Nehézfém nanopartikulumok magatartás- és neurotoxikológiai hatásai állatkísérletes modellekben

Átírás

1 Nehézfém nanopartikulumok magatartás- és neurotoxikológiai hatásai állatkísérletes modellekben Nagymajtényi László SZTE ÁOK Népegészségtani Intézet Velence, október 16.

2 Porártalmak Kémiai kóroki tényező Porképződéssel járó munkakörök bányászat fémipar üveggyártás porcelángyártás faipar mezőgazdaság stb. Porok egészségkárosító hatása függ expozíciós idő koncentráció kémiai, fizikai tulajdonság szemcse alakja szemcse mérete ülepedő por (>10 µm) lebegő por (1-10 µm) nanorészecskék (<100nm) Eredet Nano-részecskék természetes kőzetek hő okozta mállása vulkáni tevékenység erdőtűz mesterséges égetés - fosszilis tüzelőanyagok diesel motorok fémek megmunkálása - kohászat, hegesztés, csiszolás nanotechnológiai termékek előállítása Sajátosságok 1nm-100nm tömegükhöz képest jelentős felület és darabszám biológiai aktivitás lerakódás határoló hártyákhoz való viszony

3 A nanorészecskék humán egészségkárosító hatásai Epidemiológia - foglalkozási, környezeti, lakossági (kozmetikumok -Ti,Zn) - UK - 1 millió dolgozó - EU - Határértékek (?), mérési lehetőségek - The recent EU definition of nanomaterials will be considered by current and future legislation - The growing importance of the nano sector for the economy and for innovation is recognised - Risk assessment can be conducted with current methods but more research is required (e.g. testing methods/protocols; nano vs bulk form) (Forrás: NanoSight Webinar) ~ ( ) hegesztő - Al, Cd, Cr 3x,6+, Cu, F, Fe, Pb, Mn, Mg, Mo, Ni, Si, Ti, Zn; (CO, CO 2, NO, NO 2, O 3 ) - UV, IR; hő, zaj, vibráció - pulmonaris funkció, asthma, pneumonitis, pneumoconiosis, fibrosis, tumor neurofunkcionális hatások manganizmus diesel kipufogógáz - nanoparticulumok, gázok, (NO 2, CO, CO 2 stb.) szénhidrogének - légzőrendszeri és szisztémás hatás - olfactorius rendszer - oxidatív stress - légúti gyulladásos folyamat - neurológiai folyamatok (kognitív hatások)

4 Mangán (Mn) Kadmium (Cd) Esszenciális mikroelem enzim kofaktor (MnSOD, glutamin szintetáz) Foglalkozási expozíció fémipari folyamatok szárazelem gyártás acélgyártás hegesztés festékgyártás/használat Lakossági expozíció MMT (metilciklopentadienil-mntrikarbonil) fungicidek (Maneb, Mancozeb) Toxicitás - KIR manganizmus myoclonus megváltozott EEG és kérgi kiváltott potenciálok Foglalkozási expozíció - akkumulátor gyártás; galvanizálás - hegesztés - festék pigmentek - műanyag stabilizálók - réz, ólom cink bányászat - fém ötvözetek Lakossági expozíció - táplálkozás (gabona félék; máj, vese) - dohányzás (1-2 ug Cd/cigeretta szál) Toxicitás - KIR - amyotrophias lateralis sclerosis - nervus opticus károsodás - peripherias polyneuropathia - striatalis pályák sérülése - megváltozott vizuális és akusztikus kiváltott potenciálok - viselkedés zavarok

5 Ólom (Pb) Foglalkozási expozíció fém, üveg, kerámia ipar akkumulátor gyártás festékek Lakossági expozíció ólmozott benzin horgászok, vadászok dohányzás Toxicitás - KIR - csökkent tanulási képesség - hallás és egyensúly érzékelés zavara - peripherias polyneuropathia - ideg vezetési sebesség csökkenés Vas (Fe) Biológiai szerep - haemoglobin, mioglobin - enzimek kofaktora (citokróm) - neurotranszmitter-szintézis - myelogenezis - transzport mechanizmus (transzferrin, DMT-1) Foglalkozási expozíció - kohászat, acélgyártás, hegesztés - járműipar - elektronika - orvosbiológiaás (célzott terápia, diagnosztika) Toxicitás - túlzott bevitel - lerakódás - energiatermelés zavara - ROS képződés - oxidatív stressz - lysosoma degradáció - sejthalál - KIR - Parkinson- és Alzheimer-kór, SM, epilepszia - demielinizáció - AUD KP - Nano - mikrovaszkuláris permeabilitás nő - membránsérülés

