 Cu(B) His244 2,23 Cu(A) His118 2,29 Cu(B) His274 2,23 Cu(A) H 1,85 Cu(B) H 1,78 Cu(A) Cu(B) 2,90 Kötés Kötésszög ( ) Kötés Kötésszög ( ) His88 Cu(A) His His240 Cu(B) His His88 Cu(A) His His240 Cu(B) His His109 Cu(A) His His244 Cu(B) His His88 Cu(A) H 140 His240 Cu(B) H 123 H118 Cu(A) H 114 H274 Cu(B) H 123 Az enzim oxidált formájával elvégzett ES vizsgálatok összhangban vannak a fenti szerkezettel, mivel az antiferromágneses kölcsönhatásban álló Cu(II) Cu(II) ionpár ES inaktívnak (S = 0) bizonyult [6]. UV-Vis spektrumukban 290 és 690 nm-nél találtak MHHP] abszorpciós sávokat, utóbbi a Cu(II)-LQUD MHHP] G-d átmenetekhez UHQGHKHW PHJ W Az oxi -forma Cu(II) 2 2- Cu(II) dioxigén vagy hidrogén-peroxid GpVpYH Dlakul ki a met -formából. Az oxi -forma UV-vis spektroszkópiás vizsgálata során egy intenzív sávot találtak 343 nm-nél ( log ε = 3,81) és egy gyengébb intenzitásút 580 nm-nél (log ε $] H EEL (π * σ ) &X,, W WpViWYLWHL sávhoz, míg az utóbbi 2-2 (π * ν ) &X,,iWPHQHWKH]UHQGHKHW $SLUDWHFKLQ oxidáz enzim oxi -formájának aman spektrumában 749 cm -1 -Qp MHHQWH] ViY D SHU[csoport µ-η 2 -η 2 KtGLJDQGXPpQWW UWpQ UGLQiFLyMiUDXWD 8

9 Az enzimkatalízis mechanizmusára a 3. ábrán látható javaslatot tették [7]. Az enzim-szubsztrát-psh[e 1 LQQ WiY]iViW YHW HQ LDDX D Ädezoxi -forma. Ezután a rézionok között µ:η 2 :η 2 -peroxohíd alakul ki (2), és a met -forma kialakulása közben egy további szubsztrátum kinonná oxidálódik. H H + E E Cu II (A) Cu II (B) "met"-forma H H H + E H Cu II (A) Cu II E (B) 2 E = enzim E Cu II (A) H Cu II (B) 1 E H 2 + H + H 2 E Cu I (A) Cu II (B) H E 2 + H "dezoxi"-forma 3. ábra. Pirokatechin származékok enzimatikus lebontásának javasolt mechanizmusa Kvercetin 2,3-dioxigenáz (2,3QD, E.C ) $] HV YHUFHWLQ -dioxigenázt Aspergillus Flavus-ból sikerült azonosítani [8]. Megállapították, hogy az enzim molekulatömege 111 kda, szénhidráttartalma 27,5% és 1 mól enzim 2 mól réz(ii)-iont tartalmaz. Bebizonyosodott, hogy a kvercetin (3,4,5,7-tetrahidroxi-flavonol) dioxigénnel való reakcióját katalizálja, melynek során a szubsztrátum C2-& HWW depszid (karbonsav észter) keletkezik (2) [9]. V WpVH KDVDG IH pv HJ\ &2 PHXD LpSpVH PHHWW H H H H H Kvercetin 2,3-dioxigenáz H + 2 C 2 H H H H + C (2) 9

10 Hasonló enzimet sikerült elkülöníteni Aspergillus niger-e is. Ennek móltömege 148 kda, szénhidrát-tartalma 46- KiUP DHJ\VpJE i pv PyQpQW 1,0-1,6 mól réz(ii)-iont tartalmaz [10]. Az ES vizsgálatok eredményei azt támasztják alá, hogy a réz(ii)-ion környezetében négy nitrogén található torzult síknégyzetes JHPHWULDV]HULQWLHUHQGH] Gpsben [10]. $] HV ULVWi\V]HUH]HWHW D]Aspergillus Japonicus-Ey Q\HUW HQ]LPU DSWi >@$V]HUH]HWDDSMiQD]HQ]LPa'DPyW PHJ J SUWHLGpWDHJ\VpJE álló, egységenként egy rezet tartalmazó homodimer (4. ábra). 4. ábra. A 2,3QD enzim szerkezete és a réz(ii)-ion koordinációs HUHQGH] GpVH. (A) torzult tetraéderes koordináció (B) torzult trigonális bipiramisos koordináció A természetes enzimben ~70%-os arányban van jelen az A forma (4. ábra), ahol a His66, His68 és His112 aminosavak imidazolos nitrogénatomjai mellett egy vízmolekula koordinálódik a réz(ii)-ionhoz torzult tetraéderes geometria szerint. A fennmaradó 30%-ban egy további glutaminsav (Glu73) koordinálódik a rézhez szabad karboxilfunkciós cspoortján keresztül, tj\ WU]XW WULJQiLV ELSLUDPLV HUHQGH] alakul ki (4. ábra. B). A fontosabb kötéstávolságokat a 2. táblázatban tüntettük fel. GpV $] HYpJ]HWW (65 PpUpVH LV pwiph UGLQiFLyV YH]HW HJ\LGHM MHHQpWpW mutatják [12]. agyobbrészt a tetragonális gephwuliud MHHP] UH]QDQFLDMHH g = 2,330 és A = 13,7 mt) mutatkoznak a spektrumon. A paraméterek, összevetve a korábbi tapasztalatokkal (a g-tenzor viszonylag nagy értéke és a g > g arány) [13], axiális szimmetriára utalnak. Ezek mellett kisebb arányban van jelen a g = 2,290 és A = 12,5 mt paraméterekkel leírható szerkezet. Az A viszonylag kis értéke ebben az HVHWEHQWU]XWWULJQiLVELSLUDPLVVV]HUH]HWKH]UHQGHKHW >@ 10

11 2. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok az Aspergillus Japonicus-ból származó 2,3QD enzimben [11] Atompár Kötéshossz (Å) Atompár Kötéshossz (Å) A B A B Cu His66 2,2 2,2 Cu Glu73 2,1 Cu His68 2,1 2,1 Cu H 2 2,2 2,4 Cu His112 2,1 2,1 Kötés Kötésszög ( ) Kötés Kötésszög ( ) His66 Cu His His68 Cu Glu His66 Cu His His68 Cu H His66 Cu H His112 Cu Glu73 86 His66 Cu Glu His112 Cu H His68 Cu His Glu73 Cu H 2 80 A korábbi feltételezésekkel ellentétben [10] a szubsztrátum-protein komplex V]LPXiFLyMD VUiQ D] H ] HEHQ EHPXWDWWW HUHGPpQ\HUH WiPDV]GYD D]W WDiWi KJ\ D V]XEV]WUiWXP QDJ\ YDyV]tQ VpJJH D -H csoportján keresztül egyfogú ligandumként kapcsolódik a rézhez [11], ahogyan azt az 5. ábrán feltüntettük. Az ilyen módon kötött szubsztrátum jóval reaktívabb dioxigénnel szemben, mint a kelátban stabilizált forma. 5. ábra. A 2,3QD enzim kvercetinnel képzett komplexének modellje Mindezek figyelembevételével az enzimatikus reakcióra a követke] iwdiqv mechanizmust javasolták [11] (6. ábra). E szerint a flavonol típusú szubsztrátumok a rézhez koordinálódva, vegyérték izomerizáció révén flavonoxi gyökké alakulnak (3), majd endoperoxid intermedieren (4 HUHV]W D PHJIHH kihasadása közben. pv]whuup EPDQD C 11

