Analitikai kémiai módszerek és alkalmazásuk a faanyagkémiában

Átírás

1 Analitikai kémiai módszerek és alkalmazásuk a faanyagkémiában - Kromatográfiás módszerek - Spektroszkópiai módszerek - Termikus módszerek - Minőségi és mennyiségi analitikai módszerek

2 Analitikai kémiai módszerek és alkalmazásuk a faanyagkémiában - Kromatográfiás módszerek Cél: komponensek elválasztása az ún. álló- és mozgófázisok közötti eltérő megoszlási tulajdonságaik alapján. Mennyiségi és minőségi kiértékelés. Előzmények 1906: M. Cvet ( ), orosz botanikus - levél színanyagainak elválasztása CaCO 3 állófázison. Kromatográfia. (Adszorpciós oszlop kromatográfia) 1938-ig: Mikro-kromatográfia: Kísérletek az oszlopátmérő lecsökkentésére (1mm-ig). Probléma: oszlop előállítása (töltése), nagyon kis anyagmennyiség vizsgálata. 1937: vékonyréteg kromatográfia elve. A zárt (oszlop) helyett nyitott (vékonyrétegű) állófázis alkalmazása. (Ismailov és Shraiber) 1944: Consden, Gordon, Martin: Aminosavak elválasztása szűrőpapír vékonyrétegen (papírkromatográfia). Megoszlásos kromatográfia. Nagy népszerűség. Hátrányai: állófázis poláros, összetétele nem állandó. Csak egyes anyagcsoportok elválasztása. Nehezen reprodukálható elválasztás, kis felbontású. Nem standardizálható.

3 Analitikai kémiai módszerek és alkalmazásuk a faanyagkémiában 1958: Vékonyréteg kromatográfia. Előnyei: - Könnyen standardizálható (réteg vastagsága, szemcsemérete, előállítás, kifejlesztő kamra, stb.) - Segédeszközök alkalmazása (mintafelvitelhez, kiértékeléshez, stb..) - Sokoldalúan használható pontosan ismert összetételű szorbensek (állófázis) kifejlesztése (Al 2 O 3, szilikagél (SiO 2 ), módosított szilikagél, stb.). - Alkalmazási területek kiterjesztése 1962: E. Stahl: A modern vékonyréteg kromatográfia (megoszlásos kromatográfia) alapjai. Megoszlásos kromatográfia: Az elválasztandó komponensek megoszlanak az ún. mozgófázis és állófázisok között. Nernst-féle megoszlási törvény: K A A komponens megoszlási hányadosa C SA A komponens egyensúlyi koncentrációja az állófázisban C MA A komponens egyensúly koncentrációja a mozgófázisban K A A komponens megoszlási hányadosa (Nernst-állandója)

4 Kromatográfiás módszerek Mozgófázis áramlása Szelektivitás

5 Kromatográfiás módszerek -Csoportosítás a kromatográfiás állófázis alakja szerint: - Rétegkromatográfia: Kétdimenziós elválasztás 1. Vékonyréteg kromatográfia (állófázis: vékonyréteg (0.2 mm vastag réteglap), mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása) 2. Papírkromatográfia (állófázis: cellulóz, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása. elavult..) - Oszlopkromatográfia Egydimenziós elválasztás 1. Folyadékkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: folyadék. Nem illékony vegyületek elválasztása.) 2. Gázkromatográfia. (állófázis: töltött oszlop, mozgófázis: gáz. Illékony vegyületek elválasztása.)

6 Vékonyréteg kromatográfia A vékonyréteg kromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis - Mintafelvitel - Kifejlesztés - Megjelenítés - Minőségi azonosítás - Mennyiségi kiértékelés

7 Vékonyréteg kromatográfia Állófázis Anyaga: 1. szilikagél (SiO 2 ). Olcsó, hatékony, könnyen előállítható. 10-ből 9 rétegkromatográfiás elválasztás szilikagél állófázison történik. Szemcseméret: 5-15 µm (HPLC töltet: µm). 2. módosított szilikagél (CN, NH 2, C18, C8). Nem olcsó. Speciális alkalmazásokhoz. Vastagsága: mm Hordozó: Alumíniumlemez vagy üveglap. Elméleti Elméleti tányérszám tányérmagasság VRK µm HPLC µm A HPLC és a VRK maximális elválasztóképessége 10 cm-es elválasztási távolságon. Hátrány: alacsony felbontás és elméleti tányérszám. Csak kis számú komponens választható el megfelelő elbontással.