6 Célkitűzések A humán expozíció modellezése - Bevitt anyag formája szerint oldat NP - Kezelési mód szerint per os intranasalis intratracheális - Dózis szerint - Önálló adagolás és kombinációk szerint A dózis-hatás összefüggések megállapítása - általános toxikológiai hatások (testtömeg, szervtömeg stb.) - elektrofiziológiai változások - magatartási változások

7 Az alkalmazott nanorészecskék Mangán Ólom Kadmium SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék

8 Anyagok és módszerek Per os kezelés Intranasalis kezelés Intratracheális instilláció

9 Anyagok és módszerek Elektrofiziológia - agykéreg Preparálás altatás (uretán ip mg/kg) agy feltárása elektródok elhelyezése primer szomatoszenzoros (SS) vizuális (VIS) auditív (AUD) kérgi mezőkre Regisztrálás Spontán kérgi aktivitás (ECoG) Kérgi kiváltott válaszok - latencia, amplitudó, időtartam SS: 50 stimulus, 1, 2 és 10 Hz (bajuszmező) AUD: 50 stimulus, 1 Hz (hallójárat, klikk ) VIS: 50 stimulus, 1 Hz (fényvillanások) 0 A B C D 2 mv 10 ms Elektrofiziológia - perifériás ideg farokideg - ingerlés - elektromos impulzus - sorozat; kettős impulzus - kiváltott válasz - latencia (A-B, A-C),csúcstól-csúcsig amplitúdó (B-C), - második:első arány

10 Anyagok és módszerek Open field teszt (OF) - Spontán motoros aktivitás perc regisztrálás állatonként megtett út hossza helyváltoztatással, helyzetváltoztatással, ágaskodással, mozdulatlansággal töltött idő események száma Biokémiai vizsgálatok - SOD, GSH (fehérje) Szerv fémtartalom mérés - (ICP-MS) (Morfológiai vizsgálatok) Statisztika: SPSS 15.0 for Windows; kétmintás t-próba; varianciaanalízis (F-próba), egyutas-anova, post hoc LSD teszt; MS Excel Lineáris illeszkedés

11 I. Modell per os Fém Vegyület Dózisok (mg/ttkg) Mangán oldott forma MnCl 2 4H 2 O 15; 60 NP forma MnO 2 2,63 Kadmium oldott forma CdCl 2 2,5H 2 O 3,5 NP forma CdO 2 0,04 Ólom oldott forma Pb(CH 3 COO) 2 3H 2 O 80; 320 NP forma PbO 2 Mangán Ólom Kadmium 3 hét (po.),3+3 hét (po.+ it.); 6 hét (po.); 6+6 hét (po.+ it.) 3 hét (po.),3+1 hét (po.+ it.); 1+3 hét (it.+po.)

12 Eredmények Open field aktivitás Mangán, : p<0.05, 0.01 vs. C; #, ## : p<0.05, 0.01 vs. VC.

13 Eredmények - Mn Kiváltott kérgi aktivitás Rel. latencia 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 Szsz 1 Hz 2 Hz 10 Hz MnVC3 MnL3 MnH3 MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok,,: p<0.05, 0.01, vs. MnVC,,, : p<0.,.01, vs. 1 Hz Rel. latencia VIZ AUD 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 MnVC3 MnL3 MnH3 MnVC33 MnL33 MnH33 Csoportok,,: p<0.05, 0.01, vs. MnVC Rel. latencia 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 Szsz MnVC6 MnL6 MnH6 MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok Rel. latencia VIZ AUD 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 MnVC6 MnL6 MnH6 MnVC66 MnL66 MnH66 Csoportok

14 Eredmények - Mn Perifériás (farok) ideg,,: p<0.05, 0.01, vs. VC

15 Következtetések I. (per os) A kiválasztott kezelési sémák és dózisok alkalmazhatóak voltak Az oldott formával történt per os expozícióhoz viszonyítva a NP formájú fémeknek a bevitt dózishoz képest erőteljesebb hatásuk volt Mn, Cd - testtömeg-gyarapodás Mn, Pb, Cd - OF magatartási és kiváltott válaszok A különbségek okai lehetnek NP-specifikus (oxidatív stressz) fém-specifikus (megváltozott szinaptikus ingerületátvitel) A dózis-hatás összefüggés különbségei külső dózis - belső dózis (szöveti fémszint) összefüggései

