A pilokarpin epilepszia indukció elektrofiziológiai monitorozása NEC patkányokon

Átírás

1 A pilokarpin epilepszia indukció elektrofiziológiai monitorozása NEC patkányokon Diplomamunka biológus mesterszak Idegtudományok és Humánbiológia szakirány készítette: Cseri Barbara témavezető: DR. JUHÁSZ GÁBOR, tudományos tanácsadó ELTE TTK Proteomikai Csoport EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET Budapest, 2012.

2 1. Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék Rövidítésjegyzék Bevezetés A kérdés irodalmi háttere... 5 A status epilepticus... 6 A pilokarpin epilepszia modell... 7 Az alkalmazott elektrofiziológiai módszerek háttere... 8 A retinális kiváltott válasz... 9 A kérgi vizuális kiváltott válasz Oszcillatorikus potenciálok Az alkalmazott szövettani módszerek elméleti háttere A kutatási feladat rövid leírása A kísérletek módszerei Állatok Beépítés Mérések kivitelezése Kiértékelés Szövettani vizsgálat Eredmények Elektroretinogramok Vizuális kiváltott potenciálok Sötét neuronok kimutatása az agytörzsben Diszkusszió Következtetések és további vizsgálati lehetőségek További kísérleti tervek

3 8. Összefoglaló Abstract Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék

4 2. Rövidítésjegyzék ATP: adenozin-trifoszfát CGL: corpus geniculatum laterale EEG: elektroenkefalogram ERG: elektroretinogram (= retinális kiváltott válasz) ARAS: felszálló reticularis aktiváló rendszer (ascending reticular activating system) FR: formatio reticularis MPTA: mesopontin tegmental anaesthesia area NEC: Non-Epileptic Control Rats PnO: nucleus pontis (reticularis) oralis REM alvás: rapid-eye movement (gyors szemmozgásokkal kísért) alvás RTM: reticularis thalamus mag SE: status epilepticus TK: thalamocorticalis sejtek TLE: temporális lebeny epilepszia VKP: kérgi vizuális kiváltott potenciál (= kérgi vizuális kiváltott válasz) 3

5 3. Bevezetés Az idegrendszer működése során fiziológiásan és patológiásan is fellépnek szinkronizációs és deszinkronizációs folyamatok, amelyek alapvetően befolyásolják a hálózati működést. Ezeknek fontos szerep jut az információfeldolgozásban, különféle memóriafolyamatokban valamint a percepcióban, és meghatározhatják a rendszer általános állapotát. A szinkronizációt az elektroenkefalogram (EEG) segítségével követhetjük nyomon, mivel az EEG hullámok az idegsejtek szinkron működéséből, vagyis a kisülések és a szinaptikus potenciálok összegződéséből fakadó extracelluláris mezőpotenciálok. Ha az adott makroelektród környezetében az idegsejtek működése szinkronizált, akkor lassabb, nagyobb amplitúdójú hullámokat rögzíthetünk, deszinkronizáció esetén pedig nagyobb frekvenciájú és kisebb amplitúdójú hullámokat. A szinkronizáció felléphet egy adott agyterület neuronjai között (vagyis az egymáshoz térben relatíve közel lévő neuronok aktivitására vonatkoztatva), vagy egyes, egymástól távolabb elhelyezkedő agyi struktúrák között. Utóbbi esetben a jelenség a két terület működésének kapcsoltságát tükrözi. A fizikai távolság miatt a szinkronizáció lehet időben eltolt, de fázisosan mindig kapcsolt. Az egymástól távoli agyterületek fiziológiásan szinkron működése valószínűleg szerepet játszik a tudatos percepció kialakításában (Melloni és mtsai., 2007). Az idegrendszer egyes állapotaiban jellemző a szinkronizáció fokozódása. Ilyen például a lassú hullámú alvás. Deszinkronizáció, vagyis kérgi aktiválódás figyelhető meg ébrenlét alatt és REM (paradox) alvás során. Ezeket az állapotokat több subcorticalis struktúra befolyásolja, a legfontosabb ezek közül a felszálló reticularis aktiváló rendszer (ARAS), amely a nyúltvelő, a híd és a mesencephalon formatio reticularisából (FR) indul ki, modulatorikus hatását elsősorban monoaminerg és kolinerg vetületeken keresztül fejti ki (Moruzzi és Magoun, 1949). Meghatározó szerepű továbbá a kolinerg bazális előagy, a hypothalamus és a thalamus (Buzsáki és mtsai, 1988; Dringenberg és Vanderwolf, 1998; Lin és mtsai., 2011). Ezen rendszerek működése befolyásolja az alvás-ébrenléti ciklust és az általános kérgi aktivációt. Az egyik leggyakoribb kóros hiperszinkronizált állapot az epilepszia. Az epilepszia kutatás egyik fontos problémája a kóros hiperszinkronizáció generalizációjának feltérképezése, az egyes epilepsziás hullámformák megjelenésének mechanizmusát célzó vizsgálatokban. Az utóbbi években újra előtérbe került a szinkronizáció generalizálásában résztvevő agytörzsi folyamatok kutatása, amelyben laboratóriumunk több közleményt is publikált (Baracskay és mtsai, 2008; Baracskay és mtsai, 2009). 4

6 4. A kérdés irodalmi háttere Az epilepszia Az epilepszia az egyik legrégebben leírt, emellett leggyakoribb neurológiai betegség. Legfőbb jellemzői a rángó izommozgásokkal kísért, a tudatállapot bizonyos mértékű megváltozásával, esetleg teljes eszméletvesztéssel járó rohamok. Az epilepszia diagnózisának egyik kritériuma a rohamok spontán, rekurrens fellépése. A népesség 3-5%-a él át epilepsziás rohamot élete során, és mintegy 1%-a szenved valamilyen típusú aktív epilepsziában (Bell és Sander, 2002). A rohamok kialakulásának alapja az idegsejtek hiperexcitabilitása, amelynek hátterében a serkentés és gátlás egyensúlyának felborulása áll. Minden epilepszia típus közös vonása a rohamok megléte, amelyeknek hátterében a központi idegrendszer bizonyos idegsejt-populációinak kóros, hiperszinkronizált működése áll. A rohamok osztályozhatóak aszerint, hogy a kóros működés mely agyterület(ek)en alakul ki és mekkora területet érint, továbbá hogy az epileptikus működés átterjed-e mindkét agyféltekére. A konkrét epileptogén fókusszal rendelkező rohamokat fokális rohamnak nevezzük, a diffúz eredetűeket pedig generalizált rohamnak. A fokális epilepsziák másodlagosan generalizálódhatnak, ekkor a kóros hiperszinkronitás a fókuszból átterjed más agyterületekre, végül a corpus callosumon keresztül az ellenoldali féltekére is. Ez a folyamat többnyire ugyanazokon a pályákon és kapcsolatokon keresztül játszódik le, mint a fiziológiás kérgi aktivitás terjedése. Az epilepsziás roham az idegsejtekre excitotoxikus hatással van, mivel a sejtek anyagcseréje nem képes elégséges energiát termelni a membránpotenciál helyreállításához. Az epileptikus működésben érintett agyterületek struktúrája megváltozik, sejtelhalás és abnormális sejtkapcsolatok jöhetnek létre (Bernhardt és mtsai, 2009). Egységes kórkép helyett az epilepsziát mint betegségcsoportot kell kezelnünk, mivel a klinikai tünetek és a betegség megjelenési formái nagyon különbözőek, és a mögöttük álló patológiai elváltozások is igen nagy diverzitást mutatnak. Az egyes epilepszia szindrómák farmakológiai profilja is eltérő. Az egyik leggyakoribb epilepsziás kórkép a temporális lebeny epilepszia (TLE), amelyre a temporális lebenyben lévő fókusz(ok)ból kiinduló, komplex fokális rohamok jellemzőek. Ebből a típusból kerül ki a legtöbb, gyógyszeres kezelésnek ellenálló epilepszia is. 5