12 E = enzim Cu 2+ E flavonol Cu 2+ E C 2 H + C 2 Cu + Cu 2+ E E ábra. Flavonol származékok enzimatikus lebontásának mechanizmusa Az 1H-3-hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz (Qdo) és 1H-3-hidroxi-4- oxokinaldin 2,4-dioxigenáz (Hod) (E.C és E.C ) A Pseudomonas putida 33/1 által termelt Qdo [15,16] és az Arthrobacter ilicis ü61a-edq PHJWDiKDWy +G >@ IHH V D] H-4-oxokinolin és 1H-4-oxokinaldin - acil-dqwudqlvdy V]iUPD]pi W UWpQ ELGHJUDGiFLyMipUW )HW]QHU pv PXQDWiUVDL 16 2 / 18 2 izotópos kísérletekkel bizonyították, hogy a dioxigén mindkét atomja beépül a szubsztrátumba és a kihasadó C molekula oxigénatomja a szubsztrátumból származik [18]. H + H 2 Qdo = H Hod = Me H C 2 H + C (3) A Qdo és a Hod enzimek szerkezeti vizsgálata során kiderült, hogy sem szerves, sem szervetlen kofaktort nem tartalmaznak [18], ami dioxigenázok esetében rendkívül ritka. Aminosav szekvenciájukat, illetve másodlagos szerkezetüket tekintve az α/βhidrolázok családjához is sorolhatók [19]. Az enzimatikus reakció mechanizmusára kétféle javaslat született. Az egyik ionos közti termékeken keresztül vezeti le a termék keletkezését (7. ábra) [20]. Az aktív KH\HQ py V]HULQW HJ\ V]LQWpQ WW WDiKató hisztidin deprotonálja, aminek következtében a szerin nukleofillá válik és a szubsztrátum karbonil szénatomját támadja. 12

13 Kovalens kötés kialakulásával észter intermedier keletkezik (5). A protonált hisztidin kölcsönhatásba léphet az enzimben kötött anionos szubsztrátummal, ami kölcsönös stabilizációhoz vezet (6). A dioxigén az enzim-szubsztrátum-komplex karbanionos formáját támadja meg (7) peroxi-aniont eredményezve (8). Végül C molekula kilépése során keletkezik a PHJIHH -acil-antranilsav származék. Az enzim tehát sav-bázis katalízis révén segíti H DUHDFLyHMiWV]yGiViW H H H H [Ser- ] [His-H + ] [Ser- ] [His-H + ] [Ser- ] H H [His-H+ ] H H [Ser- ] + [His-H + ] Qdo = H Hod = Me H C 2 H [Ser] + [His] -C 2 H [Ser- ] [His-H + ] 8 H 7. ábra. Az oxokinolin származékok enzimatikus lebontásának ionos mechanizmusa Egyes Cu-Zn szuperoxid dizmutáz enzimeknél leírták hisztidinil-gyök ps] GpVpWD]HQ]LPSHU[LGiFLyVUHDFLyMDVUiQ>@(QQHHKHW VpJHD4GLHWYH Hod enzimeknél is fennál, ilyen módon az enzim hidrogénatomot vonhat el a szubsztrátumtól (8. ábra). Az így keletkezett gyök (9a és 9b) reakcióképes a triplett GL[LJpQQHV]HPEHQ>@$HHWH] DLSHU[J\ 10) a 2-es szénatommal gyökgyök reakcióban endoperoxidot eredményez (11). 0HJMHJ\]HQG KJ\ D] HQ]LP V]XSHU[id gyök-anion, vagy hidroperoxid gyök pv D V]XEV]WUiWXP HJ\LGHM PHJ WpVH UpYpQ WYiEEL HHWUQW DGKDW D 9a, vagy a 10 IUPiEDQMHHQpY V]XEV]WUiWXPQD(EEHQD]HVHWEHQDL-peroxid anion, vagy alkil- 13

14 hidroperoxid alakulhat ki. A 11 J\ V iwuhqgh] Gése után 12-t ad C hasad ki (13) majd elektronfelvétellel és az - kötés felbomlásával kialakul a termék. H H Qdo = H Hod = Me H C E H e H H 9a -C 13 H 9b H H H ábra. Az oxokinolin származékok enzimatikus lebontásának gyökös mechanizmusa Mangán-tartalmú szuperoxid dizmutáz enzim (MnSD, E.C ) A szuperoxid dizmutázok (SD) olyan metalloenzimek, amelyek a szervezetben HMiWV]yGy [LGiFLyV UHDFLy PHpWHUPpHpQW HHWH] V]XSHU[LG J\ -aniont alakítják vízzé és hidrogén-peroxiddá (4) [23]. oha a szuperoxid gyök-anion önmagában is képes diszproporcionálódásra, ennek sebessége (k = 10-4 M -1 s -1, ph = QHP HHJHQG DKK] KJ\ DWHUPH G J\ iuvtwy KDWiViW PHJH ]]H $ 62' HQ]LPH D GLII~]LyV QWU KDWiUiW HpU VHEHVVpJJH k = M -1 s -1, ph = 7,4) reagálnak a szuperoxid gyök-anionnal, így ezek az enzimek jelentik az els GHJHV védelmet a szervezet számára az oxidatív stressz ellen [24]. M (n+1)+ + 2 M n+ + 2 M n+ + 2H M (n+1)+ + H 2 2 (4) H + H $ 62' HQ]LPH D EHQQ WDiKDWy IpP IDWU PLQ VpJH DDSMiQ KiUP FVSUWED VUKDWy YDQQD SUDULyWiEDQ H IUGXy YDV- )H62' I pqw 14

15 eukaulywiedq IHHKHW Up]FLQ- &X=Q62' pv PLQGHQ H pq\ehq MHHQ py PDQJiQWDUWDP~ 0Q62' psylvh L $ PDQJiQW LHWYH YDVDW WDUWDPD]y HQ]LPH V]HUH]HWpU LGHU W KJ\ QDJ\Q KDVQyD HJ\PiVK] >@ PtJ D Up]FLQ V]HUH]HWHD]H EELHpW MHHQW VPpUWpEHQHWpU>@ $] HV PDQJiQWDUWDP~ 62' HQ]LPHW )ULGYLFK pv PXQDWiUVDL QtWHWWp H az Escherichia coli%edwpulxpey>@$pv EELV]HUH]HWYL]VJiDWVUiQLGHU W KJ\D0Q62'HQ]LPHHPEHULV]HUYH]HWEHQLVIHHKHW psylvh LDSUDULyWiEDQ WDiKDWyKPGLPHUV]HUH]HW HKH]pSHVWa'DPHXDW PHJ KPWHWUDPHUH (9. ábra) és egységenként egy mangán(ii)-iont tartalmaznak [28,29]. 9. ábra. Az Aspergillus fumigatus-ban található MnSD homotetramer szerkezete, egy alegysége és a mangán(ii)-ion koordinációs övezete [30] Az enzim alegységenként hét α-kpl[e pv W β-hph]e i $ PDQJiQLQ körül három hisztidin (His40, His88 és His178), egy aszparaginsav (Asp174) és egy vízmolekula helyezkedik el, torzult trigonális bipiramis geometria szerint, ahol apikális pozícióban, a vízmolekulával szemben a His40 található (9. ábra). Az aktív helyen WDiKDWyPDQJiQLQ UQ\H]HWHD]HPEHULHUHGHW 0Q62'HQ]LPHEHQLVL\HQPyGQ épül fel [28]. Az oxidatív stressz elleni védekezésben fontos szerepet játszó SD enzimek HpJWHHQ P GpVH HVHWpQ D V]HUYH]HW I]WW WHUKHpVQH YDQ LWpYH (QQH következtében hosszabb távon olyan betegségek alakulhatnak ki, mint a Parkinson-kór, az AIDS, vagy más, idegi alapú rendellenességek. 15

