Fluoreszcencia és reflexiós jeleket és képeket felvevő mérési módszerek alkalmazása és továbbfejlesztése növényélettani és minőségi vizsgálatokra

Átírás

1 Fluoreszcencia és reflexiós jeleket és képeket felvevő mérési módszerek alkalmazása és továbbfejlesztése növényélettani és minőségi vizsgálatokra PhD tézisfüzet LENK SÁNDOR Témavezető: Dr. Kocsányi László Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Atomfizika Tanszék Budapest

2 Előzmények A fluoreszcencia-mérés az anyag roncsolásmentes vizsgálatát teszi lehetővé. Növények esetében ez tipikusan a levél, illetve a gyümölcs vizsgálatát jelenti. E szervek a fényenergia hasznosításával, fotokémiai folyamatokon keresztül gyarapítják a növényt. A fluoreszcencia-fény kibocsátás általában a növényben folyó fotokémiai folyamatokkal párhuzamosan zajló jelenség. Mérésével elvileg a növény élettani funkcióira következtethetünk. Fontos figyelembe venni, hogy a gerjesztés és a detektálás spektrális tartományának, illetve a mérés időbeli lefolyásának függvényében a fluoreszcens jelből különböző folyamatok más és más paramétereire kaphatunk információt. Dolgozatomban az alábbi jelenségeket tanulmányoztam: Klorofill fluoreszcencia Látható gerjesztésre az emittált fény döntően a nm hullámhossz tartományra korlátozódik. Ennek a jelnek a forrása a levél klorofill molekuláinak fluoreszcencia-fény kibocsátása. A klorofill molekulák az elnyelt fényt a fotoszintézis folyamatának táplálására használják, míg a fotokémiai úton nem hasznosult többletenergiától fluoreszcencia fény kibocsátása vagy sugárzásmentes energia-disszipáció (hőfejlődés) útján szabadulnak meg. Így a klorofill pigmentek fluoreszcencia-fény kibocsátása a fotoszintetikus folyamatok fényhasznosításának egyik komplementer jelensége. Ennek megfelelően a fotoszintézis hatásfoka a klorofill-fluoreszcencia hozamot jelentősen befolyásolja. Ha egy növényi egyed esetén a megvilágítási körülmények megváltozására, így pl. sötétadaptáció utáni intenzív megvilágításra a fluoreszcencia fény csak kismértékben és lassan változik, akkor az általában a növény sérült, vagy blokkolt fotoszintetikus tevékenységére enged következtetni. Így jól definiált nagyságú és időbeli lefolyású megvilágítási körülmények során vizsgálva a fluoreszcencia fény intenzitásának időbeli változását a fotoszintetikus rendszerek funkcionalitására adhatunk becslést. UV gerjesztéssel keltett kék-zöld fluoreszcencia Ultraibolya (UV) gerjesztés esetén a klorofill fluoreszcencia mellett a levél a kék-zöld tartományban is bocsát ki sugárzást. Ennek a fluoreszcencia-fény kibocsátásnak a forrása nem a mezofillben található klorofill pigment, hanem a levél epidermiszének néhány összetevője. Bizonyos növényi stressz hatásokra azonban a fluoreszcencia e tartománya, az epidermiszben végbe menő folyamatok miatt, akár előbb is változásokat mutathat, mint a levélszövet mélyebb rétegeiben található klorofill pigmentek fluoreszcenciája. Különböző gerjesztési és detektálási hullámhosszakon mért fluoreszcenciák viszonya A különböző hullámhosszú gerjesztésekre emittált fluoreszcencia jelek összehasonlítása az epidermisz abszorpciójáról ad felvilágosítást. Az epidermiszben ugyanis több olyan komponens található, amelyekben az abszorbeált fény energiája nem fluoreszcencia-fény kibocsátásra, hanem más folyamatokra (például hő kibocsátásra) fordítódik. Ezen összetevők mennyiségi és minőségi monitorozása szintén nagy jelentőséggel bírhat. 2