16 II. modell Intranasalis Intratrachealis I. II. III. IV. Anyagok Nano MnO 2 Oldott MnCl 2 Nano MnO 2 Kezelési időtartamok Egyszeri beadás 3 és 6 hét 3 hét (napi 1 vagy 2 kezelés) 3, 6, 9 hét Dózisok (Mn mg/ttkg) (napi 2 x 2.63 vagy napi 1 x 5.26)

17 Eredmények - intranasalis Mn Open Field 3 hetes kezelés 6 hetes kezelés : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport ###: p<0,001 vs nano -csoport

18 18 Eredmények - intratranasalis Mn Szenzoros kiváltott potenciálok : p< 0,05 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport : p<0,05 vs 1Hz frekvencia

19 Eredmények - intratracheális Mn Open Field : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport

20 Eredmények - intratracheális Mn Szenzoros kiváltott potenciálok : p< 0,05 vs kontroll csoport :p<0,01 vs kontroll csoport : p<0,001 vs kontroll csoport #: p<0,05 vs nano-csoport ##:p<0,01 vs nano-csoport

21 Eredmények - intratracheális Mn Perifériás (farok) ideg :p<0,01 vs kontroll csoport ###:p<0,001 vs nano-csoport

22 Eredmények - intratracheális Mn Mn-szintek A: kontroll tüdő, B: kontroll agy C: nagy dózissal kezelt tüdő, D: nagy dózissal kezelt agy

23 Következtetések II. Oldott és NP Mn kezelés - hasonló (szignifikáns) neurotoxikus hatások - spontán és kiváltott kérgi aktivitás paraméterei szignifikánsan megváltoztak - OF magatartás az inaktivitás irányába tolódott el - dózisfüggő, kezelési idő függő - a hatások a kumulatív dózissal arányosak - az oldott és nano-állapotú mangán hatásában nem volt minőségi különbség

24 Lehetséges mechanizmusok - Glutamáterg hiperaktivitás - EGoG lassú hullámkomponensek csökkenése, gyorsak fokozódása - Kiváltott potenciálok lassulása - glutamát-felhalmozódás, deszenzitizáció - Mitokondriális toxicitás - Ideg vezetési sebesség csökkenése - Frekvencia-függő jelenségek - a neuronok/rostok kevésbé képesek gyakori ingerlésre reagálni - Ca-csatorna gátlás - ideg vezetési sebesség, kiváltott potenciálok lassulása - Globus pallidus, striatum károsodás (energia-hiányból eredő nekrózis) - csökkent mozgássebesség - csökkent horizontális és vertikális aktivitás

25 III. Modell - intratracheális Csoport Kód Anyag Dózis (mg fém / ttkg) A kezelés időtartama Kezeletlen kontrol K , 6, 9 hét Vivőanyagos kontrol VK Desztillált víz --- 3, 6, 9 hét Mangán, kis dózis Mangán, nagy dózis Kadmium, kis dózis Kadmium, nagy dózis Mn-KD MnO 2 2,63 Mn-ND nanoszuszpenzió 5,26 Cd-KD CdO 2 0,04 Cd-ND nanoszuszpenzió 0,40 Ólom, kis dózis Pb-KD PbO 2,00 Ólom, nagy dózis Pb-ND nanoszuszpenzió 4,00 3, 6, 9 hét 3, 6 hét 3, 6 hét

26 Eredmények - Mn Kérgi kiváltott potenciálok SS latencia VIS, AUD latencia Perifériás (farok) ideg vezetési sebesség

27 Eredmények - Mn szint és oxidatív stressz paraméterek Csoportok VK Mn-KD Mn-ND Agy Mn, ppb (n=8) Vér Mn, ppb (n=8) Agy SOD, U/mg prot. (n=5) Agy Mn-SOD, U/mg prot. (n=5) Agy GSH, μm (n=5)