8 Vékonyréteg kromatográfia Mintafelvitel Módja: pontszerű vagy sávszerű mintafelvitel. Mennyisége: feladatnak megfelelően megválasztható (2 pg 1 mg). Pont- és sávszerű mintafelvitel Kifejlesztés után Előny: - Nincs szükség a minta koncentrálására, ha nem elég tömény. - Egy réteglapra akár 20 minta is felvihető. Egyszerre több minta meghatározható. Kisebb időigény. - Mintafelvitel hossza a feladatnak megfelelően meghatározható (akár 15 cm is lehet)

9 Vékonyréteg kromatográfia Mintafelvitel pont sáv A sávszerű mintafelvitel javítja az elválasztás hatékonyságát. Főleg nagy mintamennyiségek esetén előnyös.

10 Vékonyréteg kromatográfia Mintafelvitel CAMAG Linomat 5 mintafelviviő

11 Kifejlesztés Vékonyréteg kromatográfia - Dinamikus fázisérintkeztetés. A mozgófázis áramlása a kapilláris erők következtében történik. A fázisérintkeztetés nem-egyensúlyi! - Horizontális és felszálló kifejlesztés. - A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztás hatékonyságát. Felszálló kifejlesztés Horizontális kifejlesztés 1. Mozgófázis párolgása a kamra gőzterébe. 2. Lepárolgás a rétegről 3. Mozgófázis gőzinek adszorpciója a rétegre. 4. Mozgófázis megoszlása az állófázison (α, β, γ frontok) Állófázis Mozgófázis - A mozgófázis áramlása időben nem egyenletes (lassul). - A gőztér jelenléte befolyásolja az elválasztást. - A mozgófázis ha több komponensű önmaga is megoszlik az állófázison - Nehezen leírható.

12 Megjelenítés Vékonyréteg kromatográfia A vizsgált komponensek láthatók (pl. festékelegy). A legtöbb komponens azonban nem színes. Ezek megjelenítésére a szilikagél állófázis néhány százalékban tartalmaz ZnSiO 3 -t (cink-szilikát), amely 254 nm-es UV fénnyel megvilágítva fluoreszkál. A komponensek elfedik a réteget és sötét foltként láthatók. Több vegyület 366 nm-es UV fénnyel megvilágítva önmaga is fluoreszkál Látható fény UV (254 nm) UV (366 nm) Stephania kivonat elválasztása szilikagél állófázison. Megjelenítés különböző hullámhosszakon.

13 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Az esetek többségében azonban a vizsgált komponensek nem láthatók (nem színesek) illetve nem különíthetők el azonnal a többi anyagtól (mátrixtól).??? Szelektív megjelenítés származékképzéssel: A kifejlesztett réteg lefújása vagy bemerítése olyan anyaggal amely csak a vizsgálni kívánt komponensekkel képez lehetőleg színes vagy fluoreszkáló terméket.

14 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel (előhívással) Előny: - Szelektív megjelenítés, csak a vizsgált vegyületcsoportra. - A mátrix, ill. nem vizsgált komponensek láthatatlanok maradnak. Nem szükséges a minta előkészítés során a mintát megtisztítani a mátrixés egyéb zavaró komponensektől. - Nem jelent gondot az állófázis elszennyezése. Azofestékek bomlása során keletkező karcinogén aminok kimutatása festett bőranyagból. Előhívás: N-(1-naftil-)-etiléndiammónium-dikloriddal.

15 Vékonyréteg kromatográfia Megjelenítés Szelektív megjelenítés származékképzéssel Előny: Többszöri előhívás, illetve többszöri kiértékelés lehetősége. Astragalus és Hedysarum fajok vizsgálata

16 Astragalus és Hedysarum fajok vizsgálata A előhívás nélkül, 254 nm B előhívás nélkül, 366 nm C előhívás metanolos kénsavval, látható fény D előhívás metanolos kénsavval majd 366 nm 1 asztragalozid IV (szaponin típusú vegyület) 2-6 Astragalus fajok 7- Hedysarum kivonat 8 Astragalus minta. Teljes gyökér. 9 asztragalozid IV 10 Astragalus gyökér, 2 éves 11 Astragalus gyökér, 4 éves 12 Astragalus gyökér, 6 éves 13 Astragalus gyökér 14 Astragalus gyökér, föld alatti szár 15 Astragalus gyökér szelet (kinai) 16 asztragalozid IV

17 Minőségi azonosítás Vékonyréteg kromatográfia - Retenciós faktor (R f ) ÉS - szín vagy egyéb optikai információ összevetése (pl. fluoreszcencia, reflexiós spektrum, stb.) alapján. front a b start A retenciós faktor értékének kiszámítása adott kromatográfiás sávra

18 Minőségi azonosítás Vékonyréteg kromatográfia - Kétdimenziós kifejlesztés lehetősége: egy minta kifejlesztése egy réteglapon két különböző mozgófázissal. Réteglap elfordítása, majd kifejlesztés a 2. mozgófázissal mintafelvitel kifejlesztés 1. kifejlesztés 2.