7 A status epilepticus A legkritikusabb epilepszás állapot a status epilepticus (SE), amely életveszélyes állapot, mivel ilyenkor prolongált vagy kis időközönként ismétlődő, folyamatosnak tekinthető rohamok lépnek fel a központi idegrendszerben, melyek között a páciensek nem nyerik vissza teljes mértékben a tudatukat. Ahány epilepszia típus létezik, annyiféle status epilepticus is megfigyelhető. Ez az állapot fokozottan excitotoxikus, hipoglikémiát és tartósan depolarizált membránpotenciált okoz, ami együttesen akut sejtkárosodáshoz vezet (Cavalheiro, 1995; Scorza és mtsai, 2008). A behatárolt agyterületre koncentrálódó rohamok során fellépő metabolikus stresszt és időleges oxigénhiányt az agyszövet maga képes kompenzálni. Generalizált rohamok során a hypothalamus aktiválódik és erős stressz-választ indukál a szimpatikus idegrendszeren keresztül, így a szisztémás reakcióval megnövelt vérnyomás és emelkedett szérum glükóz képes ellensúlyozni a központi idegrendszer epilepsziás működés során megnövekedett energia- és oxigénigényét. Ezek a mechanizmusok azonban elégtelenek prolongált rohamok esetén, így hipoxia, hipotenzió, hipoglikémia és savas ph alakul ki, amely végül a nagy energiájú foszfáttartalmú molekulák (ATP, kreatinin-foszfát) mennyiségének csökkenéséhez, így energiahiányhoz vezet. A kóros excitatorikus hatás miatt túlaktiválódó glutaminsav-receptorok nagymértékű intracelluláris Ca 2+ -szint emelkedést idéznek elő, amely kalciumfüggő sejtkárosító kaszkádokat aktiválhat. A fellépő lipidperoxidáció során szabadgyökök termelődnek, amelyek a sejt fehérjéit károsítva szintén sejthalált indukálhatnak (összefoglalóért ld. Kulak és mtsai., 2004). Mindemellett a szisztémás károsodás sem elhanyagolható: a status epilepticus során szívritmus-zavarok, tüdőödéma, izomsérülés és hipertermia alakulhat ki. Elmondható, hogy a konvulzív rohamokkal járó SE nagyobb kockázatot jelent, mint a nem-konvulzív generalizált SE. A jelenség során az EEG-ben szekvenciális változások figyelhetőek meg, amelyek a neurális működés megváltozásának megfelelően lépnek fel. Ezek a fokozatos lépések leírhatóak az úgynevezett Treiman-féle fázisok segítségével (Treiman, 1990). Öt fázis különböztethető meg. Az I. fázis során az EEG-ben különálló, generalizált tónusos-klónusos rohamok figyelhetőek meg, az interiktális tevékenység egyidejű lassulása mellett. A II. fázisban a diszkrét rohamok elkezdenek összemosódni az iktális kisülésekkel, míg a folyamatos iktális tüzeléssel jellemezhető III. stádium kialakul. A IV. fázisban kontinuus iktális kisülések figyelhetőek meg, melyek közé időnként platók, úgynevezett flatszakaszok ékelődnek. Az utolsó, V. fázisban periodikus kisülések láthatóak ellaposodott 6

8 háttérműködés mellett. Ezek a fázisok az állapot súlyosbodását is tükrözik, és a klinikumban a kezelés hatékonyságát is befolyásolja, hogy melyik stádiumban kerül rá sor (Wang és mtsai, 2009). A TLE epilepsziában kialakuló, tónusos-klónusos status epilepticus egyik, széles körben alkalmazott farmakológiai modellje az úgynevezett pilokarpin indukált epilepszia modell. A pilokarpin epilepszia modell A pilokarpin egy növényi eredetű alkaloid, amely erős muszkarin típusú acetilkolin receptor agonista hatással rendelkezik. Az acetilkolin több központi idegrendszeri folyamatban is szerepet játszik, mint például az éberségi szint szabályozása vagy a memóriafolyamatok (Drachman és Leavitt, 1974). Az agykéreg, a thalamus és hypothalamus egyaránt kap kolinerg vetületet (van de Kar és Lorens, 1979; Gu 2002). Ezek a régiók mind érintettek az epilepsziás roham kialakulásában. Az agytörzsi kolinerg pályák befolyásolják a thalamocorticalis sejtek (TK) és a reticularis thalamus mag (RTM) működését is. Ezen sejtek működése hatással van az alvás-ébrenléti állapotokra, valamint a thalamus szintjén történik meg a kéreg külső ingerektől való szétkapcsolása, vagyis a tudatos percepció csökkenése (Steriade, 2000). Ilyen korlátozott érzékelés áll fenn alvás és a tudatvesztéssel járó epilepsziás rohamok alatt is. 1. ábra. Kolinerg rendszerek az agyban: a bazális előagy és a tegmentum pontis területéről számos, diffúz vetület indul. A: amygdala; BM: nucleus basalis; DBh, DBv: diagonális köteg horizontális és vertikális magvai; Ha: nucleus habenularis; Hi: hippokampusz; IPN: interpeduncularis mag; LDT: laterodorzális tegmentális hídi kolinerg magcsoport; LH: laterális hypothalamus; MaPo: magnocelluláris preoptikus mag; MS: mediális septum; OB: szaglógumó; PPT: nucleus pedunculopontinus tegmentalis; RF: formatio reticularis; Th: thalamus; VTA: ventrális tegmentális área. Forrás: Kandel és mtsai.,

