PHD ÉRTEKEZÉS TÉZISEI GYÓGYSZERTECHNOLÓGIAI ANYAGOK ÉS CIKLODEXTRIN ZÁRVÁNYKOMPLEXEK VIZSGÁLATA HAGYOMÁNYOS ÉS KAPCSOLT TERMOANALITIKAI TECHNIKÁKKAL

Átírás

1 PHD ÉRTEKEZÉS TÉZISEI GYÓGYSZERTECHNOLÓGIAI ANYAGOK ÉS CIKLODEXTRIN ZÁRVÁNYKOMPLEXEK VIZSGÁLATA HAGYOMÁNYOS ÉS KAPCSOLT TERMOANALITIKAI TECHNIKÁKKAL KÉSZÍTETTE: ÉHEN ZSUZSANNA TÉMAVEZETŐ: DR. NOVÁK CSABA TUDOMÁNYOS FŐMUNKATÁRS BME, VEGYÉSZMÉRNÖKI KAR, ÁLTALÁNOS ÉS ANALITIKAI KÉMIA TANSZÉK 2006

2 1. Előzmények, célkitűzések A termoanalitikai méréstechnikák megbízhatóságuk és egyszerűségük révén gyakran alkalmazott módszerek a gyógyszeriparban. Ezek a technikák azonban nem szolgáltatnak információt a fűtés során eltávozó fragmensek minőségéről. Ez a hátrány kiküszöbölhető, ha a hagyományos termoanalitikai méréstechnikákat tömegspektrometriával, illetve Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópiával kombináljuk. Ezen szimultán technikák alkalmazása már lehetővé teszi a fragmentáció során képződő gázfázisú termékek azonosítását és a szolvátvesztés időbeli követését. Jelen keretek között egykomponensű minták és binér rendszerek termoanalitikai vizsgálatának eredményeit mutatom be. Az egykomponensű minták körében a torasemid hatóanyag, illetve natív és módosított ciklodextrinek termikus bomlását tanulmányoztam, binér rendszerekként pedig monoterpénciklodextrin zárványkomplexeket állítottam elő. A torasemid vízhajtó készítmények hatóanyaga. Két monotróp (mod. I és mod. II) és egy form A-val jelölt pszeudopolimorf módosulata ismert. Az A forma szerkezetében csatornákat tartalmaz, melyekben az előállítás következtében etanol és víz lehet. A torasemiddel végzett vizsgálatok elsődleges célja az volt, hogy kapcsolt termoanalitikai méréstechnikák segítségével írjam le az A forma bomlási viselkedését. A mérési eredményeket fűthető tárgyasztalú polarizációs és pásztázó elektronmikroszkópos felvételekkel támasztottam alá. A ciklodextrinek és komplexeik igen fontos és széles körben alkalmazott anyagok az élelmiszeripar, kozmetikai ipar, mezőgazdaság, illetve gyógyszeripar területén. Zárványkomplexek előállításával növelhető a stabilitás, az oldhatóság, befolyásolható a felszívódás vagy akár folyékony anyagokat is stabilis porokká alakíthatunk. Ez utóbbi lehetőség nagymértékben megkönnyíti a tárolást és kezelést, ami a feldolgozásnál nagy előnyt jelent. Ciklodextrinek jellemzésénél először α-, β- és γ-natív ciklodextrinek, valamint négy metilezett és három etilezett β-ciklodextrin származék termikus analízisét végeztem el. Célom a minták fragmentációs viselkedésének leírása, illetve összehasonlítása volt. 1