19 Mennyiségi elemzés Vékonyréteg kromatográfia - Mennyiségi információ: a foltok mérete és optikai sűrűsége (színintenzitás) alapján. - Denzitometria: a kromatográfiás foltok optikai sűrűségének mérése 1. Pásztázó denzitometria (diffúz-reflexiós spektrofotometria). 2. Videodenzitometria (digitális képalkotás a rétegről).

20 Pásztázó denzitometria Vékonyréteg kromatográfia - Pásztázás optikai réssel, a diffúz módon visszavert fénymennyiség mérése. s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 m1 minta s1-s5 standard denzitogram

21 Pásztázó denzitometria Vékonyréteg kromatográfia - Kalibrációs egyenes felvétele adott komponensre. Ismeretlen mintából az adott komponens mennyiségének meghatározása. - Kalibráció csúcsterület vagy csúcsmagasság alapján. a csúcsterület s2 s3 s4 s5 s1 s1 m1 s2 m1 s3 m1 s4 m1 s5 anyagmennyiség (ng) Kalibrációs egyenes a komponensre A komponens elválasztása m1 mintából és mennyiségének meghatározása ötpontos kalibráció segítségével.

22 Pásztázó denzitométer felépítése Vékonyréteg kromatográfia Denzitométer Pásztázó denzitométer felépítése Denzitogram kiértékelése

23 Vékonyréteg kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia alkalmazása - (+)-katechin meghatározása kocsányos tölgy kérgéből KK BK KK BK KK BK Külső kéreg (KK) Belső kéreg (BK) C EC Szíjács A kocsányos tölgy kérge Katechinek elválasztása tölgy kéregből. Állófázis: szilikagél, mozgófázis 9:1 diizopropil-éter.hangyasav. Előhívás vanillin-h 3 PO 4 reagenssel. C: (+)-katechin EC: (-)-epikatechin Kalibrációs görbe (+)-katechinre

24 Vékonyréteg kromatográfia Denzitometria - Egy réteglap többször is kiértékelhető (pl. több hullámhosszon vagy más megvilágítás mellett. - Külön kiértékelési lehetőség előhívás előtt és után. - UV-VIS reflexiós spektrum felvételének lehetősége a pásztázó denzitométerrel.

25 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Hagyományos VRK hátrányai: alacsony elméleti tényérszám, gőzfázis okozta reprodukálhatósági problémák; rövid kifejlesztési táv (6-10 cm); időben változó és nem optimális áramlási sebesség; lassú elválasztás (20 perc/ 6 cm) Az OPLC előnyei: - Zárt állófázison történik a szétválasztás. Nincs gőztér. - A mozgófázis (a HPLC-hez hasonlóan) kényszeráramlással mozog. - Állandó és optimális áramlási sebesség. - Nagy kifejlesztési távolság (akár 20 cm). - Gyors elválasztás. (10 perc/20 cm) - Alacsony oldószerigény Az OPLC hátrányai: - Speciálisan előkészített réteglapot igényel, ami drágább.

26 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) Mozgófázis frontja (mm) Kifejlesztési idő (s) 20 cm 1 telített gőzterű felszálló kamra 2 - telítetlen gőzterű felszálló kamra 3 - OPLC Festékelegy OPLC elválasztása

27 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográf (OPLC) OPLC - túlnyomásos rétegkromatográf

28 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok minőségi és mennyiségi meghatározása sörmintából. xilóz fruktóz glükóz - Párnanyomás: 50 bar. - Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz - Kifejlesztés 250 µl/perc - 2 x 4500 µl mozgófázis - Megjelenítés: anilin-difenilamin reagenssel. - Kiértékelés: 540 nm-en (látható tartomány) s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 s1 s2 s3 s4 Szénhidrátok elválasztása sörmintából szacharóz maltóz

29 Vékonyréteg kromatográfia Túlnyomásos rétegkromatográfia alkalmazása Szénhidrátok elválasztása és azonosítása termikusan módosított faanyagból. Hőkezeléssel módosított faanyag megjelenítés: naftorezorcin reagenssel anilin-difenilamin reagenssel Szénhidrátok elválasztása hőkezeléssel módosított faanyagból Kormatogárfiás körülmények: árnanyomás: 50 bar; Mozgófázis: 9:1 acetonitril:víz; Kifejlesztés 250 µl/perc; 2 x 4500 µl mozgófázis; Előhívás naftorezorcin reagenssel, vagy anilin-difenilamin reagenssel.