9 A pilokarpin az agytörzsi kolinerg rendszereken keresztül direkt úton indukál epilepsziás rohamot (Scremin és mtsai, 1998), azonban újabb kutatási eredmények alapján a periférián fellépő, elsődleges proinflammatorikus folyamatok is hozzájárulnak a folyamathoz (Vezzani, 2009). A pilokarpin perifériásan akut gyulladási folyamatokat indukál, amelyek végül a véragy gát permeabilitásának megnövekedéséhez vezetnek (Marchi és mtsai, 2007). Ennek eredménye az ioneloszlás megváltozása a központi idegrendszerben. Igazolt továbbá, hogy a pilokarpinra nézve a vér-agy gát kevéssé áteresztő, és in vitro rendszerben nem indukál epilepsziás rohamot az in vivo rendszerekben alkalmazott dózisban (Uva és mtsai, 2008). A Cavalheiro által leírt modell alapja, hogy patkányokban epilepsziás roham majd generalizált status epilepticus indukálható pilokarpin szisztémás alkalmazásával. Az első, akut fázis során az epilepsziás rohamokból progresszíven status epilepticus alakul ki. Ez a fázis legfeljebb 24 óráig tart, és az elektroenkefalogramban (EEG) megfigyelhető szekvenciális változások jellemzik. A második, úgynevezett csendes periódus alatt, melynek hossza igen széles keretek között változhat (néhány nap hónapok), az EEG és a viselkedés fokozatos normalizálódása figyelhető meg. Végül hosszú távon krónikus, a humán fokális epilepsziának megfeleltethető tulajdonságokkal rendelkező állapot, spontán visszatérő rohamokkal (Cavalheiro, 1995). Újabb eredmények szerint a spontán, rekurrens rohamok kialakulásához nem feltétlenül szükséges a status epilepticus kialakulása, habár ez esetben akár egy év is szükséges lehet a krónikus fázis eléréséhez (Mora és mtsai., 2009). Az alkalmazott elektrofiziológiai módszerek háttere Jelen kutatás során a pilokarpin modell akut fázisát monitoroztuk, kombinálva az EEG-t elektroretinogram (ERG) és vizuális kéregben kiváltott potenciálok (VKP) mérésével. A szenzoros kiváltott válaszok a humán diagnosztikában és a kísérletes munkákban is jelentős szerepet kapnak, mivel nem, vagy csak kevéssé invazívak, és segítségükkel nyomon követhető a központi idegrendszerben az információ feldolgozása, valamint annak változásai az idegrendszer különböző fiziológiás és patológiás állapotai során (Coenen, 1995). Az így kapott potenciálok extracelluláris mezőpotenciálok, vagyis az aktivált sejteken kialakuló lokális membránkonduktancia változások által előidézett áramok (ki- vagy befele irányuló ionáram) összegződését mérhetjük. Mint minden, makroelektróddal mért mezőpotenciál esetében, itt is igaz, hogy a kapott válaszok elősorban a folyamat időbeliségét tükrözik, az 8

10 egyes sejtek kisüléseivel való kapcsolatuk nem egyértelmű, mivel az akciós potenciálok a lokális mezőpotenciálok kialakításában csak igen kis mértékben vesznek részt. A vizuális kiváltott válaszok jellegzetes változásokon mennek keresztül például alvásébrenlét vagy absence epilepszia rohamok alatt (Galambos és mtsai, 1994; Meeren és mtsai., 1998), és különböző agyterületekről eredeztethető cerebrális diszfunkció esetében (Greenberg és mtsai., 1981). Diagnosztikai célzattal is felhasználhatóak például sclerosis multiplex vagy traumatikus kóma esetén (Guérit, 2005), valamint alkalmasak a terápia hatékonyságának követésére is. A látópálya különböző pontjain különféle fényingerrel kiváltott válaszok vezethetőek el. Az egyes válaszok karakterisztikája eltérő, az egyes hullámformák megváltozása jól jelzi a pálya adott szintjén bekövetkező kóros folyamatokat, valamint lehetővé teszi a rendszer fiziológiás állapotainak vizsgálatát. A leggyakrabban vizsgált területek a retina, a chiasma opticum, a corpus geniculatum laterale (CGL) valamint a vizuális kéreg. Ezek közül jelen vizsgálatban a retina és a cortex válaszokat használtam fel. A retinális kiváltott válasz A corneáról elvezethető, vagyis transzretinális elektroretinogramnak két legfontosabb komponense az a-hullám és a b-hullám (1. ábra). A komplex mezőpotenciált radiális irányú áramok alakítják ki, amelyeket a retina aktiválódó neuronjai, vagy a retinális gliasejtek működése hoz létre. A gliasejtek a neuronaktivitás miatt megváltozott extracelluláris káliumion-koncentrációra reagálnak. Mivel a retinában minden idegsejt fény által kiváltott áramokat hoz létre, a ERG-re elméletileg mindegyik sejt hatást gyakorolhat. A hatás mértékét több tényező is meghatározza. Az egyik a sejtek orientációja a szövetben. A radiálisan elrendeződött sejtek nagyobb mértékben járulnak hozzá a kialakuló potenciálhoz. Ilyen sejtek a fotoreceptorok, bipoláris sejtek, valamint a Müller-glia és a retinális pigment epitélium sejtjei. Az ingerlés módja és körülményei is meghatározóak (hullámhossz, háttérvilágítás, időtartam, stb.), például sötétadaptált mérések esetén a pálcika fotoreceptorok hangsúlyosabb szerepet kapnak. Diffúz, a teljes látótérre kiterjedő, villanó fényinger esetén a fotoreceptorok és a bipoláris sejtek válaszait rögzíthetjük, mivel az az aktivált sejtek számával arányosan növekszik. A ganglionsejtek ebben az esetben főképp a válasz késői szakaszainak kialakításában vesznek részt, elsősorban tartós ingerlés esetén. A gliasejtek aktivitása a neuronokéhoz képest késleltetetten jelenik meg, mivel a káliumion koncentráció változásai 9

11 50 V viszonylag lassabbak, így tartós inger esetén a gliasejt-válasz amplitúdója a neuronválaszénál nagyobb mértékben nő meg. b-hullám a-hullám 100 msec 2. ábra. Patkányból elvezetett elektroretinogram, feltüntetve a főbb hullámkomponenseket. A nyíl az ingeradást jelzi. Az a-hullám a fotoreceptorok disztális végénél keletkező, rövid latenciaidejű negatív hullám (Heckenlively és Arden, 1991). A b-hullám a klinikumban leggyakrabban vizsgált ERG komponens, amely általában nagy amplitúdójú, pozitív hullám. Létrejöttét a retina radiális gliasejtjei működésének tulajdonítják (Newman és Reichenbach, 1996). A vizuális percepció során a retina előfeldolgozott jeleket továbbít a chiasma opticumon és a CGL-n keresztül a vizuális kéreg irányába, ahol a látóérzet kialakul. Ugyanakkor a retina működését az agy képes szabályozni, mivel a dorzális raphemag szerotoninerg kimenetet ad a retinára (Lima és Urbina, 1997). A kérgi vizuális kiváltott válasz A vizuális kiváltott potenciálok a klinikai diagnosztikában széles körben használatosak, az agyi kognitív folyamatok követésére pedig kiterjedten alkalmazzák a kísérleti pszichológiában is. A retinából villanó fényingerrel kiváltott elektromos válasz a thalamus CGL magján keresztül érkezik a látókéregbe és itt az ingerület a felső dendritikus rétegben szinaptikusan áttevődik a nagy piramissejtekre. Ez a folyamat, és az aktivált interneuronok mezőpotenciáljai összegeződve alakítják ki a VKP egyes komponenseit (Kandel és Buzsáki, 1997). A kiváltott válasz komponenseit Creel munkája alapján osztjuk fel P (pozitív) és N (negatív) hullámokra, 10