3 Célkitűzések Alapvető célkitűzésem volt a fenti jelenségek tanulmányozása, valamint új az eddig ismert, a növények élettani állapotát, stresszhelyzetét objektíven mérő fluoreszcencia eljárásoknál bizonyos szempontból jobb eredményt adó mérési eljárások definiálása, megvalósítása és tesztelése. I. Ismert, hogy a növényekben zajló fotoszintézis vizsgálatára kifejlesztettek számos klorofill-fluoreszcencia effektus (pl. Kautsky-, illetve PAM-kinetika) mérésén alapuló eljárást és berendezést. Ezek sötétadaptáció (1-20 perces elsötétítés) után a növény levelét előre definiált, adott időbeli lefolyású (pl. állandó intenzitású, impulzusszerű, vagy ezek kombinációjából álló) megvilágítás(ok)nak vetik alá és az arra kibocsátott fluoreszcencia-intenzitás változásának időbeli lefolyásából (kinetikájából) következtetnek a növény fotoszintetikus képességére. Ehhez a kinetika karakterisztikus pontjainak számszerűsített értékét, azok viszonyát veszik objektív alapul. Célul tűztem ki egy olyan eljárás kidolgozását, amely a növény sötétadaptációja után kicsi, szabályozottan változó gerjesztés esetén reprodukálhatóan mérhető fluoreszcencia változást valósít meg, és ez a változás jellemzi a növény alkalmazkodó képességét a szabályozottan változó fényviszonyokhoz. Célom volt továbbá a javasolt eljárás tesztelése, a kinyerhető információ összevetése a fent említett ismert eljárásokban megszokottakkal. Az eljárást az Opti-Sens Bt által a BME Atomfizika Tanszék munkatársainak közreműködésével a GVOP projekt (GVOP /3.0, ) keretében kifejlesztett moduláris fluorométeren végeztem. II. Kialakult egy olyan vélemény, hogy a fluoreszcenciával bizonyos biotikus stressz helyzetek a látható tünetek előtt felismerhetőek lehetnek. Ezek vizsgálati lehetőségének megteremtése és magának a kérdésnek a vizsgálata volt munkám másik célkitűzése. Meg kellett tehát először is valósítanom a kék-zöld fluoreszcencia képfelvétel és vizuális megjelenés szinkron detektálhatóságát. Ezt a Karlsruhei Technológiai Intézet (Karlsruhe Institute of Technology, KIT) Botanikai Intézetének fluoreszcencia-kép felvevő rendszerén építettem ki. Ezután következett a fluoreszcencia képek alkalmazási potenciáljának szisztematikus kutatása az előbb megnevezett helyszínen, amelyhez szükség volt még a berendezés automatizálására a mérések számának növelése érdekében. Vizsgált jelenségként a vírusfertőzést választottam. A kutatás során azt kívántam eldönteni, hogy a kék-zöld fluoreszcencia-képek automatizált felvétele alkalmas-e a vírusfertőzés korai detektálására érintésmentesen, közelítőleg 0,5 méteres távolságból. III. A levelekben kialakuló UV abszorpció biológiai oka az alsóbb levélszövet védelme. Egy egyszerű modell szerint ennek mértékét a fluoreszcenciaképek hányadosával jellemzik. Célul tűztem ki az UV abszorpció kialakulásának monitorozását fluoreszcencia-képek hányadosának mérésével különböző fényviszonyoknak kitett levélminták esetében. IV. Célom volt továbbá, hogy részletesebben megvizsgáljam a fluoreszcencia jel változását az érési folyamat során a szőlő esetében. Abban bíztam ugyanis, hogy a fluoreszcencia képek jeleit, hányadosait a gyümölcs minőségét meghatározó összetevők (fenolok, cukor) felhalmozódásához kapcsolhatom. Ez ugyanis a gyümölcs minőségének érintésmentes vizsgálatát teszi lehetővé, ami a módszer fontos alkalmazási lehetőségét rejti magában a szőlészeti iparágban. 3