3 Binér rendszerek vizsgálatakor illékony anyagok*, monoterpén alkoholok és acetátok ciklodextrinekkel képzett zárványkomplexeit állítottam elő. A mintákkal szobahőmérsékleten tárolási kísérleteket indítottam. Célom az volt, hogy a hatóanyag-leadásról, a komplexek eltarthatóságáról és hőstabilitásáról szerezzek információkat és kifejlesszek egy olyan kísérleti eljárást, mellyel a zárványkomplexből kiszabaduló illékony komponensek követhetők. 2. Kísérleti módszerek Termoanalitikai technikák: hagyományos -fejlődő gáz analízis (EGA) Du Pont 916 Thermal Evolution Analyzer -termogravimetria (TG) TA Instruments 2050 TG kapcsolt -szimultán TG-(DTA)-MS (STD-MS) TA Instruments 2960 STD TG-DTA Balzers Thermostar GSD 300 T QMS -termogravimetria-fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia (TG-FTIR) TA Instruments 2050 TG BioRad Excalibur FTS 3000 FTIR Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) JEOL JSM-5500 LV Fűthető tárgyasztalú polarizációs mikroszkóp (HSM) Olympus BH-2, Kofler hot-stage Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) HPLC Merck Hitachi Interface D-7000 Merck Hitachi UV Detector L-7400 * A komplexált monoterpének nevének rövidítései: g / ga geraniol / geranil-acetát n / na nerol / neril-acetát c / ca citronellol / citronellil-acetát t / ta terpineol / terpinil-acetát 2

4 3. Eredmények Ismertettem a torasemid hatóanyag Form A pszeudo-polimorf kristálymódosulatának termikus bomlását. A keletkező fragmenseket FTIR és MS technikákkal azonosítottam. A minta szolvátvesztést, szilárd-szilárd módosulatváltást, olvadást és bomlást mutatott. A torasemid termikus viselkedése öt fő szakaszra bontható, melyeket az 1. táblázatban foglaltam össze. Fragmentálódása az 1. ábrán látható szerkezeti képleten követhető N NH O 64 S O 15 H N O H N ábra A torasemid molekulából keletkező fragmensek eredete 1. táblázat A torasemid bomlásának fő szakaszai 1. szakasz 2. szakasz 3. szakasz 4. szakasz 5. szakasz Idő /perc Hőmérséklet / C Tömegveszteség /% Jellemző H 2 O, m/e=18 H 2 O, m/e=18 H 2 O, m/e=18 H 2 O, m/e=18 H 2 O, m/e=18 fragmensek és a megfelelő m/e egységek EtOH, m/e= 46, 45, 43, 29, 28, 15 EtOH, m/e= 46, 45, 43, 29, 28, 15 TOR, m/e=58, TOR, m/e=58, TOR, m/e=64, 43, 28, 15 43, 28, 15 58, 43, 28, 15 Kristályforma Form A Mod. II amorf bomlás gázfázis 3

5 STD-MS technikával megállapítottam, hogy a módosított ciklodextrinek között a metilezett származékok nagyobb, míg az etilezett származékok kisebb termikus stabilitással rendelkeznek, mint a natív ciklodextrinek. A TG görbe alapján, a bomlási lépcső kezdetén mért hőmérséklet értékek figyelembe vételével az alábbi stabilitási sorrendeket állítottam fel: PMBCD < RAMEB < TRIMEB < DIMEB HEBCD < ETBCD <DIETBCD Az alkil szubsztituensek termikus stabilitásra gyakorolt hatásaként a metilezett származékok bomlása K-nel magasabban indul, mint az etilezett ciklodextrineké Megállapítottam, hogy a natív ciklodextrinek bomlása azonos és tömegspektrometriás viselkedése csak kevéssé tér el egymástól. A glükopiranóz egységek száma nem befolyásolja a tömegspektrometriás viselkedést. A keletkezett fragmenseket azonosítottam. 2. táblázat Az α-d-glükopiranóz bomlását jellemző fragmensek Fragmens OH 2 + m/e egység 18 CH 2 OH + 31 OHCH 2 CH + 44 OHCH 2 CH 2+ OC 6 H A kulcs fragmensek a 2. táblázatban látható 18, 22, 31, 44 m/e egységek. Ezen fragmensek között a 18-as m/e egység a ciklodextrin üregből távozó, illetve 300 C felett a cukoregységek bomlásából származó vízre utal, míg a többi m/e egység a glükopiranóz gyűrű fragmentálódására (2. ábra) vezethető vissza. Az STD-MS kapcsolt méréstechnika segítségével a natív és különböző módosított ciklodextrinek fragmentálódása megkülönböztethető egymástól. A jellemző fragmenseket a módosító szubsztituens szerkezete határozza meg. A termikus folyamat során a ciklodextrintől és a szubsztituenstől származó fragmensek nem rekombinálódnak. 2. ábra Az α-d-glükopiranóz fragmentálódása 4

