FUSARIUM GRAMINEARUM GÁTLÁSA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ÉLESZTŐGOMBÁVAL

Átírás

1 FUSARIUM GRAMINEARUM GÁTLÁSA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ÉLESZTŐGOMBÁVAL Sulyok, E., Biró, Gy.,Tamás, J. DE AGTC MÉK, Víz- és Környezetgazdálkodási Intézet, 4032 Debrecen, Böszörményi út 138., Összefoglalás Takarmánynövényeink és élelmiszereink penészes megbetegedés eredetű romlása, illetve fertőzöttsége világszerte komoly veszteséget okoz a tárolás során, melynek mind gazdasági, mind élelmiszerbiztonsági szempontból nagy jelentősége van. Az elmúlt időszakban egyre inkább olyan minőség megőrzésre irányuló eljárásokra (pl. hűtőtárolás, betárolás előtti hőkezelés, szabályozott légterű tárolás, növénynemesítés) irányul a figyelem, melyek lehetővé teszik a vegyszeres (fungicid) kezelések mellőzését, vagy csökkentett mértékű alkalmazását a tárolás során. Ezen eljárások egyike a biológiai védekezés - penészekkel szemben gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok alkalmazása - mely hazánkban a termények tárolása területén még kutatási szinten sem nagyon ismert. Állandó törekvés újabb és újabb antagonista mikroorganizmusok kiválasztása, gátló hatásmechanizmusuk megismerése, és gyakorlati használatra való alkalmasságuk vizsgálata. A munka célja is ezzel van összhangban: Fusarium graminearum-ot gátló élesztőgomba kiválasztása, vizsgálata. Summary Due to spoilage and contamination caused by molds on fodder plants and foods during postharvest storage high economic losses appear all over the world, but also safety aspects have to be considered. More and more technologies such as cooling, heat treatment before storage, controlled atmosphere storage etc. are investigated and applied in recent years in order to keep better quality of fruit and vegetables with omission or reduced use of chemicals during storage. Biological control using antagonistic microorgansims for inhibition of plant pathogenic molds - is one of the newer methods. Despite promising results in research and successful application in some countries biocontrol in fruit and vegetable storage is not well known even at scientific level in Hungary. Isolating newer and newer biocontrol agents, achieving more knowledge about the mode of action, enhancing their efficiency, investigating their capability for practical application is permanently in focus of researchers. The aim of this work is linked to this trend: screening and investigating antagonistic yeast - not applied up to the present - for inhibition of Fusarium graminearum. Kulcsszavak: Fusarium graminearum, biokontroll, Saccharomyces cerevisiae Bevezetés A mikroorganizmusok okozta fertőzésekkel és romlással szembeni védekezésre a termesztés és a tárolás során különböző eszközök, eljárások állnak rendelkezésre. Ezek közül nagyon elterjedt a különböző kémiai vegyszerek (fungicid kezelések) alkalmazása. Ezekkel szemben azonban mind fogyasztói, mind tudományos téren komoly aggályok léptek fel. Ezen túlmenően, pl. az Egyesült Államokban egyes fungicid hatású vegyszereket be is tiltottak, és a későbbiekben is további vegyszerek használatának visszaszorítására, alkalmazott mennyiségének csökkentésére törekednek (Wisniewski és Wilson, 1992). A gyümölcsök és zöldségek,