4 Alkalmazott berendezések Első célkitűzésemhez, egy új fluoreszcencia mérési módszer kifejlesztéséhez egy egyedi fejlesztésű, moduláris, hordozható növényi fluorométer használtam, melyet az Opti-Sens Bt és a BME valósított meg egy korábbi GVOP projekt keretében. Ez az eszköz az alkalmazott modulok megválasztásának függvényében különböző gerjesztő fényforrásokat (lézerdiódákat, LED-eket), illetőleg különböző spektrális bontóelemekkel (szűrőkkel) ellátott fotodiódákat és egy könnyen átprogramozható, beágyazott PC/104 formatényezőjű egykártyás számítógépet és adatfeldolgozó egységet alkalmaz. Választásom azért esett erre a berendezésre, mert a Kautsky-kinetika mérésének lehetőségét eleve magában hordozta, ugyanakkor a moduláris felépítés és programozhatóság lehetővé tette az új eljárás gyors kifejlesztését az adott készülékhez. Végül az eljárások tesztelése, összehasonlítása optikai és készülék szempontból identikus rendszeren történt (azonos szűrők, detektorok, fényforrások); különbség csak a mérési eljárásban volt, ami egyértelműen az új (egyedhez adaptált intenzitású gerjesztést alkalmazó) és a régi (nagyintenzitású megvilágítással dolgozó) eljárás összehasonlítását biztosította zavaró műszaki különbségek nélkül. További célkitűzéseimhez a KIT Botanikai Intézetének egyedi fejlesztésű, képfelvevő rendszerét használtam. A rendszer alapját egy impulzusüzemű Xenonlámpa mint gerjesztő fényforrás és egy, a lámpához szinkronizált, kapuzott képerősítővel rendelkező, előtét sávszűrőkkel ellátott kamera mint fluoreszcens képfelvevő eszköz képezi. Ezt a berendezést egészítettem ki egy színes (RGB) videó kamerával, és egy automatikus növényváltóval a vizuális tesztet szimuláló (RGB kamera) és a fluoreszcens detektálási módszert alkalmazó képfelvételi módszer összehasonlíthatósága és a mérések számának növelése érdekében. 4

5 Új tudományos eredmények Ph.D. munkám főbb eredményei a következő tézispontokban foglalhatóak össze: 1.) Növényfiziológiai vizsgálatokra új, a klorofill fluoreszcencia mérésén alapuló mérési eljárást és berendezést fejlesztettem ki. Az eljárás lényege az a felismerésem, hogy ha a sötétadaptáció után adott fényintenzitású fluoreszcenciára kényszerítem a levelet oly módon, hogy a gerjesztő fény intenzitását a pillanatnyi fluoreszcencia-változással ellentétesen meghatározott lépésekben szabályozom, akkor a gerjesztés intenzitásának időbeli változása (gerjesztési kinetika) a fotoszintetikus folyamatról ad információt. A javasolt visszacsatoló mechanizmus a gerjesztő fényt aktív módon, az egyedi levélminta fotoszintetikus képességéhez illeszti a mérés során. Megállapítottam, hogy a javasolt módszer új, fiziológiailag releváns információtartalommal bír a hagyományos technikákkal szemben, hiszen a görbe időbeli lefutása különbözik a hagyományos Kautsky-görbék inverzétől, és különös érzékenységet mutat a klorofill fluoreszcencia két spektrális maximuma között jelentkező különbségekre. [8, 10, 11] 1.ábra Példa a FluoroMeter Modul (FMM) készülékkel felvett, a 690 nm-en mért klorofill fluoreszcenciával (F690) szabályozott gerjesztő kinetika (LP) görbére olyan árpa (Hordeum vulgare L.) növény esetén, amely 48 órát zöldült fény hatására. Az ábra mutatja a 735 nm-en mért fluoreszcencia görbét (F735) is. A [11] publikáció alapján. 5