6 Optimalizáltam a kevertetési időt aromaanyagok (monoterpén alkoholok és acetátok) természetes ciklodextrinekkel (α, β, γ) alkotott zárványkomplexeinek szuszpenziós technikával történő előállításához. Megállapítottam, hogy a hatóanyagtartalom a kevertetési idő függvényében maximumos görbe szerint változik. A mért és az elméleti hatóanyag-tartalom aránya / % Kevertetési idő / h A 3. ábráról leolvasható, hogy maximális hatóanyag-tartalommal rendelkező zárványkomplexek előállításához 4-5 óra kevertetési idő az optimális. A rendszer ennél hosszabb idejű kevertetésével is jellemzően 90% feletti hatóanyag-tartalom érhető el, azonban 4 óránál rövidebb idő alatt a komplexképződés nem teljes. 3. ábra A hatóanyag-tartalom alakulása a kevertetési idő függvényében Négy óránál hosszabb ideig kevertetve a rendszert számolnunk kell azzal, hogy a zárványkomplexek bizonyos hányada bomlásnak indulhat, hiszen eltérő mólarányú komplexek képződnek, melyek hőstabilitása is eltérő HPLC technikára módszert fejlesztettem ki a komplexek hatóanyag-tartalmának meghatározására, a vendégmolekulák UV elnyelése alapján. (RP-HPLC, eluens: metanol:víz (70-30), oszlop: Purospher Star LiChroCART 55-4 RP-18, endcapped, 3µm) EGA technika alkalmazásával megállapítottam, hogy az α-ciklodextrin komplexek tartalmazzák a legtöbb felületre adszorbeálódott hatóanyagot, vagyis a komplexálás részleges volt. Kimutattam, hogy a monoterpének komplexképzési hajlama γ-ciklodextrinnel a legerősebb, ezért γ-ciklodextrin komplexeknél szabad hatóanyag távozását nem észleltem. 5

7 Termikus stabilitás vizsgálatoknál valamennyi monoterpén-acetát és monoterpén alkohol esetében legstabilabbnak a γ-cd komplexeket találtam. 4. ábra Monoterpén-ciklodextrin zárványkomplexek hőstabilitása Az EGA készülék detektorát a hatóanyagra kalibrálva, a görbék alatti területek integrálásával kiszámítottam a fűtés hatására a zárványkomplexből felszabaduló hatóanyag mennyiségét. Az integrálással kapott hatóanyagtartalmakat a minták összes hatóanyagtartalmára vonatkoztattam és a hőmérséklet függvényében ábrázoltam. A 4. ábrán látható relatív hatóanyag-tartalom vs. hőmérséklet görbékről leolvasható, hogy adott hőmérséklet értékig a mintában lévő monoterpének hány százaléka távozik el. A 4. ábráról leolvasható, hogy az α-komplexek termikus stabilitása igen különböző lehet, de jellemzően már alacsonyabb hőmérsékleten is számottevő hatóanyag távozást mutatnak. A β-cd zárványkomplexek hőstabilitás görbéi két típusba sorolhatók. A geranilacetát-β-cd és neril-acetát-β-cd komplexek görbéje az inflexiós pont előtt konkáv, majd konvex (felülről nézve), míg a többi β-cd komplex görbéje ennek fordítottja. Legnagyobb termikus stabilitással a γ-komplexek rendelkeznek. A görbék lefutása ebben a csoportban mutatja a legnagyobb hasonlóságot. Megállapítottam, hogy a vizsgált monoterpén-cd komplexek hőstabilitása az α-cd < β-cd < γ-cd sorrendben növekszik. 6

8 Megállapítottam, hogy tárolás során a zárványkomplexek terpéntartalma az idő függvényében exponenciálisan csökkent. Az 5. ábra szemlélteti, hogy a változás főleg az α-, ritkábban a γ-cd komplexeknél volt jelentős. Eltarthatóság szempontjából tehát a β-cdnel való komplexálás az ideális, így biztosítható legtökéletesebben az illékony hatóanyag megtartása. 5. ábra Monoterpén-ciklodextrin komplexek hatóanyag-leadása Az STD-MS technikával készült felvételek segítségével megállapítottam, hogy a komplexálás a hatóanyagok párolgását befolyásolja, azonban azok fragmentálódását csak kevéssé változtatja meg. 7