16 2.2. Enzimatikus reakciók modellezése $]HQ]LPHWLV]WDIUPiEDQYDyH QtWpVHPHJHKHW VHQQHKp]pVLG LJpQ\HV IHDGDW esshq H]pUW D HJW EE HQ]LP QHKH]HQ K]]iIpUKHW pv FVD HYpV YL]VJiDWUD Q\~MW HKHW VpJHW P GpV ppldl DVSHWXVDLW QHKp] IHWiUQL ) pqw D PHWDHQ]LPHHVHWpEHQMHHQWSUEpPiWKJ\DQDJ\PHXDW PHJ IHKpUMHFVHp\ fémtartalma spektroszkópiai módszerekkel csak korlátozottan vizsgálható. Ezen kívül a pontos hatásmechanizmusuk megértése részletes kinetikai vizsgálatokat igényelne, amelyhez jóval több és pontosabb mérésre lenne szükség. A nehézségek kiküszöbölésére modellvegyületeket és reakciókat kezdtek kidolgozni (9. ábra). Egy HQ]LP IXQFLyMiW HV VUEDQ DWtY KH\pQH V]HUH]HWH HHWUQLXV pv Vztérikus YLV]Q\DL EHI\iVMi YDJ\LV IXQFLy pv V]HUH]HW V]UVDQ VV]HI JJ VDMiWViJ pv D] H EEL PLQGHQpSSHQ EHI\iVMD D] XWyEEL LDDXiViW $ PGHH H]W D] HYHW YHWYHHWW VFp~D funkció reaktivitás, mechanizmus vizsgálat komplex és/vagy szubsztrátum reakciója enzimek aktív hely modellek szerkezet szerkezeti analízis átmenetifém komplexek 9. ábra. Enzimmodellek alkalmazása és szerepük 6]HUH]HWL PGHH HVHWpEHQ HV GHJHV V]HPSQW D] JHPHWULDL pv elektronikus sajátságainak minél nagyobb hasonlatossága az aktív helyhez. Ezek metalloenzimek esetében rendszerint olyan fémkomplexek, amelyekben a nagyppuhw IHKpUMHPHXiW HJ\V]HU V]HUYHV LJDQGXPD KH\HWWHVtWL tj\ VWDQGDUG U PpQ\H ] WW V]HUH]KHW D] HQ]LPH PHJLVPHUpVpKH] KDV]QV VSHWUV]ySLDL információk. Ilyen esetekben a kialakuló komplex általában túl stabilis ahhoz, hogy az enzimatikushoz hasonló reakciót katalizálja. Funkcionális modelleknél a szerkezeti hasonlóság másodlagos. Szerepük az, hogy minél nagyobb szelektivitás mellett képezzék az enzimatikus reakció termékeit. Ez 16

17 történhet oly módon, hogy csak magát a komplexet (apoenzimek esetében a szubsztrátumot) visszük reakcióba, más esetekben a modellt, mint katalizátort DDPD]]X D V]XEV]WUiWXP PHJIHH UHDFLyMiEDQ.LQHWLDL YL]VJiDWD D]XWiQ D PHFKDQL]PXV IHGHUtWKHW MHHQW V HUHGPpQ\ HKHW D] LQWHUPHGLHUH VSHWUszkópiai LPXWDWiVDMHHP]pVHYDDPLQWD QE ] V]XEV]WLWXHQVHKDWiViQDpUWHPH]pVH Pirokatechin oxidáz modellek Az enzimmodellek esetében gyakran a természetes szubsztrátumot valamilyen helyettesített származékkal pótolják. Többnyire a reakciósebesség befolyásolása, vagy a zavaró melléktermékek kizárása a cél. A C enzimek modellezése során a 3,5-di-tercbutil-pirokatechin (dbcath 2 ) a leggyakrabban alkalmazott szubsztrátum. A dbcath 2 H Q\H KJ\ terc-butil-fvsuwmdlqd HHWUQ G KDtása kedvez az oxidációs reakciónak, másrészt sztérikus gátlásuk révén megakadályozzák Diels-Alder típusú WHUPpHpS] GpVpWPH\HHWHJ\pEpQWD]o-benzokinon esetében kapnánk [31] Pirokatechinek autoxidációs reakciói A dbcath 2 (14) báziskatalizált oxigénezési reakcióját Tyson és Martell vizsgálták. A reakció során 3,5-di-terc-butil-1,2-benzokinon (dtbq) (15) és hidrogén- SHU[LG HHWH]L $ WHUPpH WYiEEL UHDFLyMD V]JiWDWMD D PHJIHH mukonsavszármazékokat [32,33]. A mechanizmust Speier és Tyeklár vizsgálták UpV]HWHVHEEHQ >@ LQHWLDL HUHGPpQ\HL DDSMiQ D YHWH] MDYDVDWW WHWWp ieud D UHDFLy HV pspvpehq -di-terc-butil-szemikinon (dbsq), illetve ennek protonált formája, valamint H 2 -ion keletkezik. A hidroperoxid-ion gyors reakcióban reagál a dbcath 2 -nel, a dbsq gyökanionnal, valamint dizmutál. A reakciók HUHGPpQ\HpSSHQ HHWH] GWET LHWYH D +22 tovább reagálnak egymással mukonsavszármazékokat eredményezve. Kinetikai vizsgálatok alapján a sebességmeghatározó lépésben, nem a H 2 2, hanem a H 2 -anion támadja meg a dtbq egyik karbonil-csoportját báziskatalizált A reakcióban. Ennek következtében egy hidroperoxid vegyület (16) keletkezik, ami Bayer-9LLJHUWtSXV~UHDFLyEDQUHQGH] át 2,4-di-terc-butil-cisz-cisz-mukonsavanhidriddé (17). A kapott anhidrid enyhén savas, vagy enyhén lúgos közegben stabilis, szolvolízise 5-(karboxi-metil)-3,5-di-terc-butil-2- furanon (18) kialakulásához vezet. GL 17