12 50 V P1-től P3-ig és N1-től N3-ig (Creel, 1974). A VKP kiváltható gyors felfutású, intenzív fényvillanással, de kialakul a fény gyors megszűnésekor is ( off válasz). Az egyes hullámok latenciájuktól függően a primer beérkező ingerületet illetve ennek további feldolgozásának jeleit mutatják (Sannita, 2000). A primer hullámok latencia ideje rövidebb mint a retinogram b-hullámé, általában ms között van patkányban. Ezután 50, 100, 200 ms csúcslatenciával további hullámok figyelhetők meg, amelyek a kérgi feldolgozás egyes folyamatainak feleltethetőek meg (3. ábra). + N1 N2 N3 - P1 P2 100 msec 3. ábra. Patkány vizuális cortexről elvezetett kiváltott válasz, feltüntetve a főbb pozitív (P) és negatív (N) hullámkomponensek A nyíl az ingeradást jelzi. A VKP irodalma több tízezer közleményre tehető, amelyek összefoglalása meghaladja a jelen dolgozat kereteit. Összefoglalóért lásd az alábbi tankönyveket: Kandel és mtsai., 2000; Nicholls és mtsai, 2001; Heckenlively és Arden, Oszcillatorikus potenciálok Mind a retinális, mind a kérgi kiváltott válaszokra jellemző az úgynevezett oszcillatorikus potenciálok megjelenése. Ezek kis amplitúdójú, magas frekvenciájú (kb Hz) hullámok, amelyek a retinogram b-hullámának elszálló ágán a legszembetűnőbbek, de a CGL és a vizuális kéreg kiváltott válaszain is előfordulhatnak. Meglétük a kísérleti körülményektől és az egyedtől is függ. Amplitúdójuk a retina belső fonatos rétegében a legnagyobb, ahol a retinális ganglionsejtek dendritjei és a belső szemcsés réteg sejtjeinek nyúlványai találhatóak, 11

13 de pontos celluláris eredetük még nem ismert. Az oszcillatorikus potenciálok szinkronizálódása a látópálya állomásain valószínűleg az információ feldolgozását és a percepciót segíti az egyes agyterületek között (Melloni és mtsai., 2007). Az alkalmazott szövettani módszerek elméleti háttere Az epilepsziás roham alatti celluláris stressz miatt kollabáló, dark, vagyis sötét neuronok alakulnak ki. Ezeknél a sejteknél jellemző ultrastrukturális változások következnek be, a sejtszerkezet kompaktálódása figyelhető meg. A változás hátterében valószínűleg a szóma és a dendritek területén bekövetkező, ion-víz-fehérje egyensúly megváltozása áll (Gallyas és mtsai., 2004; Gallyas, 2007). Hasonló változások a sejtek axonjaiban is kimutathatóak. Érdemes kiemelni azt a jelenséget, hogy a dark neuronok nem apoptotikus vagy nekrotikus sejtek, hanem a képződésük utáni körülményektől függően elpusztuló vagy funkciójukat újra visszanyerő neuronok (Gallyas és mtsai., 2006a; Kövesdi és mtsai., 2007). A sejteket Gallyas-féle ezüstözéssel mutattuk ki. Ez a festési módszer specifikus a sötét neuronokra. A generalizált rohamok alatt számos agyterületen kimutathatóak ilyen sejtek, mint például az agykéreg, a thalamus és a hippocampus. Jelen vizsgálat során a sötét sejtek kimutatásával az agytörzsi érintettséget kívántuk igazolni, így elsősorban ezt a területet vizsgáltuk. A hídi FR-ban a dark neuronok kialakulása laboratóriumunk korábbi eredményei alapján össszefüggést mutat a rohamok generalizációjával, és más módon kiváltott status epilepticus alatt is kimutatható (Baracskay és mtsai., 2008; Baracskay és mtsai., 2009). Ezen a területen szelektíven kollabálnak a nucleus pontis oralis (PnO) gigantocelluláris részének glutamáterg sejtjei, amelyek a kéreg általános aktiválásában játszanak szerepet a thalamusban végződő dorzális és a hypothalamusban, valamint a bazális előagyban végződő ventrális pályán keresztül. Az FR sejtjei többféle felszálló, szomatikus és viszcerális ingerületet is kapnak, ezeknek az aktiváló hatását közvetítik a felsőbb rendszerek felé és hozzák létre az éber állapotot (Moruzzi és Magoun, 1949). Ugyanakkor képesek egy endogén, önfenntartó mechanizmus révén külső ingerek nélkül is létrehozni az aktivációt (Stiller és Postolache, 2005). A formatio reticularis aktivitása éber állapotban és paradox (REM) alvás alatt a legnagyobb. 5. A kutatási feladat rövid leírása 12

14 A jelen kísérleti munka a pilokarpin epilepszia modell felhasználásával olyan elektrofiziológiai paramétereket kíván feltárni, amelyek segítségével a szinkronitás terjedése objektíven követhető. A laboratóriumunkban kifejlesztett, szabadon mozgó állatokon folyó vizuális agykérgi kiváltott válasz és retinográfiás mérésre alkalmas preparátum felhasználása az epilepszia követésére több szempontból is kézenfekvő volt: 1. A preparátum nagyon robosztus és reprodukálható, széles körben publikált és már több laboratóriumban is bevezetett módszer (Galambos és Juhász, 1997; Salfay-Szabó és mtsai., 2001). 2. A látórendszerben kiváltott szinkron aktivitás epileptogén is lehet (fotogén epilepszia). 3. A vizuális válaszok agytörzsi kontrollját laboratóriumunk és más kutatóhelyek is kutatták. A retina agytörzsi beidegzése alkalmas a rohamok retina felé való közvetítésére. Az alkalmazott szövettani festés alkalmas az agytörzsi érintettség kimutatására. 4. A vizuális kiváltott válaszok emberen is jól mérhetők és távlatilag felhasználhatóak lehetnek diagnosztikai célra is. Munkám során arra kerestük a választ, hogy a szenzoros kiváltott válaszok változása epilepszia genezise során követik-e az epilepszia stádiumainak változását. Célunk tehát az epileptogenezis követése volt a vizuális kiváltott válaszok analízisével. 6. A kísérletek módszerei Állatok A kísérletben 10 darab NEC (Non-Epileptic Control) patkányt használtunk fel, amelyek a GAERS (Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg) patkánytörzs beltenyésztett kontroll állatai. Ezek az állatok spontán epilepsziás aktivitást soha nem mutatnak. Az állatokat órás sötét-világos ciklusban tartottuk, korlátlan víz- és táplálék hozzáférés mellett. A patkányokat a Szabó-Salfay és mtsai. szerint leírt krónikus modell alapján építettük be, amely lehetővé teszi ERG, EEG és vizuális kiváltott potenciálok egyidejű regisztrálását szabadon mozgó állatokban (Szabó-Salfay és mtsai., 2001). A felhasznált állatok súlya gramm közötti volt. 13

