A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA

Átírás

1 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA A VÉALVADÁS VZSGÁLATA A vér fehérjéket oldott állapotban tartalmazó folyékony plazmából és ebben szuszpendált alakos elemekből (vörösvértestek, fehérvérsejtek, vérlemezkék) áll. Az alakos elemeket a plazmától centrifugálással tudjuk elkülöníteni. A frissen levett vér pár percen belül alvadni kezd, ha nem adunk hozzá valamilyen alvadásgátlót. Az alvadási folyamat a plazmában oldott alvadási faktorok aktiválódása révén a vérsejteket is tartalmazó alvadék kialakulásához vezet. Az alvadék eltávolítása után egy tiszta folyadék nyerhető, a sejteket nem tartalmazó szérum. A szérum és a plazma között az a lényeges különbség, hogy a szérumban már nincs fibrinogén, amely az alvadék képződéséhez szükséges. A klinikai vizsgálatok céljából levett vérminta kezelése attól függ, hogy milyen összetevőt kell vizsgálnunk (teljes vér, szérum, plazma vagy különböző alakos elemek). Ha szérumra van szükségünk, akkor a vért egy kezeletlen kémcsőbe gyűjtjük és hagyjuk megalvadni. Ha a teljes vért, plazmát, és/vagy az alakos elemeket akarjuk vizsgálni, akkor a vért egy olyan fecskendőbe gyűjtjük, amelyikbe előzőleg alvadásgátlót tettünk. Véralvadás és alvadásgátlók A plazma általában 3g / liter fibrinogént tartalmaz oldott állapotban. A vér akkor alvad meg, amikor a fibrinogén fibrinné alakul át, amely polimerizálódás és enzimatikus keresztbekötés után oldhatatlan fehérje hálózatot formál. A fibrinogén fibrinné alakulását egy proteolitikus enzim, a trombin végzi. A normál vér a trombin inaktív prekurzorát, a protrombint tartalmazza, melyet a vérerek károsodásakor a X-es faktor aktív formája (X a ) alakít át aktív trombinná. Az aktív X-es faktor képződése inaktív prekurzorából mind extrinsic, mind intrinsic útvonalon egy nagyon bonyolult, sok különböző plazmakomponenst érintő folyamat. A károsodott vérlemezkék fontos szerepet játszanak ebben az iniciálódási folyamatban, de az alvadás részvételük nélkül is végbemehet in vitro. (észletesebben bemutatva az előadás anyagában!) A fibrinmolekulák aggregációja csak egy úgynevezett lágy alvadék kialakulásához vezet, melyet a X-as faktor transzglutamináz aktivitása kovalens keresztkötések kialakításával stabilizál. Ez a végleges kemény alvadék. A X-as faktor aktív centrumában szulfhidril (SH) csoportot tartalmazó, kalcium ion-függő enzim. Aktiválásához trombin is szükséges. Extrinsic útvonal szövetsérülés aktiválja a 2+ protrombin ntrinsic útvonal idegen felülettel való érintkezés aktiválja a 2+ Xa faktor a 2+ trombin fibrinogén fibrin X faktor Xa faktor a 2+ A véralvadási kaszkád áttekintése Kalcium ionok szükségesek az alvadás folyamatához: a) az aktív X-es faktor (X a ) képződéséhez vezető lépések némelyikénél b) a X a faktor működéséhez a protrombin trombinná alakításánál c) az alvadékképződés végén, amikor a fibrin fonalak között az aktivált X-as faktor keresztkötéseket hoz létre. 19

2 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA + H 3 H 2 + H 3 H 2 Transzglutamináz (H 4 + ) n + H 3 H 2 H zopeptid kötés H H A X-as faktor által katalizált reakció vázlata Számos olyan szer ismert, amely megköti a kalcium ionokat a vérben, és így véralvadásgátlóként alkalmazható. Például: oxalát, citrát, etiléndiamin-tetraacetát (EDTA). Vércukorvizsgálatokhoz oxalátot használnak, általában fluoriddal kombinálva. A fluorid enzim inhibitorként hatva megakadályozza, hogy a vérben kis mennyiségben jelenlévő glikolitikus enzimek (enoláz) lebontsák a glükózt. Gyakran használt alvadásgátló a heparin, egy kb moltömegű mukopoliszacharid (glükózaminoglikán). Glükuronsav és glükózamin alternáló egységeket tartalmaz kénsavcsoportokkal, amelyek a glükózamin egységek aminocsoportjához és minden 6 hidroxil-csoportjához kapcsolódnak. Ezen kívül kénsavcsoportok kapcsolódhatnak a hexózamin 3 és az uronsav 2 hidroxiljához is. A szulfáttartalom diszacharid-egységenként megközelíti a 2.5-öt. A heparin a legtöbb sejtben megtalálható természetes alvadásgátló, legnagyobb mennyiségben a tüdő termeli. Az antitrombin alvadást gátló hatású plazmafehérje. Hatását a trombinhoz és a Xa faktorhoz kapcsolódva fejti ki. A kötődés lassú folyamat. A szervezetből származó vagy exogén eredetű heparin az antitrombin kofaktora. A heparin az antitrombin -hoz való kötődéssel jelentősen megnöveli az antitrombin affinitását a trombinhoz és a Xa faktorhoz. Ezek az alvadási faktorok elveszítik specifikus szubsztrátbontó hatásukat. Antitrombin hiányos betegnél a heparin nem tud antitrombotikus hatást kifejteni. Gyógyászati célokra a heparint marhatüdőből vagy sertésbél mukózából állítják elő. Véralvadás gátlási célból a heparin mellett alkalmazzák a piócában (Hirudo medicinalis) található hirudint is. Jellegzetessége a hirudinnak, hogy a Da tömegű fehérje sok aminodikarbonsavat (aszparaginsav, glutaminsav) tartalmaz. A heparinnal ellentétben az alvadás gátlására nincsen szüksége az antitrombin -ra. A hirudin közvetlenül a trombint gátolva fejti ki antitrombotikus hatását. Az alvadási zavarok (koagulopátiák) kimutatására használt módszerek a következő csoportokba sorolhatók: Globális tesztek (pl. 5/1. Teljes vér megalvasztás rekalcifikálással). aktor tesztek (pl. 4a. ibrinogén jelenlétének tesztelése). aktorteszteket mesterségesen előállított hiányplazmák segítségével is végezhetünk. ázistesztek (pl. 5. Trombin-idő meghatározása). Anyagok, eszközök 20