18 H 2 + H + + H 2 H H 18 CH 2 C 2 H C C ábra. A dbcath 2 báziskatalizált autoxidációs reakciója protonos közegben Aprotonos oldószerekben a reakció részletes mechanizmusát nem ismerjük. Speier és Tyeklár megállapították, hogy az oxigénezési folyamat végtermékei ilyen körülmények között megegyeznek ugyan a protonos oldószerek esetében kapottakkal, GH D UHDFLy PHFKDQL]PXVD HWpU >@ $ GEFDW+2 alkálifém sóit (19) oxigénezve azt tapasztalták, hogy a reakció egy gyors intermolekulás elektronátmenettel indul a dianionról a dioxigénre, aminek következtében szemikinon (20) és szuperoxid gyökanion keletkezik, s ezek lassú gyök-gyök reakcióban reagálnak egymással peroxo vegyületeket eredményezve. Intermedierként, A reakcióban 1,2-dioxetán származék (21) keletkezik, mely termikus bomlással fénykibocsátás mellett 2,4-di-terc-butil-ciszcisz-mukonsav származékot (22) eredményez (11. ábra). A kapott mukonsav hirolízisével laktonhoz jutunk (23). M + M + 2 M + + M M + M + 23 CH 2 C 2 H H + 22 C 2 M + C 2 M ábra. A dbcath 2 báziskatalizált autoxidációs reakciója aprotonos közegben 18

19 Az autoxidáció során tehát dtbq csak protonos oldószerben és ott is csak közti termékként keletkezik Pirokatechináto-komplexek A legkülönfélébb ligandumokkal képzett komplexeknek vizsgálták enzimutánzó WXDMGQViJDLW D] HP~W pywl]hghehq ( itwwwd HJ\-, illetve kétmagvú, réz(i)-, illetve réz(ii)-tartalmú komplexeket egyaránt és más fémekkel is történtek kísérletek. Ezeknek egy része az enzim szerkezetét, másik része pedig a hatásmechanizmusát volt hivatott modellezni. Tolman és csoportja számolt be réztartalmú pirokatechináto- illetve szemikinonáto-psh[h V]LQWp]LVpU >@ 'L[LJpQ-komplexek, [{Cu III (Bz- TAC)} 2 (µ-) 2 ](SbF 6 ) 2 t vagy [{Cu II (ipr-tac)} 2 (µ-η 2 :η 2-2 )]( 3 SCF 3 ) 2 -t (Bz-TAC = 1,4,7-tribenzil-1,4,7-triaza-ciklo-nonán, ipr-tac = 1,4,7-tri-izopropil-1,4,7-triaza-ciklononán) reagáltatva -80ºC-on dbcath 2 -nel és 3,4,5,6-tetra-kloro-pirokatechinnel (Cl 4 cath 2 ), szemikinonáto-komplexek keletkeztek jó hozammal ([Cu II (Bz- TAC)(sq)]SbF 6 ; [Cu II (ipr-tac)(sq)] 3 SCF 3, ahol sq = 3,5-di-terc-butil-benzoszemikinon vagy 3,4,5,6-tetra-kloro-benzo-szemikinon. A komplexek oxidációja során a PHJIHH LQQV]iUPD]pWDSWiWHUPppQW Elemi rezet o-benzokinonnal reagáltatva szemikinonáto-komplexhez jutunk, míg dbcath 2 és I fém-up] UHDFLyMiEDQ GLPHU IHpStWpV >&X (dbsq) 2 ] 2 komplex keletkezik [37]. Brown volt II D] DL D] HV >&X GEFDW/@ VV]HWpWH PSH[HHW H itwwwd ([Cu II (dbcat)(py) 2 ] 2, [Cu II (dbcat)(bpy) 2 ] 2 ) formájában [38]. 3ZHU pv PXQDWiUVDL PDQJiQWDUWDP~ PSH[HHW itwwwd H ([Mn 2 (dbcat) 2 (py) 6 ], [Mn 3 (dbcat) 4 (py) 4 ], [Mn 4 (dbcat) 4 (py) 6 ]) [39]. Bianchini csoportja számos Co(III), h(iii) és Ir(III) pirokatechináto-psh[hw itwww H ([M(triphos)(dbcat)] +, ahol M = Co, h, Ir; triphos = CH 3 C(CH 2 PPh 2 ) 3 ). A dbcath 2 dioxigénnel való katalitikus reakcióját megvizsgálva a fenti komplexek jelenlétében azt tapasztalták, hogy a ruténium-tartalmú komplex esetében kimutathatók voltak ugyan a J\ U Q\LWiVL UHDFLy WHUPpHL LV GH D I WHUPp GWET YW PtJ,U,,, HVHWpEHQ V]HHWtYHQFVDDV]XEV]WUiWXP[LGDWtYGHKLGUJpQH] GpVHMiWV]yGWWH>-42]. 19

20 Szerves ligandumokkal képzett komplexek ishida és munkatársai vizsgálataik során azt találták, hogy egymagvú réz(ii)- komplexek esetében kulcsszerepe van a koordinációs övezet geometriájának [43]. Síknégyzetes komplexek a pirokatechin oxidációját nem katalizálják, míg egyéb, térbeli HUHQGH] GpVPHHWWDUHDFLyHMiWV]yGL Kétmagvú rézkomplexek is hatásos katalizátoroknak bizonyultak a dbcath 2 oxidációs reakciójában. A koordinációs övezet szerkezete, hasonlóan az egymagvú komplexekhez, adsyhw HQ PHJKDWiU]]D D DWDLWLXV DWLYLWiVW $] Å-nél nagyobb Cu-&XWiYViJJDUHQGHH] PSH[HLQDWtYDpVFVDD]HQQpLVHEEWiYViJ HVHWpEHQ WDSDV]WDKDWy DWLYLWiV (] YDyV]tQ HJ V]WpULXV UD YH]HWKHW YLVV]D nevezetesen a két réz-lqqd \DQ WiYViJEDQ H HQQLH HJ\PiVWy DPL HKHW Yp teszi a szubsztrátum koordinálódását az elektron-wudqv]ihu H WW >@ (]W WiPDV]WMD Di az is, hogy a kétmagvú komplexek általában jobb katalitikus sajátságokkal rendelkeznek, mint egymagvú PHJIHH L [45]. Az elektronikus/szerkezeti hatások tekintetében még így is számos kérdés tisztázatlan a szerkezetileg jól körülírt komplexek HVHWpEHQ LV 1HP idstwkdwy PHJ SpGiX HJ\pUWHP VV]HI JJpV D PSH[H UHG[Lpotenciálja és a reakciók sebessége között, a szerkezet-aktivitásbeli összefüggések általában hipotetikusak Kvercetin 2,3-dioxigenáz modellek Fotooxigénezési reakciók Matsuura és munkatársai kísérletekkel igazolták, hogy a 3-hidroxi-flavon származékok fotooxigénezévl UHDFLyL D] HQ]LPDWLXV ~WQD PHJIHH WHUPpHW depszidet (-benzoil-szalicilsav származékot) adnak C és C 2 keletkezése mellett [46,47]. Az általuk javasolt mechanizmus szerint (12. ábra) a 3-hidroxi-flavon származékok szingulett dioxigénnel (3. táblázat) reagálva ketohidroperoxidot (24) psh]qh DPH\QH EHV iwuhqgh] GpVpYH QpJ\- vagy öttagú ciklikus peroxiddá (25, 26) alakulnak át. A szingulett állapotú dioxigénnek a fotooxigénezési reakcióban EHW W WWV]HUHSpW ]YHWHWWPyGQpPLDL~WQH állított szingulett dioxigénnel végzett 20