15 Beépítés Az Isofurane-nal altatott állatok fejtetői bőrén egy mediansaggitalis metszést ejtettünk, a sebet kiszélesítettük, a koponyacsontot 5 %-os hidrogénperoxiddal megtisztítottuk, majd a koponyacsont megfelelő helyeken történő átfúrása után 0,8 mm-es, rozsdamentes acélcsavarokat (elektródimpedancia: 3-4 kω) csavaroztunk be az alábbi területek fölé mindkét oldalon (epidurális csavarelektródok): parietális kéreg (AP: -4.5 L: ± 3.5), vizuális kéreg (AP: -7.0, L: ± 3.0), valamint a kisagy (AP: -12.0, L: ±3.5). A VKP kiváltására felvillanó fényingereket alkalmaztunk, amelyet egy beépített transzparens, 5 mm átmérőjű, 8 mm hosszú, LED szolgáltatott (Bright Led Inc. Hong-Kong). A dióda lábait egy csatlakozóhoz forrasztottuk. A fényinger retrobulbárisan érte el a retinát, így a szemgolyó irányultságától és a szemhéj pozíciójától független volt az ingerlés. Vörös fényű diódát használtunk, mivel más színű fény csak nehezen terjed a szöveteken keresztül a bennük található hemoglobin miatt. Az elektroretinogram regisztrálásához a cornea és a felső szemhéj közé egy hét-eres, teflonbevonatú, rozsdamentes acél elektródot helyeztünk (316SS7/44T; Medwire, Mont Vernon, NY, USA, elektródimpedancia: 4-5 kω). Az elektród hegyéről előzetesen 2-3 mm hosszan eltávolítottuk a szigetelést, majd a fonatot képező szálakat fésűszerűen szétnyitottuk, így beültetés után az elektród ráfeküdt a szaruhártya felületére. Az elektródokat egy tüskesor lábaihoz forrasztottuk, majd az egészet fogorvosi akrilát cementtel vettük körbe. Ugyancsak fogorvosi cementtel erősítettük a csatlakozóhoz, illetve a koponyacsonthoz közvetlenül a bal szem fölött a fénykibocsátó diódát. Referenciaelektródként a kiváltott válaszok esetén egy plate elektródot használtunk, amely a bőr, illetve a rágóizom közé elhelyezett, sebkapocsból levágott, 3 4 mm-es rozsdamentes acél lapocska volt, műanyag szigeteléssel ellátott rézdróthoz forrasztva, és (a bőr felé eső részén egy ablakocskát kivéve) fogászati cementtel körbevéve. Az EEG felvételek során a referenciaként a kisagyi csavarelektród szolgált. 14

16 4. ábra Az alkalmazott beépítés fényképe. A: cornea elektród B: LED D: corticalis elektródok. Forrás: Szabó-Salfay és mtsai., 2001 Mérések kivitelezése Az ingerlést Supertech Bio-Stim típusú, LED adapterrel felszerelt ingerlővel végeztük, 5 milliszekundumos ciklusidővel és 0,3 milliszekundum ingerszélességgel, amelyet CED 1401 vezérelt. Az állatokat a mérések idejére egy Faraday-kalitkában elhelyezett fémdobozba helyeztük, és a mérések előtt 20 percig zaj- és fénymentesen sötétadaptáltuk őket. Minden állatból a műtét után néhány nappal (2-7) mértünk kontroll EEG és VKP felvételeket, majd intraperitoneális pilokarpin kezelésnek vetettük őket alá. A pilokarpin dozírozását 320 mg/testtömeg kilogrammos dózissal kezdtük, amelyet 1 ml ACSF-ben oldottunk fel. A beadás két részletben történt, 0,5 0,5 milliliterenként. Amennyiben az első beadás után 20 percen keresztül nem tapasztaltunk határozott változást az EEG-ben vagy az állat viselkedésében, beadtuk a második dózist is. Amennyiben ez sem váltott ki epilepsziás rohamot, további mg pilokarpint (az állat testsúlyának függvényében) adagoltunk - amelyet szintén 1 ml ACSF-ben oldottunk fel - legfeljebb 3 alkalommal. Azért alkalmaztunk fokozatos adagolást, mert a pilokarpin epilepszia modellben az állatok mortalitási rátája igen magas. A mérések során szekundum hosszan EEG-t vettünk fel, majd vizuális kiváltott potenciálokat ( darabot, a válaszok átlagolhatóságának függvényében). Amennyiben az EEG-n 15

17 markáns változásokat láttunk, amelyek az egyes Treiman-fázisok közti váltást jelezték, az eltelt időtől függetlenül felvettük VKP-okat is. A mérések során előfordultak olyan állatok is, amelyekben nem alakult ki epilepsziás roham és status sem. Ezekben az esetekben a mérés napja után még egy héten keresztül monitoroztuk az állatokat, naponta két szekundum időtartamú EEG és darab vizuális kiváltott válasz rögzítésével. A mérések után az állatok agyát 4%-os paraformaldehiddel perfundáltuk, a későbbi szövettani vizsgálatok érdekében. A perfúzió előtt az állatokat uretán i.p. alkalmazásával túlaltattuk. Kiértékelés A corticális EEG jeleket CED1401 adatgyűjtőn keresztül, a Spike2 szoftver segítségével digitalizáltuk, a corticális kiváltott potenciálokat és az ERG-ot pedig a Signal szoftverrel. Az adatok kiértékelését a fenti programok mellett az OriginPro8 szoftver segítségével végeztük el. A teljesítmény spektrum denzitás diagramokat Neuroexplorer szoftverrel készítettük. A kiváltott válaszok kiértékelésénél a primer negatív hullám latenciáját és amplitúdóját használtuk fel, az elektroretinogram esetében pedig a pozitív b-hullám ugyanezen értékeit. Latencia alatt az adott hullám maximális amplitúdójának eléréséhez szükséges időintervallumot értjük (az ingerlés időpontját véve nullpontnak), amplitúdón pedig a jel maximális különbségét adott időtartamon belül. Kiváltott válasz esetén ez a 0,002 0,008 szekundum közti intervallum az ingerlés után, vagyis a primer pozitív és a szekunder negatív hullám csúcsainak különbsége. Elektroretinogram esetén pedig a 0 0,1 szekundum közötti időtartam, amely az a-hullám és a b-hullám csúcsai közti különbséget jelenti. Az idősávokat úgy választottuk meg, hogy azok minden mérésnél magukba foglalják a vizsgált hullámkomponenst. Minden esetben a szoftver segítségével átlagolt kiváltott potenciálokat használtuk fel egy-egy állatból. A statisztikai elemzés során a viszonylag kis elemszám (VKP esetén N = 4, Treiman-V fázisban N = 3) miatt lineáris regresszióval ellenőriztük, megfelel-e a minták eloszlása a normál eloszlásnak. Miután igazoltuk, hogy a minták eloszlása megfelelő, kétmintás t- próbával vizsgáltuk meg az egyes állapotok eltéréseit a kontroll állapothoz képest. Az elektroretinogram esetében nem végeztünk t-próbát, mivel itt csak 2 állatból nyert adatunk volt. 16