30 Folyadékkromatográfia A folyadékkromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis (szilikagél, vagy módosított szilikagél) - Mozgófázis (víz és szerves oldószer elegye. Gradiensképzés) - Detektálás (átfolyócellás detektor: UV, fluoreszcens, tömegszelektív, törésmutatóindex mérésén alapuló, stb.) - Minőségi azonosítás (retenciós [visszatartási] idő valamint a detektor által szolgáltatott információ alapján [UV elnyelés, spektrum, molekulatömeg]) - Mennyiségi kiértékelés (csúcsterület, ill.csúcsmagasság alapján) HPLC: nagynyomású folyadék kromatográfia: Mozgófázis nagy nyomású kényszeráramoltatása a mozgófázison. Egydimenziós elválasztás. Nem illékony szerves vegyületek elválasztása.

31 Folyadékkromatográfia HPLC mérőrendszer felépítése A: mozgófázis tartályok; B: keverő szelep és gradienspumpa; C: Túlnyomás szabályozó; D: pulzáláscsökkentő; E: keverőkamra; F: mintabemérő szelep; G: kromatográfiás oszlop (állófázissal töltve); H. vezérlőegység; I: detektor (pl. UV fotométer); J: számítógép interfész (A/D konverter); K: számítógép; L: nyomtató

32 Folyadékkromatográfia Vörösfenyő kivonat elválasztása HPLC-vel Mintabemérés: 1 mikroliter Mozgófázis A: víz Mozgófázis B: acetonitril Mozgófázis C: víz/acetonitril 95:5 + H 3 PO 4 ph=1.56 Mozgófázis D: víz/acetonitril 95:5 + puffer ph=4.22 Detektorjel Mozgófázis gradiens Mozgófázis gradiens program: perc: 27-33%B (73-67%A) perc: 33-80%B (67-20%A) perc: 80%B (20% A) Név retenciós idő Terület % Csúcsterület Arány % Retenciós idő (perc) Kiértékelés

33 Gázkromatográfia A gázkromatográfiás analízis paraméterei: - Állófázis (adszorbenssel töltött, vagy filmbevonatú kapilláris oszlop) - Mozgófázis (vivőgáz [N 2, H 2, Ar]. Hőmérsékletgradiens: fűthető oszloptér) - Detektálás (átfolyócellás detektor: tömegszelektív, lángionizációs, vezetőképességi, stb. elven működő detektor) - Minőségi azonosítás (retenciós [visszatartási] idő valamint a detektor által szolgáltatott információ alapján (UV elnyelés, spektrum, molekulatömeg) - Mennyiségi kiértékelés (csúcsterület, ill. csúcsmagasság alapján) GC: gázkromatográfia: Mozgófázis gáz, melynek nyomás hatására történő áramoltatás történik a kromatográfiás oszlopon keresztül. Egydimenziós elválasztás. Illékony szerves vegyületek elválasztása.

34 Gázkromatográfia Minta injektálás Erősítő Reduktor Injektor Kromatogram Detektor Hőmérséklet-programozható oszloptér Vivőgáz (mozgófázis) Kromatográfiás oszlop A gázkromatográfiás (GC) mérőrendszer felépítése

35 Gázkromatográfia Detektorjel Kondenzvíz gázkromatográfiás vizsgálata. Piros: lucfenyő; fekete: kőris kezeléséből származó kondenzvíz. Mintabemérés: 1 mikroliter Mozgófázis: Argon Injektor hőmérséklet: 275 o C Hőmérséklet gradiens program: 0 3 perc: 35 o C 3-20 perc: o C (15 o C/perc) Tömegszelektív detektálás Retenciós idő (perc)

36 Gázkromatográfia Retenciós idő (perc) Vegyület neve Terület Retenciós Vegyület neve Terület idő (perc) Kőris Lucfenyő A kondenzvizekben azonosított vegyületek és a csúcsterületeik

37 Optikai spektroszkópiai módszerek Sugárzás Mikrohullám Infravörös Látható UV Röntgen Gamma elnyelődés során gerjesztett energiaszinek Molekula és az elsődleges kötések forgási átmenetei Elsődleges kötések forgási és rezgési átmenetei Vegyérték (külső) elektronok gerjesztése. Kötö- és nemkötő elektronok gerjesztése Atomtörzs elektronjainak (belső elektronok) gerjesztése Atommag, legbelső elektronok gerjesztése

38 Spektroszkópiai módszerek csoportosítása. A: atomspektroszkópiai módszerek, M: molekulaspektroszkópiai módszerek Optikai spektroszkópiai módszerek

39 Optikai spektroszkópiai módszerek Anyag és elektromágneses sugárzás kölcsönhatásán alapuló fontosabb spektroszkópiai módszerek.