2 illetve a belőlük készült termékek a termelés különböző lépéseiben - termesztés, érés; betakarítás; tárolás; feldolgozás során - fertőződhetnek penészgombákkal. A szennyeződés forrásai a penészgombák különböző részei lehetnek: micélium darabka, spóra vagy konídium, illetve szkleróciumok. A micélium darabka azonnal fertőző képes, a spóra vagy konídium és a szklerócium azonban csak a megfelelő környezeti körülmények között csírázik (Nguyen-The és Carlin, 2000; Filtanborg et al., 2002). Penészeket gátló élesztőgombák és baktériumok gátlási hatékonyságának vizsgálata mellett egyre nagyobb hangsúlyt fektetnek a kutatók a gátlás hatásmechanizmusának feltárására. A hatásmechanizmus ismeretének birtokában lehetőség nyílik arra, hogy az adott antagonista szervezet hatékonyságát valamilyen eljárással - pl. genetikai, fizikai, kémiai - növeljük. Ezenfelül egy adott gátló szervezet ipari, kereskedelmi alkalmazása is nehezen valósítható meg a gazdaszervezet - patogén mikroorganizmus - antagonista mikroorganizmus közötti kölcsönhatás ismerete nélkül (Castoria et al., 2001). Ugyanakkor nagyon nehéz pontosan meghatározni egy adott mikroorganizmus által kifejtett gátlás hatásmechanizmusát, mivel a gátlás gyakran többféle hatás összekapcsolódásaként jön létre. A komplex gátló hatáson belül alapvetően négyféle jelenséget - tápanyagért, térért történő versengés, antibiózis; parazitizmus, növény ellenálló képességének növelése - szoktak megkülönböztetni (Droby et al., 1991; Arras és Arru, 1997). A növénykórokozó penészek, amelyek a tenyészidő során fertőzik a terményeket, a talajból és fertőzött vagy korhadó növényi részekből származnak, és a szél illetve az eső segítségével képesek az egészséges egyedekre eljutni. Tárolás során egyrészt a még a szabadföldön gyümölcsökre és zöldségekre tapadt mikroorganizmusok, másrészt a tárolótér saját mikrobiotája okozhat romlást. Ez utóbbi esetben a spórák vagy konídiumok közvetítő közege a hűtőtárolóban keringtetett levegő és a betárolást megelőző mosás vize lehet, de romlás alakulhat ki a fertőzött és egészséges egyedek közvetlen érintkezése következtében is (Stoll, 1977). Etter és munkatársai (1990) szerint a raktári megbetegedéseket okozó gombáknak csupán kis hányada származik a szántóföldről. A raktári gombák perzisztens fajok, azaz a rövid és a hosszúidejű tárolás során is képesek romlást okozni. Hazai viszonyok között az egyik legjelentősebb szántóföldi kórokozó a F. graminearum. Egyrészt rontja a kalászos gabonafélék, a kukorica minőségét, emellett mennyiségi károkat is okozhat. Veszélyes mikotoxinok termelése révén állat- és humánpatogén lehet. Hazánkban a trichotecén típusú mikotoxinok fordulnak elő leggyakrabban, közülük a deoxinivalenol (DON) jelenlétét mutatták ki legtöbbször a gabonafélékben. (Biró et al., 2011) Ezek a vegyületek lehetnek rákkeltőek, májkárosítók, teratogének vagy immununszupresszívek (Ciegler 1975). Az élelmiszerek feldolgozása során sok mikotoxin stabil marad, ezért nem csak az élelmiszerek és takarmányok alapanyagaiban, hanem az előállítot készetermékekben is megtalálhatóak. (Lauren és Smith 2001). Egyes élelmiszer-adalékanyagok, fontos gátló hatást fejtenek ki például az Aspergillus nemzettség tagjaira (Carmo et al 2008). Jelenlegi alkalmazott módszerek arra, hogy elpusztítsák a mikotoxinokat, többek között az élelmisszerek felmelegítése, ammóniás kezelés, a szűrés és besugárzás, de ezek túl költségesek, a kereskedelmi alkalmazhatóságuk sem minden esetben megoldott, mivel eltávolíthatnak létfontosságú tápanyagokat az élelmiszerekből. (Davidson 2001). Egyes mikroorganizmusokat hagyományosan használnak élelmiszerek eltarthatóságának növelésére, ez a módszer lehetővé teszi, hosszabb ideig való eltartáson túl a jó minőséget is. A különböző szennyeződések