18 Szövettani vizsgálat A paraformaldehidben tárolt agyakból fagyasztva metszéssel 60 µm vastagságú metszeteket készítettünk. A későbbiekben ezeket Gallyas-féle ezüstözéssel festettük. Ennek során a metszeteket 16 órán keresztül 56 C-on észterifikáló oldatban (1.2% kénsav 1- propanolban) inkubáltuk. Ez után 3%-os ecetsavval kezeltük a metszeteket 6 percig, majd a fizikai előhívó sziliko-wolframsav oldatba áztattuk őket, amíg megfelelő, barnás-sárga színűek lettek. A reakciót 30 perces ecetsavas utómosással állítottuk le. A metszeteket végül propanolsorban dehidráltuk, tárgylemezre húztuk és DePex műgyantába ágyaztuk, majd lefedtük. 7. Eredmények Az EEG felvételeket a Treiman-fázisok azonosítására használtuk fel. Később az elemzés során ezek alapján kategorizáltuk a VKP-okat. 10 állatból 4-nél alakult ki status epilepticus. Ezek közül az egyik igen hamar elpusztult, még a Treiman-V fázis elérése előtt, és elemezésre alkalmas elektroretinogramot 2 állatból regisztráltunk. A kontroll állapotot (beadás előtt) a Treiman-II, Treiman-IV és a Treiman-V stádiummal hasonlítottuk össze. Az első stádiumban az erőteljes motoros rohamok és iktális kisülések miatt nem kaptunk kiértékelhető corticalis jeleket, ezekben a fázisokban a VKP nem volt beazonosítható. A harmadik stádium többnyire nem volt diszkréten elkülöníthető a második és negyedik stádiumtól, így ezt a fázist sem használtuk fel végül. Az 5. ábrán a végül felhasznált Treiman-stádiumok jellemző EEG-je látható. Kontroll (parietalis) 100 V 1 sec Treiman-II. (parietalis) 100 V 1 sec 17

19 Treiman - IV. (parietalis) 100 V 1 sec Treiman-V. (parietalis) 100 V 1 sec 5. ábra. A felhasznált Treiman-féle fázisok alatt patkány agykérgéről elvezethető EEG Az epilepsziás rohamot és status epilepticust nem mutató állatokat is a mérés során háromöt órán keresztül monitoroztuk, rögzítve a vizuális kiváltott válaszokat és az elektroenkefalogramot. Status epilepticus hiányában jellemző volt a perzisztens corticalis theta-ritmus kialakulása (6. ábra), amelyet az EEG felvételek utólagos teljesítmény spektrum denzitás elemzése is alátámasztott (7. ábra). Bizonyos esetekben epileptikus tüskék és hiperszinkronitás is megfigyelhetőek voltak. A pilokarpinos beavatkozás után egy héten keresztül utólagos kontrollméréseket végeztük ezeken az állatokon (naponta 20 perc EEG és vizuális kiváltott potenciált rögzítve). A theta-ritmus fokozott megjelenése még 4 nappal a kezelés után is megfigyelhető volt. 50 V 1 sec occipitalis 6. ábra. Theta-ritmus megjelenése patkány corticalis EEG-n pilokarpin kezelés után. 18

20 7. ábra. Teljesítmény spektum sűrűség diagramok egy állat EEG-jéről. A diagramok sec időtartamú felvételek alapján készültek, az occipitalis elvezetésről. Elektroretinogramok Az ERG-ben a válasz sem a IV., sem az V. stádiumban nem szűnt meg, bár a jel szélessége láthatóan csökkent (8. ábra). A hiperszinkronitás növekedésével (vagyis az epilepsziafázisok előrehaladtával) a jelszélesség csökken, míg az amplitúdó megnő (9. ábra). A maximális növekedés a második fázisban látható, majd, ahogyan az EEG-ben egyre gyakrabban megjelennek flat-szakaszok, ismét csökken. A latencia értékekben nem figyelhető meg változás (10. ábra). Kontroll Treiman-II. Treiman-IV. Treiman-V. 50 V 50 ms 8. ábra. Kontroll, valamint az elemzett Treimann-fázisok alatt patkányból elvezethető, digitálisan átlagolt elektroretinogramok. 19

21 50 V Latencia (sec) Latencia (sec) Kontroll% Kontroll% kontroll TrII TrIV TRV kontroll 1h 3h 5h 9. ábra. Az ERG b-hullám amplitúdóinak változásai a kontroll %-ában. Bal oldalt status epilepticus alatt, jobb oldalt annak hiányában mért adatok. (TR = Treiman fázis). Feltüntetve az átlagok és a standard deviáció. 0 0,10 0,10 0,08 0,08 0,06 0,06 0,04 0,04 0,02 0,02 0,00 kontroll TrII TrIV TrV kontroll 1h 3h 5h 10. ábra. A b-hullám ingerléstől számított csúcslatenciája. Jobb oldalt status epilepticus kialakulása nélkül, bal oldalt status epilepticus alatt mért adatok láthatóak (TR = Treiman-fázis). Feltüntetve az átlagok és a standard deviáció. 0,00 Vizuális kiváltott potenciálok kontroll TrII TrIV TrV 100 msec 11. ábra. Kontroll, valamint az elemzett Treimann-féle fázisok alatt mért, a kéregről elvezethető, digitálisan átlagolt vizuális kiváltott potenciálok. 20

22 Latencia (sec) Latencia (sec) Kontroll% Kontroll% A VKP-kat összehasonlítva látható, hogy a válasz komponensei (különös tekintettel az amplitúdó és a válasz szélesség értékekre) karakterisztikusan megváltoztak (11. ábra). Összehasonlítva a Treiman-fázisokat, látható, hogy a kiváltott válaszok az egyes stádiumoknak megfelelően alakulnak át. A Treiman-féle fázisok előrehaladtával párhuzamosan az amplitúdó növekszik, majd az V. fázisra ismét csökken. A latencia értékekben ezen adatok alapján nem figyelhető meg eltérés (13. ábra). Megfigyelhető továbbá a szekunder és tercier hullámkomponensek eltűnése a Treiman-V. fázisban. 250 *** kontroll TrII TrIV TrV kontroll 1h 3h 5h 12. ábra. Az N1-P1 komplex amplitúdó változásai a kontroll %-ában. Feltüntetve a változások átlagai és a standard deviancia (SD). Jobb oldalt status epilepticus kialakulása nélkül, bal oldalt status epilepticus alatt mért adatok láthatóak. Tr = Treiman-fázis. 1h, 3h, 5h: a teljes pilokarpin dózis beadása után 1, 3 és 5 órával mért adatok. ***: p < 0, ,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,10 0,08 0,08 0,06 0,06 0,04 0,04 0,02 0,00 kontroll TrII TrIV TrV 0,02 0,00 kontroll 1h 3h 13. ábra. A P1 hullám csúcslatencia átlagának változásai. Feltüntetve az átlagok és a SD. Tr = Treiman-fázis. 1h és 3h: a teljes pilokarpin dózis beadása után 1 és 3 órával mért adatok. Sötét neuronok kimutatása az agytörzsben Mint azt laboratóriumunk korábbi eredményei is igazolták, az epilepszia generalizációjával 21

23 caudalis rostralis párhuzamosan sötét sejtek jelennek meg az agytörzs struktúráiban. Az agytörzsi érintettséget a pilokarpin epilepszia modellben is igazolni tudtuk dark neuronok kimutatásával a híd területén. Az alább látható kép reprezentatív jellegű. Megfigyelhető, hogy a nucleus pontis oralis területén a gigantocelluláris rész sejtjei szelektíven váltak sötét sejtté. 14. ábra. Sötét sejtek Treiman-V fázis elérése után perfundált patkány agytörzsében, a nucleus pontis reticularis területén. Sagittalis metszet. µm