21 kísérlettel támasztották alá. A ketohidroperoxid keletkezését flavonoxilgyök keletkezésén keresztül írták le. Abból kiindulva, hogy a Mn 2 katalizálja fenolok fenoxilgyökké való átalakulását, elvégezték a 3-hidroxi-IDYQ PHJIHH UHDFLyMiW ieud (QQH eredményeként a 30 dehidrodimerhez jutottak mind nitrogén, mind dioxigén MHHQpWpEHQ DPL HJ\pUWHP EL]Q\tWp D J\ LQWHUPHGLHU 29 ps] GpVpUH $ reakcióban peroxilgyök (24) keletkezését nem észlelték, amit azzal magyaráztak, hogy a flavonoxilgyök inaktív triplett állapotú dioxigénnel szemben. Mn 2 = H H 1 2 H 29 2 vagy 2 H H H H C 2 H 27 0,5 2 -C 2 C 2 H 28 -C 12. ábra. Flavonolszármazékok fotooxigénezési reakciójának javasolt mechanizmusa és dehidrodimer keletkezése Mn 2 -dal való reakcióban 21

22 Endoperoxid (25) intermedier esetén közvetlenül a 28 depszidhez jutottak C keletkezése mellett. Az 1,2-GL[HWiQ KDVDGiVDU HV pspvehq HW-karbonsav (27) HHWH]L DPH\ H]W YHW HQ DDX iw HJ\ [LGDWtY GHDUE[LH] GpVL pspvehq depsziddé és C 2 -dá [46,47]. Studer és munkatársai a 3-hidroxi-flavon fotooxigénezési reakciójára az H EELHEHQ LVPHUWHWHWWHW HWpU PHFKDQL]PXVW MDYDVWD >@ DPH\ D HWWHV pv négyes szénatomok és szingulett dioxigén között lejátszódó [2+3] típusú elektrociklusos UHDFLypQW puwhph]khw $] GyV]HUKDWiVW YL]VJálva azt találták, hogy polaritástól I JJHWHQ PLQGLJ XJ\DQDKK] D WHUPpKH] MXWXQ GH D PHFKDQL]PXVEDQ MHHQW V eltérés tapasztalható. Apoláris oldószerben a szingulett dioxigén inaktív, így a triplett állapotú dioxigén reagál a flavonol tautomer formájával, míg piridinben a flavonol DQLQVIUPiMDYDQMHHQ$]HQiWLQHU VQXHILMHHJpQpIJYDUHDFLypSHVD] HU VHHWUILV]LQJXHWWGL[LJpQQHV]HPEHQ Báziskatalizált autooxidáció ishinaga és Matsuura azt találták [49-51], hogy a 3,4 -dihidroxi-flavon autoxidációja során (DMF-ban, terc-buk jelenlétében) a C2-& HWW V WpV IHKDVDG a 28 depszid és C kvantitatív keletkezése mellett. A mechanizmust tekintve a fotooxigénezési reakció esetében is feltételezett ketohidroperoxid (24) intermedieren HUHV]W tuwi H D I\DPDWW pv PHJiDStWWWi KJ\ D] GyV]HU Q YHY polárossága gátolja az enolátion kialakulását, így a reakció lassul. A ordstrom által kvercetinnel végzett kísérletek [52,53] során a várt depszid helyett 2,4,6-trihidroxi-fenil-glioxilsavat és 3,4-dihidroxi-benzoesavat kapott. Ez HJ\pUWHP HQ -dioxetán (26) intermedierre utalt, így ishinaga és Matsuura feltételezték, hogy a ketohidroperoxid (24) anionos formájának tautomériája révén a 25 és 26 ciklusok ej\pivvdsiukx]dpvdqps] GKHWQH Speier és munkatársai vizsgálták flavonol kálium-sójának oxigénezési reakcióját protikus és aprotikus közegben [54]. Az -benzoil-v]dlfliw WHUPp ps] GpVpW endoperoxid intermedieren kersztül vezették le. 22

23 Fémtartalmú enzimmodellek $] HV IpPWDUWDP~PGH1LVKLQDJD pvpxqdwiuvdl QHYpKH]I ] GL akik [Co II (salen)], illetve [Cu II (Ac) 2 ] katalizátort használtak flavonol származékok oxigénezési reakciójában. Mivel a kobalttartalmú rendszer hatásosabbnak bizonyult a réztartalmúnál, ezért a kiterjedtebb vizsgálatokat is ezen a rendszeren végezték. A reakcióban feltételezett [Co III (salen)(fla)] komplexet [Co III (salen)(h)] és 3-hidroxi- IDYQ UHDFLyMiEDQ itwwwi H [57], majd vizsgálták oxigénezési reakcióját [58]. pv V]HUH]HWpW U QWJHQGLIIUDFióval is meghatározták Speier, Kaizer és munkatársaik a [Zn(fla)(idpa)]Cl 4 komplex [59] autoxidációs UHDFLyMiW YL]VJiWi 0LQGHJ\L UHQGV]HU HVHWpEHQ GHSV]LGHW pv V]XEV]WLWXHQVW I JJ HQ DQQD KLGrolizált termékeit kapták. A kobalt esetében ciklikus voltammetriás módszerrel kimutatták [60,61], hogy a komplex DMF oldószerben disszociál és a dioxigén a flavonolát-ionnal báziskatalizált rendszereknél leírtak szerint reagál, vagyis a kulcslépés mindkét esetben a fém által deprotonált szubsztrátum és a dioxigén reakciója. A cinksó vizsgálatánál is hasonló mechanizmust javasoltak, azonban itt gyökös intermedierek szükségességét is sikerült igazolni. Kiderült, hogy a reakciósebesség az ilyen, nem redoxaktty UHQGV]HUHQpD]LQV]HSDUiFLyMiYDDUiQ\VDQQ $] HQ]LPDWLXV WXDMGQViJQD HJLQiEE PHJIHH PSH[HHW Up]]H itwwwi H 7DHGD pv PXQDWiUVDL IDYQ V]iUPD]p UHDWtY UpV]pKH] IUPDLDJ hasonló 1,2-ciklohexándion (illetve annak enolos formája), mint modellvegyület oxigénezési reakcióját vizsgálták metanolban CuCl. 2 5H 2 katalizátor jelenlétében [62]. $ UHDFLyEDQ I WHUPppQW -ketosav és C, melléktermékként α-hidroxi-adipát ps] GL $ UHDFLy IHWpWHH]pV V]HULQW J\ V mechanizmus szerint játszódik le, amelyre bizonyíték, hogy peroxid terméket is elkülönítettek, ami csak gyök-gyök rekombináció révén alakulhat ki. Speier és munkatársai Cu(I)- és Cu(II)-IDYQiWPSH[HHWitWWWDH ábra, 31), melyeket sikeresen alkalmaztak flavonol oxigénezési reakciójában. A 13. ieuiqiwkdwyd]ddpd]wwljdqgxppvd]h itwwwpsh[h VV]HWpWHH 23