6 2.) Kimutattam, hogy a dohánymozaik-vírus korai tünetei a rezisztens dohányfajtánál felismerhetőek a kék-zöld fluoreszcenciakép-felvevő rendszerrel még mielőtt a látható tünetek jelentkeznek. Ezt az eredményt a KIT egyedi fejlesztésű képfelvevő rendszer hardverének és a kép előfeldolgozási módszerének továbbfejlesztésével értem el. Bizonyítottam, hogy a fluoreszcencia módszer a vizuális megfigyelésnél órákkal korábban jelzi a fertőzést a növény vírusra adott hiperérzékeny válaszának időbeli lefutásának függvényében. A kék-zöld fluoreszcencia megnövekedését a scopoletin felhalmozódásához kapcsoltam, és nem a szalicilsav megjelenéséhez, amely az irodalomból ismert módon a termikus felvételekkel történő korai detektálás lehetőségét adja. [2, 4, 5] 2. ábra Képek a dohány (Nicotiana tabacum L.) növény leveléről a fertőzés előtt, valamint órával a dohánymozaik-vírus fertőzés után. Első sor: UV gerjesztett kék fluoreszcencia 440 nm hullámhossznál ( UV F440), második sor: UV gerjesztett zöld fluoreszcencia 550 nm hullámhossznál ( UV F550), harmadik sor: kék fénnyel gerjesztett klorofill fluoreszcencia 690 nm hullámhossznál ( B F690) detektálva. Negyedik sor: RGB kamera képe (= látható tünetek). Az [5] publikáció alapján. 6

7 3.) Felismertem és igazoltam, hogy a mintáról (növényi levélről vagy teljes kultúráról) fluoreszcenciakép-felvevő rendszerrel rögzített, a kék és az UV tartományban gerjesztett klorofill fluoreszcencia képek intenzitásaránya alkalmas a levél UV védelmének jellemzésére és időbeli változásának tanulmányozására érintésmentes módon is, kb. 0,5 méteres távolságról. Sikeresen kimutattam az árpalevelekben az UV abszorbeáló pigmentek folyamatos növekedését, ami 3 nappal a növények kihelyezését követően érte el a telítődését. Ezzel párhuzamosan a karotenoidok fotovédelme is megnövekszik, így igazoltam, hogy a két folyamat párhuzamosan zajlik, emiatt az UV és a fotoszintetikusan aktív sugárzáshoz való alkalmazkodó képesség a két mechanizmus kooperációs hatásfokától függ. [1, 3, 5, 7, 9] 4.) Felismertem, hogy a leveleken kívül a gyümölcsök minősítésére is alkalmas a fluoreszcencia-képek, illetve a fluoreszcencia-képek hányadosainak módszere. Azt találtam, hogy az érettebb szőlő gyümölcsök esetén (melyeknél a cukor koncentráció 200 g/liternél nagyobb) a szőlő UV védelmét és egyben a gyümölcs minőségét meghatározó fenolok koncentrációja becsülhető a kék és UV gerjesztett fluoreszcencia-képek hányadosainak segítségével. Kétfázisú kapcsolatot találtam a korrigált log 10 (( UV F690-S)/ B F690) logaritmikus paraméter és a kempferol, valamint a kvercetin származékok relatív spektrális járuléka között. Megmutattam továbbá a B F740 fluoreszcencia paraméter segítségével, hogy a klorofill tartalom csökkenéssel párhuzamosan csökken a kékkel gerjesztett fluoreszcencia intenzitása is, ugyanakkor növekszik a gyümölcs cukortartalma, ami a szőlőszemek érésének felel meg. [5, 6] 7