40 Optikai spektroszkópiai módszerek Az elektromágneses sugárzás (EMS) jellemzői: 1. Hullám tulajdonság - Oszcilláló elektromos tér, mely a térben transzverzális hullámként terjed. - Létezik hullámhossza (λ), frekvenciája (µ) és sebessége (v). v = λ υ - Képes elhajlásra, szóródásra, törésre, diszperzióra, visszaverődésre. 2. Részecske tulajdonság - Az EMS bizonyos megnyilvánulásai nem magyarázhatók a hullámmodell segítségével (pl. abszorpció, emisszió, fényelektromos hatás) - A sugárzás diszkrét energia csomagok -ból, fotonokból áll. - Egy foton energiája: E = h υ A két tulajdonság közül egy adott pillanatban mindig csak az egyik nyilvánul meg..

41 Optikai spektroszkópiai módszerek Monokromatikus, síkban polarizált EMS. Monokromatikus sugárzás terjedése Különböző közegekben A törésmutató: Elhajlás, diffrakció Fénytörés n 1 : 1-es közeg törésmutatója c: fénysebesség vákuumban v 1 : fény sebessége az 1-es közegben

42 Optikai spektroszkópiai módszerek Az elektromágneses sugárzás abszorpciója (elnyelődése) - A minta a rajta áthaladó sugárzás bizonyos frekvenciájú komponenseinek intenzitását csökkenti - Adott hullámhosszú fotonok elnyelése. Gerjesztés (Energiaközlés). - A gerjesztés feltétele: az elnyelt foton energiája = alapállapot energiája gerjesztett állapot energiája - Közegtől és a hullámhossztól függően atomok vagy molekulák gerjesztődhetnek. M + h υ M* - Relaxáció: a gerjesztett állapot élettartama igen rövid ( sec). Ezután a gerjesztett részecske visszatér az alapállapotba (relaxál), a felvett energiát pedig hő, ütközések vagy EMS sugárzás formájában leadja. M* M + hő - Abszorpciós színkép (spektrum): a sugárzás elnyelődésének mértéke a hullámhossz függvényében

43 Optikai spektroszkópiai módszerek Az elektromágneses sugárzás abszorpciója (elnyelődése) A = lg (I o /I) = ε l c Lambert-Beer törvény A abszorbancia (elnyelés mértéke) I o a mintába belépő sugárzás intenzitása I a mintából kilépő sugárzás intenzitása l a minta rétegvastagsága c a minta koncentrációja ε moláris elnyelési együttható - Atomok abszorpciója - Molekulák abszorpciója - Relaxációs folyamatok

44 Optikai spektroszkópiai módszerek Atomok abszorpciója Molekulák abszorpciója - Gáz halmazállapotban - UV és VIS gerjesztésre: elektronátmenetek. - vonalas színkép (spektrum) Molekuláris abszorpció Sugárzásmentes relaxáció Fluoreszcencia - E o, E 1, E 2 : elektrongerjesztési szintek - 1,2,3,4: rezgési energiaszintek - UV, VIS és IR gerjesztésre: Elektron-, rezgési- és forgási átmenetek. - sávos, színkép, lényegesen több átmenet mint az atomok abszorpciója esetén

45 Optikai spektroszkópiai módszerek Molekulák energiaváltozása: E molekula = E elektron + E rezgési + E forgási E elektron 10 E rezgési 100 E forgási Relaxációs folyamatok: - Kisugárzott energia = a felvett energia (pl. emissziós színképelemzés) - Sugárzásmentes úton (hőleadás ütközések révén. Gyakori, mivel a rezgési átmenetek élettartama sec-ig tart csak) - Fluoreszcencia (EMS hatására gerjesztett atomok, molekulák, fotonok kisugárzása mellett kerülnek vissza az alapállapotba). A kisugárzott foton energiája kisebb, mint a gerjesztő sugárzás energiája.