24 A redoxaktív fémtartalmú modellek a leginkább elfogadhatók szerkezeti és funkcionális szempontból egyaránt. A részletes szerkezeti vizsgálatok és kinetikai mérések nyomán a 14. ábrán látható mechanizmus írható fel a réztartalmú komplexek autoxidációjára. Ligandum Komplex ef. Mechanizmus (14. ábra.) [Cu II (fla) 2 ] [63] B P PPh 3 [Cu I (PPh 3 ) 2 (fla)] [64] B phen [Cu II (phen) 2 (fla)]cl 4 [65] A tmeda [Cu II (tmeda)(fla) 2 ] [65] A bpy [Cu II (bpy)(fla) 2 ] [65] A H idpa [Cu II (idpa)(fla)]cl 4 [66] B H indh [Cu II (ind)(fla)] [67,68] B 13. ábra. éztartalmú 2,3QD modellekhez alkalmazott ligandumok A fotooxigénezési és báziskatalizált reakciókhoz hasonlóan itt is az enzimatikus termékek keletkeztek, endoperoxid (33), illetve 1,2-dioxetán (34) intermediereken keresztül. Lényeges különbség azonban, hogy az oxigénezési reakció a fém koordinációs övezetében játszódik le oly módon, hogy a réz(ii)-idyqiw PSH[E un. vegyérték izomerizáció révén flavonoxi-réz(i)-komplex (32) alakul ki. 24

25 K gyors Cu II Cu I k lassú Cu II Cu II 34 Cu II A Cu II B - C Cu II 33 Cu II 14. ábra. A réztartalmú modellek autoxidációs reakciójára javasolt mechanizmus Ezeket az eredményeket használták az eredeti 2,3QD enzim röntgenszerkezetének megállapítása után, az enzimatikus reakcióút leírására [11] Dioxigén-komplexek A triplett állapotú dioxigén szingulett állapotú szerves szubsztrátumokkal szemben kevésbé reakcióképes. A dioxigén elektronállapotait a 3. táblázatban tüntettük fel, aph\e LW QL KJ\ D WULSHWW PHHWW QDJ\EE HQHUJLDWDUWDP~ V]LQJXHWW állapotok is léteznek. edoxi-, valamint elektrociklikus reakciókban a elektronállapotú forma reagál [69]. 1 g $ V]LQJXHWW GL[LJpQ HHWH]pVpW D YHWH] HJ\HQHW V]HULQW pszelik el biológiai rendszerekben (5), ahol a reaktív forma kialakulásához redukált intermedierekre, vagy ezek vegyületeire van szükség H és H 2 2 (5) 25

26 1 g 1 g 3 g 155 7, oo oo π * x π * y A metalloenzimek kapcsán végzett modellreakciók egy része tehát arra, a biokémiában viszonylag ritkán tárgyalt kérdésre próbál kémiai választ nyújtani, hogy a dioxigén aktiválása milyen módon történhet az adott enzimben [70]. A 15. ábrán tüntettük fel a lehetséges dioxigén-komplexek szerkezetét. LM red LM η 1 "end"-on vagy LM η 1 "side"-on QD modell +LM red LM ML vagy transz µ η 1 :η 1 -peroxo LM ML bisz(µ-oxo) LM ML η 1-1,1 és/vagy LM ML µ-η 2 :η 2 -peroxo LM ML cisz µ η 1 :η 1 -peroxo C modell 15. ábra. A dioxigén koordinációjának lehetséges változatai Már korábban is feltételezték rendkívül instabilis réz-dioxigén komplexek keletkezését réz(i)-komplexek reakciója során víz-acetonitril elegyben, azonban az akkul YL]VJiDWL PyGV]HUHH QHP WDiWD HJ\pUWHP EL]Q\tWpDW pwh]pv UH [71,72]. $ PyGV]HUH IHM GpVpYH pv D YL]VJiDWL FpQD PHJIHH LJDQGXP alkalmazásával sikerült különféle dioxigén-psh[hhwh 3. táblázat. A dioxigén elektronállapotai és tulajdonságaik Elektronállapot (kj) gáz HM elatív energia Élettartam (s) foly. Elektronszerkezet 2- = 2- itwdqlpvlpxwdwql5p],ligandup PSH[HE LLQGXYD [LGDWtY DGGtFLy VUiQ MXWWWD D ieuiq Yi]W 26

27 szerkezetekhez [73-91], melyek a és fejezetekben tárgyalt enzimek dioxigén aktiválási modelljeiként foghatók fel. Egyes három-, illetve négyfogú ligandumok alkalmazásával az 1:1 arányú intermedier (15. ábra, QD modellek) és a dimer termék (15. ábra, C modellek) HHWH]pVH VV]HPpUKHW VHEHVVpJJH MiWV]yGL H pv VSHWUIWPHWULiVDQ PLQGHWW Q\PQ YHWKHW >6-83,85]. Más ligandumok esetében az 1:1 komplex keletkezése a VHEHVVpJPHJKDWiU]y tj\ D MHHQpY 0/ PSH[ D]QQD HUHDJi YHH GLPHU WHUPp keletkezése közben [89-91@ $ KDUPDGL HVHWEHQ D UHQGtY J\UV H HJ\HQV~\ UpYpQ kialakuló 1:1 komplex feleslegbe kerül, így a dimer keletkezése az 1:1 komplexre nézve PiVGUDQG LQHWLDV]HULQWYL]VJiKDWy>6-88, 92-94]. agy sztérikus hatású szubsztituenseket tartalmazó ligandumoknál kizárólag intermedier keletkezését figyelték meg [78,79] és egyes esetekben szilárd formában is elkülönítették [95-98]. A reakciókról általánosan elmondható, hogy azok entrópiája negatív, így a termodinamikailag kedvezményezett (negatív entalpia értékek) 1:1 DUiQ\~ LHWYH GLPHU WHUPpH LDDXiVD FVD LV K PpUVpHWHQ ps]hkhw H Mindezek mellett megállapították, hogy az HHWUQ G UHDFLyVHEHVVpJHW $ GLPHU V]HUH]HWH PDJMiW psh] a fémionok közötti távolság szabja meg. V]XEV]WLWXHQVH Q YHL D 022)M kötések tulajdonságait Kiemelt figyelmet érdemelnek azok a komplexek, amelyekben a µ η 2 :η 2 - peroxo- és a bisz(µ oxo)-diréz magok egymással egyensúlyban állnak. Az ilyen modellek jól reprezentálják az 2 WpV UHYHU]LELLV ELyJLDL KDVtWiViW (V pqw Tolman és munkatársai írták le ezt a jelenséget ipr-tac (1,4,7-tri-izo-propil-1,4,7- triaza-ciklononán) és Bz-TAC (1,4,7-tri-benzil-1,4,7-triaza-ciklononán) [99] ligandumokkal képzett, kétmagvú rézkomplexeknél [90,91,100]. Stop-flow kinetikai vizsgálatok során azt találták, hogy a dioxigén és a [Cu I (ipr-tac)(mec)] + prekurzor egyes részrend szerint reagál egymással, tehát a sebességmeghatározó lépés az 1:1 arányú dioxigén-réz-komplex kialakulása, még akkor is, ha ilyen vegyületet nem sikerült kimutatni. Acetonban végzett kísérletek során a termék ~4:1 arányban a µ η 2 :η 2 -peroxo- és a bisz(µ oxo)-diréz komplex volt. Az izoméria oldószerfüggést is mutat: THF-ban a bisz(µ oxo)-, míg CH 2 Cl 2 -ban a µ η 2 :η 2 -peroxo-komplex 27