3 eltávolítására mikroorganizmusokat, Saccharomyces cerevisiae és a tejsav baktériumok egyes csoportjait használják, amelyeket széles körben elterjedtek. (Shetty és Jeseprsen 2006) Anyag és módszer A kísérlet során alkalmazott, törzsgyűjteményből származó mikroorganizmusokat a Budapesti Corvinus Egyetem, Élelmiszertudományi Karának, Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye (NCAIM) bocsátotta rendelkezésemre. A vizsgálataim során az antagonista Saccharomyces cerevisiae (NCAIM Y.00034) élesztőfaj gátló hatását vizsgáltam Fusarium graminearum toxintermelő penészfaj esetében. Az élesztő faj fenntartása és szaporítása O.G.Y.E (LabM) szelektív táptalajon történt, mely 5 g élesztő kivonatot, 20 g dextrózt, 0,001 g biotint és 12 g agart, valamint oxytetracycline nevű kiegészítő antibiotikumot tartalmaz. A tápközeget 115 C-on 10 percig sterilizáltam, majd lehűtöttem 47 C-ra és hozzáadtam egy fiola antibiotikumot. A táptalaj elkészítése után lemezeket öntöttem és élesztővel beoltottam. Az elkészített lemezeket 25 C-on 5 napig inkubáltam. F. graminearum (NCAIM F.00970) penésztörzs fenntartását karboximetil-cellulóz (CMC) szelektív táptalajon végeztem (Burgess 1969), mely 15 g karboximetilcellulózt, 1 g NH 4NO 3, 1 g KH 2PO 4, 0,5g MgSO 4 7H 2O, 1 g élesztőkivonatot tartalmaz. 250 ml táptalajt Erlenmeyer lombikba töltöttem, majd beoltottam a Fusarium makrokonídiumaival és inkubáltam 3-4 napig, 25 C-on, rázógépen (150 rpm) aerob körülmények között. Az élesztő gátlási hatásmechanizmusát a következő módszerrel vizsgáltam: A penészt és az élesztőt maláta-glükóz (MG) tápközegen neveltem, mely 17 g maláta kivonatot (Biolab), 5 g glükózt (Biolab) és 20 g agart (Spektrom 3D) tartalmazott literenként. 5 ml C-ra visszahűtött tápközeg (MG) 5 ml-ébe 1 ml élesztő szuszpenziót kevertem. Az élesztő szuszpenzió sejtsűrűsége 9, ; 9, ; 9, ; illetve 9, sejt/ml volt. A tápközeg - élesztő keveréket lemezre öntöttem. Miután a tápközeg - élesztő keverék megdermedt, a lemez felületére középre 20 µl penész konídium szuszpenziót (sűrűség: 4, konídium/ml) cseppentettem (1.ábra). A kontroll minták nem tartalmaztak élesztősejteket. A vizsgálatokat két-két párhuzamos mintával végeztem. A lemezeket 25 C-on 5 napig inkubáltam. 1. ábra. Fusarium graminearum konídiumok és a Saccharomyces cerevisiae sarjsejtek mikroszkópos felvét ele 40 x-es nagyít ásban.

4 Eredmények és azok értékelése A vizsgált Fusarium graminearum törzs telepei az idő és a tápközeg élesztő tartalmának függvényében növekedtek. A penész kontroll telepei a vizsgált időben végig állandó növekedést exponenciális fázist mutattak. A kontroll törzs telepeinek átmérői 2. napon 5 mm, a 3. napon 7 mm 4. napon 11 mm az 5. napon 17 mm volt. A kísérlet tovább részében a F. graminaerum törzs viselkedését vizsgáltam az antagonista élesztő jelenlétében. Ez a (2. ábrán) követhető nyomon a konídium képző rész mérése során jelentős mértékű gátlás volt megfigyelhető. 2. ábra Fusarium graminearum törzs telepeinek növekedésének összehasonlítása eltérő élesztő sejszámú (sejt/ml) MG táptalajon. Fusarium graminearum penésztelep Kontroll 9, , , , Az élesztő sejtsűrűségének növelésével, növekvő gátlás volt megfigyelhető. A Saccharomyces cerevisiae alkalmazásakor a 9,4*10 6 sejt/ml sejtsűrűség már olyan mértékű gátlást eredményezett, hogy a penésztelep nem is fejlődött ki. Az antagonista élesztő hatékonyságának koncentrációfüggését vizsgálva, megfigyelhető hogy kis sejtsűrűséget alkalmazva is hatékonynak bizonyult. Az élesztő szuszpenzió koncentráció növelésének hatását az (1. táblázat) szemlélteti. 1.táblázat. Növekvő koncentrációban alkalmazott antagonista élesztőtörzs által kifejtett gátló hatás mértéke a kontrollhoz viszonyítva. Saccahromyces cerevisiae szuszpenzió koncentrációja (sejt/ml) sejtszám (sejt/ml) 9,4*10 6 9,4*10 4 9,4*10 2 9,4*10 1 Fusarium graminearum 100 % 84,11 % 70,58 % 34,11 % Annak érdekében, hogy az élesztő törzs gátló mechanizmusát még szemléletesebben kimutassam, a kísérlet folyamán mértem a penészek átmérőjét, azért, hogy a