46 Fluoreszcencia

47 Optikai spektroszkópiai módszerek Fontosabb módszerek: módszer elv UV-látható (UV-VIS) spektroszkópia (abszorpció, reflexió) IR (infravörös) spektroszkópia (abszorpció, reflexió) Energiaszóródásos röntgen spektroszkópia (EDX) (emisszió) Raman spektroszkópia (szóródás) Elektronspin rezonancia (ESR) spektroszkópia (abszorpció) Magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópia (MRI) (abszorpció)

48 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: UV-látható (UV-VIS) spektroszkópia - Molekulában lévő atomok vegyérték elektronjainak (kötő (σ és π) és nem kötő (n) gerjesztése. Kötéstípusok vizsgálata. Az elektron-spektrum összetett, mert az elektron átmenetekre rezgési átmenetek is szuperponálódnak és az oldószer minősége is befolyásolja ezeket az átmeneteket: széles elnyelési sávok - Mennyiségi meghatározás

49 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: UV-látható (UV-VIS) spektroszkópia Alkalmazások: - Szerves funkciós csoportok jelenlétének felismerése. - Tipikus mennyiségi analitikai módszer (szervetlen és szerves anyagok). - Reakciósebesség és egyensúlyok vizsgálata (pl. enzimkinetika). - Disszociációs állandók meghatározása. - Titrálási feladatokban végpontjelzési módszer. - Színmérés.

50 Optikai spektroszkópiai módszerek UV-látható (UV-VIS) spektroszkópia mennyiségi analízis Mennyiségi analízis oldatból. Az adott hullámhosszon elnyelt fény mennyisége a meghatározás tartományában egyenesen arányos a koncentrációval. A = -log (I/I o ) = α c l Folyadékminta UV-látható spektrofotmetriás vizsgálata Lambert-Beer törvény A: Abszorbancia (fénylenyelés mértéke) l: optikai úthossz a folyadékmintában c: koncentráció α: moláris fényelnyelési együttható I o : belépő fény intenzitása I: kilépő fény intenzitása LOD: kimutatás alsó határa LOQ: mennyiségi meghatározás alsó határa LOL: linearitási határ noise: zaj Koncentráció Dinamikus tartomány Abszorbancia Nagyobb meredekség, nagyobb érzékenység Kalibrációs egyenes

51 Optikai spektroszkópiai módszerek 3. UV-VIS spektrofotométer felépítése (Shimadzu UV-3101PC) Vakoldat Minta Küvettatartók Fényforrás Tükör Optikai rács Fényforrások Fényszaggató Detektor Ablak

52 Optikai spektroszkópiai módszerek Emittált sugárzás hullámhossz szerinti felbontása - Monokromátorok Kollimátor: párhuzamos fénynyaláb előállítása. d Elv: fényelhajlás és interferencia Rácsegyenlet: n λ = (sin α - sin β) n: a reflexió rendje, d: rácsállandó

53 Optikai spektroszkópiai módszerek Optikai rácsot alkalmazó fényfelbontó berendezések

54 Optikai spektroszkópiai módszerek - UV és látható abszorpciós és reflexiós spektroszkópia Cél: kötésszerkezet tanulmányozása (UV). Színmérés (látható) szilárd felületről, vagy oldatból. Mennyiségi analízis oldatból (Lambert-Beer törvény alapján). UV VIS Színmérés. 275 nm fenolos-oh (lignin, polifenolok) Reflexiós UV spektrum (felületről) Reflexiós látható spektrum (felületről)

55 Optikai spektroszkópiai módszerek - UV és látható abszorpciós és reflexiós spektroszkópia A kioldható szénhidrát tartalom és a kioldható összes fenol tartalom meghatározása spektrofotometriásan különböző famintákból. Extrakció: 0.25 g fa extrakciója 3 órán át ultrahangos fürdőn 8 x 6 ml 80%-os metanollal. Kioldható szénhidrát (mono- és oligoszacharid) tartalom meghatározása: Dubois módszerével. Extraktum reagáltatása fenollal és kénsavval. Fotometriás mennyiségi meghatározás 490 nm-en. Kioldható összes fenol tartalom meghatározása: Folin-Ciocâltău reagenssel. Fotometriás kiértékelés. Mérési hullámhossz: 760 nm-en. színhatár Termofa minták totálfenol és kioldható szénhidrát tartalma a kezelés (0,2,3) függvényében. Bu: bükk, AH: juhar, BuP: bükk, Es: kőris. A totálfenol tartalom sugár irányú változása álgesztes bükk korongban a faanyag száradása során.

56 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: Infravörös (IR) spektroszkópia - Abszorpció feltétele: 1. sugárzás frekvenciája = a molekula rezgési frekvenciája (rezgés amplitúdója megnő) 2. az adott rezgés során dipólusmomentum változás következzen be. (dipólusmomentum: két töltés különbségétől és a két töltés központjának távolságától függ).