28 keletkezése a kedvezményezett, az oldószerek keverésével az egyensúlyi összetétel is azonnal megváltozik..lvhee V]WpULXV LJpQ\ V]XEV]WLWXHQVH HVHWpEHQ S D %]-TAC ligandum benzilcsoportjai) [98], kizárólagosan bisz(µ oxo)-komplex keletkezését tapasztalták. Más, helyettesített diaminok, illetve triaminok vizsgálata során hasonló hatásokat figyeltek meg [ ]. A dioxigén kötésrendjének kialakulásában kétmagvú komplexek esetén tehát a legfontosabb szerepet a ligandumok közötti sztérikus kölcsönhatások játsszák. A ~3,6 Å Cu-Cu távolság peroxo-, míg ~2,8 Å távolság bisz(µ oxo)-komplex keletkezésének kedvez [105]. Legtöbb esetben a nagyobb termodinamikai stabilitású bisz(µ oxo)- PSH[HHWH]LD]QEDQQDJ\WpULW WpV LJDQGXPHVHWpEHQDLVHEEVWDELLWiV~ peroxo-iupdlddxivdydyv]tq EE -HHQW V KDWiVD YDQ PpJ D 1 Cu szögeknek a kialakult kelátokban. Háromfogú ligandumok esetében a négyzet alapú piramis geometria a bisz(µ oxo)- Cu(III)-komplex kialakulásának kedvez. Kétfogú ligandumok alkalmazása során a Cu síkbeli szögek kis értéke stabilizálja a bisz(µ oxo)-cu(iii)-komplexeket, mivel ilyenkor a rézion és az oxo-ligandum orbitáljai közötti átfedés nagyobb. Az HHWUQLXV KDWiVDW WHLQWYH DKJ\DQ D] YiUKDWy LV D] HHWUQ G FVSUW kedveznek a bisz(µ oxo)-cu(iii)-komplexek kialakulásának [106] H-3-Hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz modellek A kinolinszármazékok, ezen belül is a 1H-2-metil-3-hidroxi-4-oxokinolin biológiai lebontásának témakörében számos, a fejezetben tárgyalt enzimológiai munka jelent meg. A tisztított enzimek szerkezetvizsgálata és az enzimatikus reakciók termékeinek elkülönítése mellett sor került részletes mechanizmus vizsgálatokra is. Czaun pv 6SHLHU YL]VJiWi QE ] [LQLQ V]iUPD]p terc-buk jelenlétében lejátszódó báziskatalizált oxigénezési reakcióját THF, DMF és DMS oldószerekben [107,108], valamint a szubsztrátumok Li-sóinak hasonló reakcióját. Ezek 28

29 a rendszerek az ionos enzimreakció funkcionális modelljeiként foghatók fel. A reakciókra a 16. ábrán feltüntetett mechanizmust javasolták. H H H H H H H H ábra. xokinolin származékok báziskatalizált oxigénezési reakciójának mechanizmusa A szubsztrátumból (35) Ei]LV KDWiViUD D] HV HJ\HQV~\L pspvehq LDDX D PHJIHH DQLQ 36), mely keto-enol tautomer viszonyban van a 37 formával. A 37 karbanion ezután szuperoxiddá redukálja a dioxigént, miközben átmenetileg gyökké (38) alakul. A 38 J\ E D ps] G WW V]uperoxid hatására peroxid-származék (39) keletkezik, melynek további reakciója endoperoxidot (40), vagy 1,2-dioxetánt (41) szolgáltat. A másik lehetséges reakcióúton a 37 karbanion és dioxigén lassú reakcióban alakítja ki a 39 intermediert. Protonos oldószhuhehq D] XWyEEL UHDFLy~W MHHQW VpJH PHJQ DSUWQV ]HJEHQ D]QEDQ D]H EELUHDFLy~WGPLQi Az irodalom alapján a fejezetben tárgyalt gyökös mechanizmusra még nem született modell MnSD utánzó vegyületek A természetes SD enzimh KLiQ\V P GpVpW HQQH YHWH]WpEHQ D szuperoxid gyök-anion kumulálódását, számos betegség (pl. AIDS, rák, gyulladásos 29

30 betegségek stb.) kiváltó okaként tartják számon [109]. Ennek eredményeképpen az XWyEELpYWL]HGEHQMHHQW VpUGH GpVLUiQ\XWmesterségesKH\HWWHVtW H itwiviudpv vizsgálatára [110]. Annak ellenére, hogy a természetes enzimek mintájára, Fe, Mn és &X=Q IpPWDUWDP~ PGHHHW HJ\DUiQW H itwwwd pv WHV]WHWH in vivo KH\HWWHVtW pqw YDy DDPD]iVUD HJLQiEE D 0Q62' XWiQ]ó vegyületek alkalmasak. (]I pqwdv]dedgpdqjiq,,-lqlvheew[lflwiviqd V] QKHW >1]. $] H itwww PSH[H ] HGGLJ pw WtSXV MXWWW H D LQLDL WHV]WHLJ D helyettesített penta-aza-ciklusokkal [112] és a salen-típusú ligandumokkal [113] képzett komplexek. A 17iEUiQ D]HJ\pE~M LJDQGXPDH itwww62'xwiq]ydwlylwivw PXWDWy vegyületeket tüntettük föl a teljesség igénye nélkül. Az I 50 értékek azt a komplex koncentrációt jelölik, ahol a közvetett módszer [114] során alkalmazott indikátor vegyület és a szuperoxid gyök-anion között lejátszódó redoxi reakció sebessége 50%- kal csökken. Ez az érték jelzi a komplex szuperoxiddal szembeni aktivitását. -HHP] DPSH[UHKJ\DIpPPH\UHG[LiWPHQHWHjátszik szerepet a SD katalízis során. Egy vegyület azon redoxi átmenete révén mutathat SD utánzó DWLYLWiVWPH\QHIppSFV SWHQFLiMDD 22/ 2 és 2 /H 2 2 iwphqhwhqhphjihh -0,33 V<E 1/2 (vs. HE)<0,89 V értékek közé esik [115]. A feltüntetett -donor LJDQGXP HV Vorban a természetes enzim aktív helyének szerkezetét utánozva próbálják annak funkcionalitását minél jobban biztosítani. Ligandum I 50 (PM) edoxi átmenet ef. X H H H H H X 5,50 Mn(III)/Mn(II) vagy Mn(IV)/Mn(III) [116] X H H H 1,2 mg/cm -3 (polimer) Mn(III)/Mn(II) [117] 30

31 HB 0,75 Mn(III)/Mn(II) [118] 4 1 H H 2 3 0,043-72,00 5FVSUWWy I JJ HQ Mn(III)/Mn(II) [119] H H 4,3 Mn(III)/Mn(II) [120] H Me 2 C H H H 0,05 Mn(III)/Mn(IV) [121] Me 2 C 2,93 Mn(III)/Mn(II) [122] 17. ábra. MnSD utánzó vegyületek aktivitása és a felhasznált ligandumok A kémiai alkalmasságon, vagyis a szuperoxid gyök-anionnal szembeni szelektív reakciókészségen kívül, más feltételeknek is teljesülniük kell egy vegyülettel szemben [110]. Ezek közé tartozik a ligandumok biológiai lebonthatósága káros termékek kehwh]pvhqp DPSH[ H VWDELLWiVDWHUPpV]HWHVPSH[pS] HV]HPEHQ SDEXPLQYDDPLQWD]DDPD]WWLJDQGXPPHJIHH HQLVPpUHWH8WyEELQDD ELyJLDL PHPEUiQQ YDy iwmxwiv VUiQ YDQ V]HUHSH (EE D V]HPSQWEy QHP PHJHS KJ\ D V]LQWHWLXV LJDQGXP PHHWW HJ\UH QDJ\EE pugh GpV YH]L D Q YpQ\L YDJ\ idwl HUHGHW HiWpS] HW pv H]H DDPD]KDWyVigát MnSD utánzó vegyületekként 31