3 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA marhavér: 1 térfogat 3.8 %-os trinátrium-citráthoz 9 térfogat vénás vér desztillált víz, fiziológiás-sóoldat 1 %-os al 2 -oldat iuret-reagens (6 g K-a-tartarát, 1.5 g us 4.5H 2, 30 g ah, 1 g K 1000 ml desztillált vízben oldva) 10 mg/ml fehérje standard-oldat (marha szérum albumin) 14 %-os a 2 S 4 -oldat 6 M-os urea-oldat 20 mm-os jódacetamid-oldat (óvatosan kezelendő!), előkészítőtől kapják trombin (diagnosztikai reagens-készlet, EAAL) 37 inkubátor, fotométer, centrifuga, centrifugacsövek, kémcsőállvány, kémcsövek Kísérletek 1. Teljes vér megalvasztása rekalcifikálással (globális teszt) A műanyag centrifugacsőben kiadott vérmintából kivéve állítsa össze egy kémcsőben az alábbi elegyet; ügyelve arra, hogy a vért előtte óvatosan megkeverje: Vér (ml) iz. al-oldat (ml) al 2 -oldat (ml) Helyezze a kémcsövet 15 percig 37 -ra! Percenként figyelje meg, és végül jegyezze le, hogy mi történt! Plazma kinyerése a további kísérletekhez A műanyag centrifugacsőben kiadott vérminta maradék részét centrifugálja 10 percen keresztül 1500 fordulattal! Ezután figyelje meg a plazma (felülúszó) színét! Óvatosan, a vörösvértestek felkeveredése nélkül szívja le pipettával a plazmát és helyezze egy másik kémcsőbe! A továbbiakban ezt fogja használni. 3. eferenciasor készítése fehérjeméréshez Állítsa össze kémcsövekben az alábbi elegyeket: 1. Vak ehérje standard (ml) iz. al-oldat (ml) iuret-reagens (ml) A iuret-reagens bemérése után a kémcsövek tartalmát rázza össze, és hagyja állni 30 percig szobahőmérsékleten! Ezután fotométerrel olvassa le az oldatok abszorpcióját 540 nm-en! Az értékek ábrázolása után kapott referenciaegyenesből fogja a továbbiakban meghatározni a minták fehérjetartalmát. 4. ibrinogén jelenlétének tesztelése (faktor teszt) A fibrinogén elektroforézissel elválasztható a többi plazmafehérjétől, ekkor jól látható jelet ad a - és -globulinok között. A plazmából a 2 S 4 -oldatot használva kisózással könnyen eltávolítható. 21