57 Optikai spektroszkópiai módszerek - Infravörös abszorpciós és reflexiós spektroszkópia Forgási spektroszkópia (távol IR, h.szám: cm -1 ) Forgási és rezgési spektroszkópia (közép IR, h.szám: cm -1 ) Rezgési felharmonikusok és kombinációs rezgések (közeli IR, h.szám: cm -1 ) Cél: kötéstípusok azonosítása szerves vegyületekben a rájuk jellemző forgási és rezgési átmenetek kimutatásával. Minőségi és mennyiségi analízis feltárás (extrakció) nélkül. Degradáció, szerkezeti átalakulás kimutatása akár szilárd mintából (akár felületről). Vegyületek azonosítás. szimmetrikus vegyértékrezgés antiszimmetrikus vegyértékrezgés ollózó mozgás kaszáló mozgás síkra merőleges szimmetrikus síkra merőleges aszimmetrikus A szerves vegyületekben előforduló CH 2 csoport jellemző rezgési átmenetei

58 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: Infravörös (IR) spektroszkópia Az IR sugárzás tartományai ( cm -1 ): 1. A távoli infravörös tartomány (FIR = Far Infrared, cm -1 ): nehézatomok vegyérték- és deformációs rezgései, torziós rezgések, kristályrács rezgései, némely forgási átmenet. 2. Analitikai infravörös tartomány ( cm -1 ): vegyérték és deformációs rezgések tartománya. 2.1 Ujjlenyomat tartomány (deformációs rezgések) ( cm -1 ): adott vegyületre jellemző és egyedi. 2.2 Vegyértékrezgések tartománya ( cm -1 ): Jellegzetes csoportok rezgései találhatók meg itt. Ez a tartomány így nem a vegyületre, hanem a bennük található csoportokra karakterisztikus. 3. A közeli infravörös tartomány (NIR = Near Infrared, cm -1 ): ebben a tartományban főképp a felhangok és a kombinációs sávok jelennek meg.

59 Optikai spektroszkópiai módszerek - Infravörös abszorpciós és reflexiós spektroszkópia Az infravörös spektrum jellegzetes csoport-rezgései 1. A távoli infravörös tartomány ( cm -1 ): nehézatomok vegyérték- és deformációs rezgései, torziós rezgések, kristályrács rezgései, némely forgási átmenet. 2. Analitikai infravörös tartomány ( cm -1 ): vegyérték és deformációs rezgések tartománya. 2.1 Ujjlenyomat tartomány (deformációs rezgések) ( cm -1 ): adott vegyületre jellemző és egyedi. 2.2 Vegyértékrezgések tartománya ( cm-1): Jellegzetes csoportok rezgései találhatók meg itt. Ez a tartomány így nem a vegyületre, hanem a bennük található csoportokra karakterisztikus. 3. A közeli infravörös tartomány (NIR = Near Infrared, cm-1): ebben a tartományban főképp a felhangok és a kombinációs sávok jelennek meg.

60 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: Infravörös (IR) spektroszkópia Ujjlenyomat tartomány: A molekula teljes vázszerkezetére jellemző elnyelési sávok. Segítségével a molekulák azonosíthatók. Spektrumkönyvtárak kialakítása.

61 Optikai spektroszkópiai módszerek - Infravörös reflexiós spektroszkópia Fa összetételének, szerkezetének jellemzése Faanyag infravörös refelxiós spektruma

62 Optikai spektroszkópiai módszerek - Infravörös reflexiós spektroszkópia Bükkből izolált lignin (dioxán-lignin) refelxiós IR spektruma. DLM-1: egészséges faanyagból, DLM-2: élesztőgombával kezelt faanyagból. Bükk extraktum IR spektruma. a: egészséges fa acetonos extraktuma, b: élesztőgombával kezelt fa acetonos extraktuma 3400 cm-1: δ OH alifás karbonsav és 2854 cm -1 : aszimmetrikus és szimmetrikus C-H vegyértékrezgés. 1743: C=O vegyértékrezgés (észterek), 1700 cm -1 : C=O vegyértékrezgés (karbonsavak), 1460 és 1382 cm -1 : -CH2 és -CH3 deformációs rezgések, 1163 cm -1 : C-O vegyértékrezgés (észterek), 840 és 700 cm -1 : alkén cisz-izomerek, 824 cm-1: C-H ollózó és kaszáló rezgései.

63 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: Infravörös (IR) fotométer felépítése és jellegzetességei - probléma: UV és VIS tartományban használt detektorok és fényfelbontó egységek nehezen vagy egyáltalán nem alkalmazhatók. - Speciális detektorok alkalmazása és rács/prizma helyett interferométer és Fourier-transzformációs kiértékelés.