32 &plw ]pvh $ XWDWiVDLQ DDSMiW psh] pv D] H ] IHMH]HWHEHQ WiUJ\DW [LGUeduktáz enzimek szerepe lényegében a szubsztrátum és a dioxigén közötti redoxireakció lejátszódásához szükséges körülmények biztosítása. Az elemi lépések szintjén egymást YHW YDJ\SiUKX]DPV& H kötés felhasadás és új, C kötés(ek) kialakulása zajlik, aminek eredményeképpen oxidált termékhez és többnyire kis molekulájú melléktermékekhez jutunk (6). C H H 2 2 C C + H 2 H + C (6) Az enzim a molekulák egymással szembeni reakciókészségét képes kialakítani intra-, vagy intermolekuláris elektronátmeneti lépések révén. A legtöbb esetben az aktív helyükön fémet tartalmazó metalloenzimek rendelkeznek ilyen funkcióval, de láthattunk példát olyan proteinekre is, amelyek pusztán bázicitásuk révén játszanak szerepet a reakció során Pirokatechin oxidáz modellek 1. Ismert, hogy a C enzim aktív helyén 3-as típusú rézcentrummal rendelkezik. A réz redoxaktivitása révén képes a koordinált molekuláktól elektront elvonni, vagy azoknak elektront átadni. Ezt a jelenséget nevezzük vegyérték izomerizációnak. Feltételezésünk szerint a fém ezen tulajdonságának meghatározó szerepe van a C enzimp GpVHVUiQ Ennek felderítésére szerettünk volna rezet, illetve cinket tartalmazó, hasonló V]HUH]HW pwpdjy~ PSH[HHW D]QV LJDQGXPPD H itwdql pv D V]XEV]WUiWXP oxidációs reakciójában katalizátorként alkalmazni. A katalitikus reakció meckdql]pxviqd YL]VJiDWiYD HKHW VpJ Q Q\tW D]QV UQ\H]HWEHQ YL]VJiQL HJ\ redoxaktív (Cu) és egy nem redoxaktív (Zn) fém viselkedését. 32

33 2. A pirokatechin-wtsxv~phxidupivyhj\ HWHDWDEL]PXViQD ]EHQV WHUPpHpQW ps] GQH H V]HUYH]HWekben. Enzimatikus reakciók során tovább bomolhatnak, de egyébként stabilisak. Kiderült, hogy az un. polifenolok már régóta ismert gyökfogó, illetve antioxidáns sajátsága az orto-kh\]hw IHQV KLGU[LFVSUWQD V] QKHW Szabad gyök jelenlétében dioxigénnel reagáltatva a szubsztrátumot, szerettük volna a reakció mechanizmusát vizsgálni, ezzel választ kapni arra a kérdésre, hogy PLQH V] QKHW HV]HUH]HWUpV]LW QWHWHWWV]HUHSH 3.2. Kvercetin 2,3-dioxigenáz modellek 3. A 2,3QD enzim szubsztrátumot is tartalmazó modelljeinek autoxidációs reakcióját részletesen vizsgálták, és ennek alapján javaslatot tettek az enzimatikus UHDFLy PHFKDQL]PXViUD ieud,\hq PGHpQW itwwwi H D [Cu II (fla)(idpa)]cl 4 komplexet. Jelen munka során ezen komplex katalitikus aktivitását vizsgáltuk flavonol oxigénezési reakciójában. Célunk volt annak felderítése, hogy a ciklus során a termék gyors szubsztrátum-termék ligandumcsere során szabadul fel, vagy a szubsztrátum egyéb szerepet is játszik a mechanizmusban. Ennek alapján következtethetünk az enzimkatalízis során a szubsztrátum-termék csere mechanizmusára. 4. Láthattuk, hogy a 2,3QD eddigi modellvegyületeinél aktivált szubsztrátum reagált dioxigénnel. Egyéb oxidázok és oxigenázok P GpVH VUiQ IHWpWHH]KHW dioxigén-komplexek kialakulása a katalízis során. Irodalomból ismert dioxigén PSH[H pv IDYQ UHDFLyMiEDQ D]W V]HUHWW YQD LGHUtWHQL KJ\ HpS]HKHW -e az enzimatikus reakció lejátszódása ilyen úton, és ha igen, betekintést nyerni az oxigénaktiválás lehetséges mechanizmusába. 5. Az 1,3-bisz(2-piridil-imino)-izoindolinnal (indh) és flavonollal képzett vegyesligandumú komplex korábban alkalmasnak bizonyult az enzimatikus reakció PGHH]pVpUH (Q]LPPGHH H ittásánál az egyik szempont minél kisebb PHXDW PHJ PGHHH itwivd$4h-3-hidroxi-2-metil-benzopirán-4-on (mcoh) 33

34 szubsztrátumként alkalmazva arra voltunk kíváncsiak, hogy a 2-HV KH\]HW szubsztituenscsere a flavonolhoz viszonyítva (fenilcsoport helyett metilcsoport) módosítja-e a reakció kimenetelét és a mcoh alkalmazható-e modellvegyületként H-3-Hidroxi-4-oxokinolin 2,4-dioxigenáz (Qdo) és 1H-3-hidroxi-4-oxokinaldin 2,4-dioxigenáz (Hod) modellek 6. A Qdo és Hod enzimek kofaktort és fémet sem tartalmazó dioxigenáz enzimek. Általánosan elfogadott elképzelés, hogy az oxokinolin származékok oxigénezési UHDFLyMD LQV PHFKDQL]PXVVD MiWV]yGL H ÒMDEEDQ IHYHW G WW DQQD HKHW VpJH hogy a reakció gyökös mechanizmussal is végbemehet. Ionos modellreakciók során UiEEDQVLHUUHDDPD]WWHJ\V]HU V]XEV]WUiWXPpVV]DEDGJ\ UHDFLyMiEDQD]W szerettük volna tisztázni, hogy a gyökös mechanizmus szerepet játszhat-e az enzimkatalízis során. Annál is inkább indokolt ennek vizsgálata, mivel az enzim által kialakított hidrofób környezetben gyök-lqwhuphglhuh MHHQpWpW VD YDyV]tQ tartjuk sav-bázis párok keletkezésénél. EEQH 3.4. MnSD utánzó vegyületek 7. A 3-hidroxi-piranon származékok amellett, hogy aromás vegyületek katabolizmusának kö]ehqv WHUPppW psh]l V]iPWWHY PHQQ\LVpJEHQ MXWQD V]HUYH]HW QEH phplv]huh QHP WiSDQ\DJ VV]HWHY LpQW pv YLV]Q\DJ QDJ\ PHQQ\LVpJEHQLVHEPDQDV]HUYH]HW QHWiUVtWyKDWiVQp 6WDELLVHiWpS] sajátságuk ismert, így érdemesnek gondoltuk vizsgálni mangán(ii)-komplexeik SD utánzó aktivitását. 34