28 Következtetések III. Szuszpendált fém nanorészecskék ismételt, több hetes intratracheális instillálása technikailag kivitelezhető (6, ill. 9 hét instillálás után magas fémszintek a szervekben) Funkcionális idegrendszeri elváltozások mutathatók ki Legérzékenyebb - kérgi kiváltott potenciálok - Mn, Pb, Cd - perifériás idegvezetés, OF - Mn, Pb Az oxidatív stresszre jellemző változások mérsékeltek Mn, Pb - fémszintek - neurofunkcionális elváltozások (ECoG index) - fémszintek - oxidatív stressz markerek (agyi GSH) Cd - neurofiziológiai és biokémiai elváltozások - vérben és agyban Cd nem volt kimutatható

29 Hasonló neurofunkcionális elváltozások közös hatásmechanizmus (?) - oxidatív stressz, Ca-függő folyamatok, jelátvivő rendszerek - Mn, Pb, Cd glutamát forgalom megzavarása - deszenzitizálhatja a postsynapticus receptorokat gyengébb/lassúbb postsynapticus excitatio formatio reticularis fokozott corticalis aktiváció - OF dopaminerg rendszer dopaminerg neuronok különösen érzékenyek az oxidatív stresszre

30 IV. Modell - kombinációk I. kísérlet (Szubakut per os) II. kísérlet (Szubakut intratracheális) III. kísérlet (Szubakut intratracheális) IV. kísérlet (Szubakut kombinált intratracheális) Időtartam 6 hét 5 hét 4 hét 4 hét Az alkalmazott fémek és dózisok MnCl 2 4 H 2 O 2,5 mg/ml MnCl 2. 4 H 2 O 0,5 mg/ttkg Fe 3 O 4, MnO 2, Cr(OH) 3 NP-ok kis dózis: 2 mg/ttkg nagy dózis: 4 mg/ttkg Fe 3 O 4, MnO 2, Cr(OH) 3 NP-ok kettős, illetve hármas kombinációi: 2 mg/ttkg

31 Rel. latencia 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0,95 0,9 0,85 0,8 Rel. latencia 1,3 EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET && & && & & &&& SS 1 Hz 2 Hz 10 Hz FMVC FeLD FeHD MnLD MnHD CrVC CrLD CrHD SS &&& && &&& & 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 Hz 2 Hz 10 Hz & &&& &&& && & & 1 0,95 0,9 0,85 0,8 VC FM MC FC FMC,, p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll &, &&, &&& p<0,05, 0,01, 0,001 vs. 1 Hz

32 EREDMÉNYEK - III-IV. KÍSÉRLET Rel. latencia VIZ AUD 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 FMVC FeLD FeHD MnLD MnHD CrVC CrLD CrHD Rel. latencia VIZ AUD 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 VC FM MC FC FMC,, p<0,05, 0,01, 0,001 vs. megfelelő vivőkontroll

33 A modellben Következtetések IV. Azonos kísérleti körülmények között a Cr ~ Mn Fe hatása minimális, részben ellentétes a Mn-éval A fémek interakciói Mn-nak a testtömeg gyarapodásra kifejtett negatív hatását a Fe kivédte Cr látszólag nem vett részt ilyen interakcióban Szöveti fémszintek - a Fe befolyással volt a Cr-ra, a Mn-ra azonban nem A belső dózisok szerepe a funkcionális elváltozások kialakításában nem kizárólagos nem a legjobb biomarkerek

34 A modellek általános/összefoglaló értékelése A kísérleti rendszer alkalmasnak mutatkozott a NP expozíció idegrendszeri hatásainak modellezésére bevitt anyag formája kezelési mód dózis (küls/belső dózis) önálló/kombinált adagolás Az elektrofiziológiai (és magatartási) vizsgálati módszerek megfelelkők lehetnek az idegrendszeri elváltozások detektálására és nyomon követésére egyes mért paraméterek potenciálisan biomarkernek tekinthetők - kiváltott potenciál latencia, kettős ingerlés második:első aránya Humán adatok trendbeli azonossága - adekvát a modell (?)

35 A kísérleteket vezették/végezték - Papp András egy. docens - Szabó Andrea egy. adjunktus - Lukács Anita egy. tanársegéd - Horváth Edina (PhD) - Máté Zsuzsanna (PhD) - Oszlánczy Gábor PhD) - Sárközi Leila (PhD) - Takács Szabolcs (PhD) Köszönetnyílvánítás - SZTE TTIK Alkalmazott és Környezeti Kémiai Tanszék - Prof. Dr. Kiricsi Imre - Kónya Zoltán és kollégái - MOL Analitikai Laboratórium (Algyő) - Szőke Attila és kollégái

36 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!