8 Tézispontokhoz kapcsolódó tudományos közlemények [1] H. K. Lichtenthaler, G. Langsdorf, S. Lenk and C. Buschmann: Chlorophyll fluorescence imaging of photosynthetic activity with the Karlsruhe fluorescence imaging system. Photosynthetica (2005) 43(3), IF: 0.810, független idézők száma: 27. [2] S. Lenk, C. Buschmann, D. Van Der Straeten, L. Chaerle: Using ImageJ for processing fluorescence and reflectance image sequences of plant leaves, Proceedings of the ImageJ User and Developer Conference (2006) pp , Luxembourg, Luxemburg. [3] S. Lenk and C. Buschmann: Distribution of UV-shielding of the epidermis of sun and shade leaves of the beech (Fagus sylvatica L.) as monitored by multicolour fluorescence imaging. Journal of Plant Physiology (2006) 163(12), IF: 0.810, független idézők száma: 10. [4] L. Chaerle, S. Lenk, D. Hagenbeek, C. Buschmann and D. Van Der Straeten: Multi-color fluorescence imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus. Journal of Plant Physiology (2007) 164(3), IF: 2.239, független idézők száma: 15. [5] S. Lenk, L.Chaerle, E. Pfündel, G. Langsdorf, D. Hagenbeek, H. Lichtenthaler, D. Van Der Straeten, C. Buschmann: Multispectral fluorescence and reflectance imaging at the leaf level and ist possible applications. (2007) Journal of Experimental Botany (Imaging Stress Responses in Plants Special Issue) 58(4) IF: 3.917, független idézők száma: 21. [6] S. Lenk, C. Buschmann, E. Pfündel: In vivo assessing flavonols in white grape berries (Vitis vinifera L. cv. Pinot Blanc) of different degrees of ripeness using chlorophyll fluorescence imaging. Functional Plant Biology (2007) 34(12) IF: 2.375, független idézők száma: 12. [7] M. Štroch, S. Lenk, M. Navrátil, V. Špunda, C. Buschmann: Epidermal UVshielding and photosystem II adjustment in wild type and chlorina f2 mutant of barley during exposure to increased PAR and UV radiation. Environmental and Experimental Botany (2008) IF: 2.301, független idézők száma: 3. [8] A. Barócsi, S. Lenk, L. Kocsányi, C. Buschmann: Excitation kinetic during induction of chlorophyll fluorescence. Photosynthetica (2009) 47 (1) IF: [9] L. Chaerle, S. Lenk, I. Leinonen, H. G. Jones, D. Van Der Straeten, C. Buschmann: Multi-sensor imaging of plant stresses: Towards the development of a stress-catalogue for stress-catalogue. Biotechnology Journal (2009) 4 (8) Független idézők száma: 14. [10] A. Barócsi (20%), L. Kocsányi (20%), S. Lenk (20%), I. Péczeli (20%), P. Richter (20%): Eljárás és berendezés növények egyedi élettani tulajdonságaihoz adaptált klorofill fluoreszcencia indukáláshoz szükséges gerjesztési kinetika mérésre. Szabadalom (2009) Ügyszám: P

9 [11] C. Buschmann, S. Konanz, M. Zhou, S. Lenk, L. Kocsányi, A. Barócsi: Light Induction Kinetics Based on Feedback Regulation of Chlorophyll Fluorescence for Characterizing Photosynthetic Light Utilization. Photosynthetica (2013) 51 (2) IF: 1.000* További tudományos közlemények [12] P. Maák, S. Lenk, L. Jakab, A. Barócsi and P. Richter: Optimization of transducer configuration for bulk acousto-optic tunable filters. Optics Communication (2004) 241, IF: 1.581, független idézők száma: 5. [13] K. Georgieva, S. Lenk, C. Buschmann: Responses of the resurrection plant Haberlea rhodopensis to high irradiance. Photosynthetica (2008) 46 (2), IF: 1.000, független idézők száma: 11. [14] G. Dobos, A. Somogyi, S. Lenk, F. Ujhelyi, Zs. Szita, L. Kocsányi: Application of the photomodulated reflectance technique to the monitoring of metal layers. Physica Status Solidi C - Current topics in Solid State Physics (2011) 8(9) [15] Á. Solti, G. Tamaskó, S. Lenk, A. Barócsi, Z. Bratek: Detection of the vitalization effect of Tuber mycorrhiza on sessile oak by the recently-innovated FMM chlorophyll fluorometer. Acta Biologica Szegediensis (2011) 55(1) [16] C. Buschmann C, S. Lenk, H. K. Lichtenthaler: Reflectance spectra and images of green leaves with different tissue structure and chlorophyll content. Israel Journal of Plant Sciences (2012) 60(1-2) IF: [17] J. A. Dieleman, J. J. Magan, A. M. Wubs, A. Palloix, S. Lenk, C. Glasbey, F. A. Van Eeuwijk: Large scale phenotyping and data analysis of pepper genotypes in the EU-SPICY project. Acta Horticulturae (2012) 929 pp