9 Az MID felvételeken a hatóanyagokat szelektíven jellemző m/e egységek ionáram intenzitás görbéi alapján bizonyítottam, hogy a hatóanyag több lépésben, különböző hőstabilitású frakciókból távozik. Ezek a frakciók eltérő mólarányú komplexek keletkezésére utalnak. 4. Alkalmazási lehetőségek Az egykomponensű minták csoportjában a torasemid hatóanyagot, valamint a tablettázási segédanyagokként is használatos természetes és módosított ciklodextrineket tárgyaltam. Az eredmények a hagyományos és kapcsolt termoanalitikai méréstechnikák együttes, gyógyszeripari, kozmetikai-ipari alkalmazásának előnyeit példázzák. Monoterpén-ciklodextrin zárványkomplexek vizsgálatánál az STD-MS kapcsolt méréstechnika alkalmazása hatékony eszköznek bizonyult a komplexképződés igazolására, mivel segítségével mind a szabad, illetve gyengén kötött, mind pedig a zárványkomplexből magasabb hőmérsékleten távozó vendégmolekulák detektálhatók. Az illékony vendégmolekulákkal előállított ciklodextrin zárványkomplexek vizsgálati eredményei a komplexek ipari előállításánál és felhasználásánál alkalmazhatók, főként az élelmiszer- és kozmetikai ipar területén. 8

10 5. Publikációk Az értekezés témakörében született cikkek: Zs. Éhen, J. Rollinger, Cs. Novák, K. Marthi Thermal characterisation of torasemide using coupled techniques Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 73 (2003) 519 L. P. Fernandes, Zs. Éhen, T. F. Moura, Cs. Novák, J. Sztatisz Characterization of Lippia Sidoides oil extract cyclodextrin inclusion complexes using combined (TG-MS) thermoanalytical techniques Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 78 (2004) 557 Zs. Éhen, F. Giordano, J. Sztatisz, L. Jicsinszky, Cs. Novák Thermal characterization of natural and modified cyclodextrins using TG-MS technique Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 80 (2005) 419 Cs. Novák, Zs. Éhen, M. Fodor, L. Jicsinszky, J. Orgoványi Application of combined thermoanalytical techniques in the investigation of cyclodextrin inclusion complexes Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 84 (2006) 693 Cikkek, melyek nem az értekézés témakörébe tartoznak: Zs. Éhen, Cs. Novák, J. Sztatisz, O.Bene Thermal characterization of hair using TG-MS combined thermoanalytical technique Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 78 (2004) 427 D. Kiss, R. Zelkó, Cs. Novák, Zs. Éhen Compatibility and stability study of metronidazole and different pharmaceutical excipients Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 84 (2006) 447 S.F.M. Sinfronio, A.G. Souza, I.M.G. Santos, V.J. Fernandes Jr., Cs. Novák, Zs. Éhen Influence of H-ZSM-5, AL-MCM-41 and acid hybrid ZSM-5/MCM-41 on polyethylene decomposition Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 85 (2006) 693 A. de P. Martins, A. A. Craveiro, F. N. Raffin, T. F. Moura, Cs. Novák, Zs. Éhen Preparation and characterization of an inclusion complex between Mentha x villosa Hudson oil and β-cyclodextrin Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 88 (2007) 363 9