64 Optikai spektroszkópiai módszerek Fényabszorpción alapuló módszerek: Infravörös (IR) spektroszkópia alkalmazásai - Vegyület azonosítása spektrumkönyvtárak alapján (ujjlenyomat spektrum segítségével). - Minőségi azonosítás, szerkezet meghatározás. - Mennyiségi meghatározás szilárd és gázfázisú mintából. - Légszennyezés mérés (szerves gőzők, akár 1 ppm nagyságrendben). - Teljes funkciós csoport analízis. - IR spektrométer + mikroszkóp (pl. szövetek vizsgálata, törvényszéki analitika). - Biomolekulák (pl. fehérjék) másodlagos szerkezetének vizsgálata. - Ipari alkalmazások: műanyagok azonosítása, faanyagok fizikai/kémiai paramétereinek vizsgálata, élelmiszerek nedvesség és fehérjetartalmának vizsgálata, stb., stb.

65 Optikai spektroszkópiai módszerek - Energiaszóródásos röntgen spektroszkópia (EDX) + SEM -Az EDX mérés elve: az SEM (pásztázó elektronmikroszkópos) mérés során az előkészített (fa)mintát, illetve annak felületét nagy energiájú elektronokkal bombázzuk. (A mikroszkópiás képalkotás a visszavert vagy a másodlagos elektronok által történik.) A nagyenergiájú elektronok egy része a mintafelületbe való becsapódás során a minta atomjainak belső elektronjait kiütheti a helyükről. Ez a lyuk a külsőbb nagyobb energiájú pályákról pótlódik. Az elektronok helycseréje folytán ún. karakterisztikus röntgensugárzás kibocsátása történik, mely jellemző az adott atomra. A karakterisztikus sugárzás mérésével a minta elemi összetétele meghatározható. Cél: Minta elemi összetételének vizsgálata. Pl. lerakódások vizsgálata a sejtfalon.

66 Optikai spektroszkópiai módszerek - Energiaszóródásos röntgen spektroszkópia (EDX) + SEM atommag Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) kilökött elektron Külső gerjesztés (pl. elektron) Kar. röntgen sugárzás Az EDX mérés elve. K α, K β, L α - adott atom karakterisztikus átmenetei.

67 Optikai spektroszkópiai módszerek - Energiaszóródásos röntgen spektroszkópia (EDX) + SEM Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) Álgesztes bükk színhatára (f: színhatár előtt, g: mögött) Egy jégkristály különböző nagyítások mellett Pollenszemcsék

68 Termikus módszerek - Termikus módszerek Mérés elve: hőközlés hatására végbemenő, fizikai kémia változások megfigyelése, mérése. Nyerhető információk: - Bomlási tulajdonságok inert vagy oxidatív atmoszférában (TGA, DTG) - Égési tulajdonságok (égési hőmérséklet, égési tulajdonságok) - Hőstabliltás vizsgálata - Tömegcsökkenéssel nem járó folyamatok vizsgálata (DTA, DSC) - Módosulatváltozás - Plasztifikálódás (pl. lignin) - Fázisátalakulás

69 Termikus módszerek - Termikus módszerek TGA: termogravimetriás analízis DTG: differenciál termogravimetria

70 Termikus módszerek - Termikus módszerek TGA: termogravimetriás analízis DTG: differenciál termogravimetria A bükkábrányi mocsári ciprus fosszíliák TG analízise összevetve az élő mocsári ciprus (control szöveteivel)

71 Termikus módszerek - Termikus módszerek DSC: differenciál termoanalizis: minta és inert minta egyidejű szabályozott felfűtése egyidejű azonos hőmérsékleten való tartással. Cél: Tömegváltozással nem járó folyamatok detektálása és tanulmányozása. 100 o C 260 o C 390 o C 410o C A bükkábrányi mocsári ciprus fosszíliák DSC analízise összevetve az élő mocsári ciprus (control szöveteivel) DCS és DTA mintatartó és inert minta.

72 Termikus módszerek - Termikus módszerek DSC: differenciál termoanalizis: minta és inert minta egyidejű szabályozott felfűtése egyidejű azonos hőmérsékleten való tartással. Cél: Tömegváltozással nem járó folyamatok detektálása és tanulmányozása. A fosszíliák és a mocsári ciprus geszt DSC görbéjén megfigyelhető átalakulások: 100 o C víz (en.) 260 o C hemicellulóz (en.) 390 o C cellulóz (en.) 410 o C a degradációs termékek polimerizációja (ex.)