24 7. Diszkusszió Kísérleti eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a vizuális rendszer kiváltott válaszai a retina és a kéreg szintjén egyaránt megváltoztak az epilepsziás aktivitás egyes stádiumaiban. A változások jól reprodukálhatók és alkalmasak lehetnek az epilepszia fázisok jellemzésére. A megfigyelt változások oka nem a rohamok által okozott műtermékek megjelenése, hanem a rohamok által okozott hiperszinkronizáció jelenléte volt, hiszen az erősen mozgási artefaktumos egyedi görbéket kizártuk az átlagolásból. A retinogram megváltozása valószínűleg a raphe dorzalisból kiinduló retinalis efferenseknek köszönhető (Villar és mtsai., 1987; Reperant és mtsai., 2000). Bár ezek száma patkányban meglehetősen kevés (csupán 10 rost retinánként), hatékonyságuk igen nagy (Lőrincz és mtsai, 2008). A kérgi válaszok megváltozása a kéreg hiperszinkron aktivitásának illetve a kolinerg hatású pilokarpin kezelésnek tulajdonítható. Azonban meg kell jegyezni, hogy a pilokarpin direkt kolinerg hatása nem igazán jelentős, hiszen a válaszok jobban tükrözték az EEG alapján megállapítható epilepsziás stádiumokat mint a pilokarpin mennyiségét, amit az ismételt adagoláskor jól megfigyelhettünk. Feltételezhető továbbá az agytörzsi aktiváló rendszer szerepe. Azokban az állatokban, amelyekben a teljes pilokarpin dózis alkalmazása után sem alakult ki status epilepticus, perzisztens theta-ritmus volt megfigyelhető. Krónikusan epilepsziás patkányokban leírták, hogy a kéreg hippocampalis theta-aktivációja során nagy mértékben lecsökken az epilepsziás kisülések száma, függetlenül attól, milyen hatásra alakul ki a thetaritmus. Kimutatható, hogy a krónikusan epilepsziás állatokban a theta ritmus némileg eltér a kontroll állatokétól mind frekvenciájában, mint amplitúdójában. Epilepszás állatokban a septum ritmikusan tüzelő sejtjeinek aktivitási frekvenciája magasabb, és a magas frekvenciával tüzelő sejtek aktivitása időben összefügg a hippocampusban regisztrálható, epileptiform kisülésekkel (Colom és mtsai., 2006). A septum GABAerg neuronjai fokozottan érzékenyek az epilepsziás aktivitás okozta sérülésekre, és a pilokarpin epilepszia modell krónikus fázisában működésük megváltozik, vagyis diszfunkcionális septo-hippocampalis hálózat alakul ki (García-Hernández, 2010). A tüskéspatkányfélék családjába tartozó Proechimys guyannensis esetében kimutatták, hogy a pilokarpin-indukált krónikus epilepsziára rezisztens faj, amelynek hippocampusa immunhisztokémiai és szövettani számos jellegzetességében eltér a laboratóriumi patkányétól. Pilokarpin-kezelt példányaiban nem figyelhető meg a laboratóriumi patkányokban fellépő hippocampalis sejtpusztulás, ugyanakkor markáns változások láthatóak olyan biokémiai markereknél, mint a glutaminsav- 23

25 dekarboxiláz, kalbindin és kalretinin (Fabene és mtsai., 2001). Mivel az általunk modellként használt NEC (Non-Epileptic Control Rats) törzs beltenyésztett, amelyet arra szelektáltak, hogy spontán epilepsziás aktivitás soha ne legyen megfigyelhető az agyban, felmerül a lehetőség, hogy ezekben az állatokban is kialakult egyfajta rezisztencia az epilepszia ellen. Ez állhat annak a hátterében, hogy méréseink alatt meglehetősen sok állatnál nem alakult ki tónusos-klónusos epilepsziás roham. A hídi FR-ban a PnO glutamáterg sejtjeinek szelektív kiesése figyelhető meg az V. fázis elérése után. Az V. fázist igen lassú, sztereotip, izoelektromos szakaszokból és ritmikus tüskékből δ-ritmusú EEG jellemzi, amely generalizált status epilepticus alatt patkányokban is kialakul. Ugyanilyen jellegű EEG vezethető el például mély anesztézia vagy traumatikus, agytörzsi kóma-állapotok során. A PnO érintettségét agytörzsi stroke után bekövetkező vegetatív állapotban vagy kómában humán vizsgálatokban is igazolták (Parvizi és Damasio, 2003). Ugyanezt az agyterületet egyes kutatók MPTA ( mesopontin tegmental anesthesia area) néven írják le, mivel kétoldali pentobarbital injektálásával erre a területre reverzibilis analgéziát, atóniát és tudatvesztést okoz δ-ritmusú, lassú EEG hullámok kíséretében (Devor és Zalkind, 2001; Abulafia és mtsai, 2009). Generalizált konvulzív epilepsziában emberekben kimutatták az agytörzs aktivitásának megváltozását, valamint igazolták a ventrális agytörzs kiterjedt aktivációját generalizált epilepsziás páciensekben az interiktális epileptiform kisülések alatt (Kohsaka és mtsai., 2001; 2002). A PnO gigantocelluláris neuronjai valószínűleg meghatározó szerepet játszanak a δ-ritmus kialakításában, mégpedig úgy, hogy működésük kiesésével a kérgi aktiváció lecsökken (Baracskay 2009). Képalkotó vizsgálatokkal és neurofiziológia vizsgálatokkal egyaránt megállapították, hogy a generalizált epilepsziás rohamok alatt a kétoldali thalamus és a felső agytörzs érintettsége miatt a frontoparietális területek asszociatív körei szétesnek, ami a tudatos percepció megváltozásához vezet (összefoglaló: Cavanna és Monaco, 2009). Norden és Blumenfeld hálózati gátlás elmélete szerint a kéregben kialakuló epileptikus aktivitás kéreg alatti régiókra átterjedve meggátolja, hogy azok kifejtsék normális aktiváló hatásukat, így a frontális és parietális asszociatív kéreg nem-epileptikus régiói másodlagosan gátolt állapotba kerülnek (Norden és Blumenfeld, 2002). Méréseink során megfigyelhető volt, hogy a korai Treiman-fázisokban az amplitúdó növekedése figyelhető meg, amelynek hátterében az epilepsziás aktivitás ARAS-re való átterjedése állhat. Az agytörzs magas frekvenciás ingerlésével kiváltható kérgi aktivációhoz hasonlóan, ezen fázisok alatt az iktális, fokozott aktivitás nagyobb amplitúdójú kérgi válaszokat eredményez. Ez mind a primer, mind a szekunder komponensekre igaz. 24