11 Önálló előadások: XXVI. Kémiai Előadói Napok Gyógyszerminták vizsgálata kapcsolt méréstechnikákkal (TG-FTIR, TG-MS) október , Szeged Analitikai Vegyészkonferencia (47. Spektrokémiai Vándorgyűlés és Bioanalitika Szimpózium) Ciklodextrinek és zárványkomplexeik termoanalitikai jellemzése június 30-július 2., Balatonföldvár II. Doktoráns Konferencia, BME Hagyományos és kapcsolt termoanalitikai technikák zárványkomplexek vizsgálatában november 24., Budapest III. Doktoráns Konferencia, BME Hajminták vizsgálata termoanalitikai méréstechnikákkal február 7., Budapest Társszerző előadásban: Cs. Novák, M. Zelenák, O. Bene, Zs. Éhen, A. Kovács, S. Gál Development a TG-MS method for the solid state characterization of drug samples 5 th Mediterranean Conference on Calorimetry and Thermal Analysis szeptember , Santiago de Compostela, Spanyolország Cs. Novák, K. Marthi, V.J. Fernandes, Zs. Éhen, A. Hegedűs, J. Szatisz, S. Gál TG-MS investigation of organic coumpounds CBRATEC III, Congresso Brazileiro de Análise Térmica e Calorimetria április 7-11., Pocos de Caldas - MG, Brazília Cs. Novák, Zs. Éhen: Application of thermal analysis in the pharmaceutical industry CBRATEC IV. Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria április , Pocos de Caldas - MG, Brazília Cs. Novák, Zs. Éhen, J. Sztatisz, S. Gál Application of combined thermoanalytical techniques in the pharmaceutical technology 30 th International Conference on Vacuum Microbalance Techniques június 29-július 1., Wroclaw, Lengyelország Cs. Novák, Zs. Éhen, V.J. Fernandes Jr, L.P. Fernandes, T.F. Moura, J. Sztatisz Application of Combined Thermoanalytical Techniques in the Investigation of Pharmaceuticals 7 th Mediterranean Conference on Calorimetry and Thermal Analysis július 2-6., Thesszaloniki, Görögország Cs. Novák, Zs. Éhen, J. Sztatisz, T.F. Moura, J. Orgoványi Possibilities and limits of the application of combined thermoanalytical techniques (TG-MS, TG-FTIR) in the thermal analysis of pharmaceuticals XVII. Conference on Thermal Analysis and Calorimetry október 2-5., Stara Lesna/Bratislava, Szlovákia 10

12 Cs. Novák, Zs. Éhen, G. Pokol, F.S.M. Sinfronio, V.J. Fernandes Jr., A.S. Araujo Application of TG-MS combined technique for direct monitoring the elaboration of entrapped guests from their cyclodextrin inclusion complexes CBRATEC V. Congresso Brasileiro de Análise Térmica e Calorimetria április 2-5., Pocos de Caldas - MG, Brazil Poszter bemutatók: Cs. Novák, O. Bene, Zs. Éhen, G. Pokol, F. Giordano, J. Sztatisz, S.Gál Thermal investigations of morphins and their derivatives in biological samples 6 th International Conference on Pharmacy and Applyed Physical Chemistry május , Ascona, Svájc Zs. Éhen, J.M. Rollinger, Cs. Novák, K. Marthi Investigation of the drug substance Torasemide using coupled thermoanalytical methods 7 th International Conference on Pharmacy and Applyed Physical Chemistry szeptember 7-11., Innsbruck, Ausztria Zs. Éhen, Cs. Novák Thermal characterization of cyclodextrins and their complexes using combined thermoanalytical techniques 13 rd International Congress on Thermal Analysis and Calorimetry szeptember , Chia Laguna, Szardínia, Olaszország Zs. Éhen, Cs. Novák, T.F. Moura, L.P. Fernandes Application of combined thermoanalytical techniques in the investigation of organic compounds 8 th International Conference on Pharmacy and Applyed Physical Chemistry szeptember , Ascona, Svájc Zs. Éhen, Cs. Novák Thermal characterization of hair using combined thermoanalytical techniques 7 th Mediterranean Conference on Calorimetry and Thermal Analysis július 2-6., Thesszaloniki, Görögország Zs. Éhen, Cs. Novák Following the escape of volatile compounds from their inclusion complexes 13 th International Cyclodextrin Symposium május , Torinó, Olaszország Cs. Novák, Zs. Éhen, L P. Fernandes, A. de P. Martins, R.N. Raffin, T. F. Moura Escape of volatile compounds from their cyclodextrin inclusion complexes 9 th European Symposium on Thermal Analysis and Calorimetry augusztus , Krakkó, Lengyelország 11