5 kontrollal összevetve megfigyelhessem a növekedési tendenciát. A kapott eredményeket figyelembe véve kiszámítottam az egyes telepek növekedését a kontrollhoz képest. 3. ábra. Fusarium graminearum törzs kontroll telepének összehasonlítása a higítási fokokkal. Penésztelep átmérője (mm) ,1 4 2,7 2,1 0,9 1,2 11 3,5 1, ,7 5 11,2 kontroll 9, , ,4 x kísérlet időtartama (nap) A Fusarium graminearum konídium képző részének mérése során midegyik esetben, jelentős mértékű gátlás volt megfigyelhető. A legnagyobb sejtszámmal rendelkező minta (9, sejt/ml) esetében teljes növekedés gátlás volt tapasztalható, ezért a 2. ábrán nem is tudtam feltüntetni. Következtetések, javaslatok Az élelmiszerek penészes megbetegedés eredetű romlása világszerte komoly veszteséget jelent, mind gazdasági mind élelmiszerbiztonsági szempontból nagy jelentősége van. Az elmúlt időszakban egyre inkább olyan növényvédelmi eljárásokra irányul a figyelem, amelyek lehetővé teszik a vegyszeres kezelések mellőzését. Ezen eljárások egyike a a biológiai védekezés, jelen esetben a penészekkel szemben gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok alkalmazása. Az in vitro kísérleti eljárások során a Saccharomyces cerevisiae élesztőgombát választottam, mivel ez amindenki által jól ismert gomba a biológiai védekezés terén még kevés számú szakirodalommal rendelkezik. Az élesztő antagonista hatékonyságának vizsgálata során megfigyelhető volt a penésztörzs növekedésének befolyásolása. A munka folytatásaként fontosnak tartom a gáló hatásmechanizmus további vizsgálatát, illetve a gátlás genetikai hátterének megismerését. Irodalomjegyzék

6 Arras, G. Arru, S. 1997: Mechanism of action of some microbial antagonists against fungal pathogens. Annali di Microbiologica ed Enzimologia. 47, Biró, Gy. Mézes, L. Borbély, J. Tamás, J. 2011: Don-toxin analitikai elemzése az anaerob hidrolízis modellezése során. Környezetvédelmi analitikai és technológiai konferencia: 85. Burgess. T. J.1969: Plant Pathological Methods: Fungi and Bacteria, Publishing Company, pg 25 Carmo, E.S. Oliveira Lima E.; Souza E.L.: The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil in inhibiting the growth of some food-related Aspergillus species. Braz. J. Microbiol. 39, Castoria, R. De Curtis, F. Lima, G. Caputo, L. Pacifico, S. De Cicco, V.:2001: Aerobasidium pullulans (LS-30) an antagonist of postharvest pathogens of fruits: study on idt modes of action. Postharvest Biology and Technology. 22, Davidson, M.P Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. In M. P.Doyle, L. R. Beuchat, & T. J. Montville (Eds.), Food microbiology: Fundamentals and frontiers Washington: ASM pressp Droby, S. Chalutz, E. Wilson, C.L. (1991): Antagonistic microorganisms as biological control agents of postharvest diseases of fruits and vegetables. Postharvest News and Information. 2, Etter, L. Szigeti, G. Tabajdiné Pintér, V. 1990: Penészgombák szerepe takarmányok és élelmiszerek minőségromlásában p. In Téren, J.; Draskovics, I.; Novák, E.K. (Szerk.) Mikotoxinok, toxinogén mikotoxikózisok. Budapest: Magyar Élelmiszertudományi Egyesület, Gabonaforgalmi és Malomipari Szolgáltató Vállalat Nyomdaüzeme Filtenborg, O. Frisvad, J.C. Samson, R.A. 2002: Specific association of fungi to foods and influence of physical environmental factors p. In Samson, R.A.; Hoekstra, E.S. (Szerk.): Introduction to food- and airborne fungi. Utrecht: Centraalbureau voor Schimmelcultures. Hassan, G. Bullerman, L.B. (1997). Anti-aflotoxin activity of Lactobacillus casei pseudoplantarum. Int. J. Food Microbiol. 34, Lauren, D.R. Smith, W.A Stability of 328 fusarium mycotoxins nivalenol, deoxynivalenol and zearelenone in ground maize under typical cooking conditions. Food Addit. Cont. 18, Nguyen-The, C.; Carlin, F. 2000: Fresh and processed vegetables p. In Lund, B.M.; Baird-Parker, T.C.; Gould, G.W. (Szerk.): The microbiological safety and quality of food. Gaithersburg: Aspen Publishers, Inc

7 Shetty, P.H. Jeseprsen, L Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria as potential mycotoxin decontaminating agents. Trends Food Sci. & Technol. 17, Stoll, K. 1977: Mikrobiologische Aspekte der Haltbarkeit von Früchten und Gemüse. Aspekte der Haltbarkeit von Lebensmittel. Eidgenössiche Technische Hochschule Zürich. 21. Oktober p Wisniewski, M.E. Wilson, C.L. 1992: Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables: recent advances. Hortscience. 27,

8