26 Az V. fázisban megfigyelhető, hogy a kérgi válaszok primer komponense megmarad, bár amplitúdója nagy mértékben lecsökken, viszont a közepes és késői hullámkomponensek gyakorlatilag eltűnnek. Ezek nagy valószínűséggel a corticocorticalis körökben történő információfeldolgozásnak és kérgi asszociatív működésnek feleltethetőek meg. Vagyis a status epilepticus késői fázisaiban a szenzoros bemenetek elérik a vizuális kérget (mivel mind az elektroretinogram, mind a kérgi válasz primer komponense megmarad), azonban a kérgi percepciós folyamatok zavart szenvednek. A generalizált epilepszia során kialakuló hiperszinkron állapot során azért szűnik meg a percepció, mert a résztvevő thalamocorticalis neuronkörök működése ebben az állapotban sztereotipizált (Hudetz és Imas, 2007; Alkire és mtsai., 2008). Ez az állapot megfeleltethető az anesztézia és a kóma során is fellépő, nem reaktív állapotnak, amely során az információ kérgi integrációja zavart szenved. Ehhez az szükséges, hogy az ebben szereplő neuronkörök működése akadályozva legyen, amelyhez nem feltétlenül szükséges az alacsony neurális aktivitás (összefoglaló: Alkire és mtsai., 2008). Anesztézia alatt is megfigyelhetőek úgynevezett hiperszenzitív állapotok, amely során akár küszöb alatti ingerekkel is kiterjedt agyi aktivitás váltható ki (Kroeger és Amzica, 2007; Hudetz és Imas, 2007). Ezt az állapotot burst supression állapotnak nevezik, mivel az inger hatására bekövetkező, hirtelen, nagyfokú aktivitást ( burst ) szuppresszált, refrakter periódusok követik. A sötét sejtek kialakulása felfogható a központi idegrendszer egyfajta védekező mechanizmusaként is. Status epilepticus alatt hosszan fennálló, túlzott serkentő hatások érik a sejtet, amelyek erősen károsítják és akár sejthalálhoz is vezethetnek. A sötét neuronok funkcionálisan kiesnek a hálózatból, egyfajta reset állapotba kerülnek, amely lehetővé teszi a későbbi helyreállást is (Gallyas és mtsai., 2008). Következtetések és további vizsgálati lehetőségek 1. Kísérleteink igazolták, hogy a vizuális rendszer kiváltott válaszai korrelálnak az epilepszia egyes stádiumaival és ezért diagnosztikai értékük lehet. 2. A retinogram változása a raphe dorzalis és az agytörzs jelentős szerepére utal a pilokarpin epilepsziában. Az agytörzsi érintettséget a szövettani festéssel kimutatott dark neuronok is igazolják. 25

27 3. A fokozottan megjelenő theta aktivitás feltehetőleg roham gátló hatású (Colom és mtsai., 2006; García-Hernández és mtsai., 2010) 4. A méréseket ki kell egészíteni a retina ganglionsejt kimenetének, a chiasma opticum válaszok mérésével, hiszen az efferensek pont a ganglion sejteken fejtik ki hatásukat. 5. A retinogram és a kérgi kiváltott válasz oszcillatorikus potenciáljainak további vizsgálatával felderíthető a két terület működésének kapcsoltsága és a vizuális percepció működése az egyes fiziológiás és patológiás állapotokban. További kísérleti tervek: 1. A méréseket más epilepszia modellekben is ki lehetne próbálni (pl. kainát, elektromos ingerlés, stb.) 2. Agytörzsi ingerléses kísérletekkel esetleg igazolni lehetne, hogy az egyes epilepszia fázisok és a vizuális rendszer válaszai milyen mechanizmusokon keresztül kapcsolódnak össze. 3. A vizuális rendszer Hz-es ingerlésével kiváltható steady state response mérése epilepszia alatt további jelentős eredményeket adhat a hiperszinkronizáció és a kiváltott szinkron válaszok kapcsolatáról. 4. Az eredmények alapján olyan SPECT CT és fmri mérések tervezhetők, amelyek alkalmasak lehetnek az eredményeink akár humán diagnosztikai felhasználásának megalapozására is. 26

28 8. Összefoglaló A pilokarpin által indukált epilepszia a krónikus temporális lebeny epilepszia és az epilepsziás státusz igen elterjedten alkalmazott farmakológiai modellje. A pilokarpin muszkarin típusú kolinerg hatással rendelkező vegyület, szisztémás alkalmazásával epilepsziás roham, majd status epilepticus idézhető elő patkányokban. A folyamat során fellépő, eltérő elektrofiziológiai jellemzőkkel rendelkező fázisokat a Treiman-féle skálán osztályozhatjuk. Az epilepszia alatt patológiás, generalizált szinkronizáció figyelhető meg az agyműködésben. A vizuális kiváltott potenciál és a retinogram inger által kiváltott szinkronizációs jelenségek, ezért az epilepsziás szinkronizáció és a kiváltott potenciálok hullámformái szoros összefüggést mutathatnak, így felhasználhatók az epilepszia fázisainak objektív jellemzésére. A kísérlet célja a szakirodalomban fellelhető adatok alapján a különböző fiziológiás állapotokban (például a REM és a lassú hullámú alvás) karakterizált vizuális kiváltott válaszok összehasonlítása a Treiman-féle epilepsziafázisok során fellépő jelenségekkel a pilokarpin epilepszia modellben. A méréseket szabadon mozgó NEC (Non- Epileptic Control) állatokon végeztük, mivel más patkánytörzsek spontán epilepsziás rohamokat mutathatnak. A monitorozás négycsatornás corticalis EEG regisztrálással, valamint a bal szem retinogramjának és a vizuális kéregben kétoldali, fényingerrel kiváltott válaszok elvezetésével történt. Eredményeink alapján a pilokarpin kezelés hatására a vizuális kiváltott potenciálok komponenseiben komplex változások figyelhetőek meg, amelyek hátterében a rohamok generalizációja során az agytörzsi felszálló aktiváló rendszer működésének megváltozása áll. Kimutatható, hogy az utolsó fázisban nem-reaktív, sztereotip EEG alakul ki status epilepticusos patkányokban, ami megfeleltethető a kóma és mély anesztézia során tapasztalható, lassú hullámú δ-ritmusnak. Ugyanakkor a NEC állatokban az epilepszia indukció során tartósan fennálló theta-aktivitás alakult ki, amelynek a legújabb irodalmi adatok szerint antiepileptikus hatása lehet. 27

29 9. Abstract Pilocarpine-induced epilepsy is a widely used pharmacological model of chronic temporal lobe epilepsy and status epilepticus (SE). Systemic administration of the muscarinic cholinerg pilocarpine causes epileptic seizures and status epilepticus in rats. This process can be described according to the Treiman-scale, which classifies sequential states during SE with characteristic electrophysiological features. Pathological, generalized synchronization of neurons can be observed in the central nervous system during epileptic seizures. As visual evoked potentials (VEP) and retinograms (ERG) are stimulus-induced synchronization phenomena, thus their waveforms are closely related with epileptic synchronization. Therefore evoked potentials can be used to objectively follow up epileptic phases. The aim of this study was to compare evoked potentials during pilocarpine status epilepticus with the VEPs obtained in different physiological states described in literature and to validate the role of the brainstem in pilocarpine SE. Measurements were carried out on freely moving NEC (Non-Epileptic Control) rats as other strains may show spontaneous epileptic activity. Electrophysiological monitoring were performed by recording 4-channel cortical EEG, transcorneal retinogram of the left eye and flash-evoked potentials of the bilateral visual cortex. Our results have shown that pilocarpine administration causes complex changes in wave components of VEPs and ERGs. These changes can be explained by the widespread generalization of epileptic seizures resulting from functional changes in the brainstem ascending reticular activating system. In rats, non-reactive, stereotyped EEG develops in the last phase of SE which is equivalent to the delta-rhythm during deep anesthesia and brainstem coma. At the same time, induction of pilocarpine epilepsy resulted in persistent theta-activity on the EEG of some NEC rats, which can be an anti-epileptic rhythm according to recent data in the literature. 28