4 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA a) műanyag centrifugacsövekben állítsa össze az alábbi elegyeket Plazma (ml) a 2 S 4 -oldat (ml) Desztillált víz (ml) állás 30 percig szobahőmérsékleten, 1. minta centrifugálása 3000 rpm. 5 percig 1. szupernatánst a 3. csőbe kb Desztillált víz (ml) Megnevezés a műveletek végén ibrinogén Plazma Szérum Az 1-es csőben csapadéknak kell keletkeznie. Az 1. mintát az állás után centrifugálja, majd a felülúszót pipettázza át a 3. centrifugacsőbe! Óvatosan mozgassa a csövet, nehogy felkeveredjen a csapadék! Az 1-es csőben maradó csapadékot ezután oldja vissza 1.4 ml desztillált vízzel! b) a minták fehérjetartalmának meghatározása Vegyen ki kémcsövekbe az 1., 2., 3. centrifugacsövekben lévő mintákból az alábbi módon! A centrifugacsövekben maradó elegyeket fogja felhasználni a következő (4.c fibrinogén-teszt rekalcifikálással) kísérletben. 1. ibrinogén 2. Plazma 3. Szérum Minta a 4.a) kísérletből (ml) iz. al-oldat (ml) iuret-reagens (ml) perc állás után fotometrálás 540 nm-en A referenciaegyenes (3. kísérlet) felhasználásával adja meg az 1., 2., 3. minták fehérjetartalmát, és hasonlítsa ezeket össze! c) fibrinogén-teszt rekalcifikálással Az 1., 2., 3. centrifugacsövekben megmaradt minták mindegyikéhez adjon ml al 2 - oldatot, majd inkubálja 37 -on 10 percen át! igyelje meg és jegyezze le, hogy melyikben megy végbe alvadás, és mennyi időre van szükség az alvadék képződéséhez! Hogyan magyarázza megfigyeléseit? 5. Trombin-idő meghatározása és a X-as faktor hatásának tanulmányozása (fázis teszt) A trombin-idő (TT) mérése a koagulációs teszteket végző laboratóriumok alapvető vizsgálata. A vizsgálattal a fibrinogén fibrin átalakulás rendellenességére következtethetünk. A fibrinogén alvadásának idejét a hipofibrinogenémia, diszfibrinogenémia és a fibrinogén fibrin átalakulás gátlószerei (heparin, hirudin, fibrinogén degradációs termékek (DP) és paraproteinek) befolyásolják. A plazmához adott trombin hatására fibrinogén fibrin átalakulás megy végbe. A trombin-idő (T) a trombin bemérése és a keletkező fibrinalvadék megjelenése között eltelt idő másodpercekben. Ebben a kísérletben különböző körülmények között határozzuk meg a T értékét. A jódacetamid az SH-enzimek (így a X-as faktor) általánosan használható irreverzibilis gátlószere. Hozzáadásakor az alábbi folyamat játszódik le az enzim (E) aktív centrumában: 22 E-H 2 SH + H 2 --H 2 E-H 2 -S-H 2 --H 2 + H

5 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA a) műanyag centrifugacsövekben állítsa össze az alábbi elegyeket Ügyeljen arra, hogy a plazma bemérését hagyja legutoljára, így azzal indítja el a reakciót, illetve az időmérést! Jódacetamid oldat (ml) Desztillált víz (ml) Trombin oldat (ml) al 2 -oldat (ml) Plazma (ml) nkubálja a centrifugacsöveket 37 -on! olyamatos ellenőrzéssel mérje meg mind a négy minta T értékét! A T meghatározása után inkubálja még a centrifugacsöveket 10 percig! Vizsgálja meg az alvadék minőségét! b) a minták fehérjetartalmának meghatározása entrifugálja a csöveket 10 percig 3000 fordulattal! entrifugálás után óvatosan mozgassa a csöveket, nehogy felkeveredjen a csapadék! ehérjeméréshez vegyen ki kémcsövekbe az 1., 2., 3., 4. centrifugacsövekben lévő felülúszóból az alábbi módon! A mintakivétel után a centrifugacsövekben maradó elegyeket használja majd az 5. c) kísérlethez Minta az 5.a) kísérletből (ml) iz. al-oldat (ml) iuret-reagens (ml) perc állás után fotometrálás 540 nm-en A referenciaegyenes (3. kísérlet) felhasználásával adja meg az 1., 2., 3., 4. minták fehérjetartalmát, és hasonlítsa ezeket össze! c) urea-oldhatósági teszt Az 1., 2., 3., 4. centrifugacsövekben maradt felülúszót óvatosan távolítsa el pipettával! Próbálja meg visszaoldani 1 ml 6 M-os urea-oldat hozzáadásával a keletkezett csapadékokat! Hasonlítsa össze az alvadékok urea-oldhatóságát a négy csőben! Eredményeit értékelve jellemezze mintáiban az alvadék minőségét, az alvadékképződés sebességét, és magyarázza meg tapasztalatait! Klinikai jelentőség A trombin-idő (T) meghatározása koagulométerrel és manuális módszerrel egyaránt elvégezhető. A T normál értékét legalább 5 egészséges egyén kevert (kontroll) plazmájából végzett mérésével adják meg. A diagnosztikai eljáráskor végzett meghatározásnál a módszertől függően a normál érték másodperc. (Mi a gyakorlaton más koncentrációban használjuk a trombint, ezért ettől eltérő eredményt kaphatunk!). A normál kontroll értéknél 4-5 másodperccel hosszabb T már kórosnak tekinthető. Az urea-oldékonysági teszt alkalmas az örökletes vagy szerzett X-as faktor hiányos állapot kimutatására. Kérdések 1) Mi a különbség a plazma és a szérum között? 2) Miért oldja az urea a lágy alvadékot és miért nem a térhálósított végterméket? 23

6 A VÉALVADÁS VZSGÁLATA 3) Mi a szerepe a -karboxiglutamátnak a véralvadásban? 4) Miért van szükség a a 2+ -ra a véralvadásban? 24