Zsírsavak meghatározása élelmiszerekben

Átírás

1 Zsírsavak meghatározása élelmiszerekben Készítette: Dudás Vajk Géza Témavezető: Dr. Fekete Jenő Budapest

2 Tartalom 1. Bevezetés: Irodalom áttekintése Gázkromatográfia Gázkromatográfia alapok Lángionizációs detektor Zsírsavak Karbonsavak Lipidek: Kísérletek, módszerek Felhasznált vegyszerek: Mintaelőkészítés: Mérési módszer: Kalibráció: Eredmények és értékelésük Zsírsavak meghatározása Visszanyerés: Eltarthatóság: Vizsgálat más élelmiszerekkel Összegzés: Idézett forrásmunkák Függelék

3 1. Bevezetés: Az élelmiszerek zsírsavösszetétel meghatározása visszatérő feladat, és erre nagyon jó megoldást nyújthat a gázkromatográfia. A feladatként azt kaptam, hogy találjak egy adott berendezésre és kolonnára egy másik lehetséges módszert. A készülékem PerkinElmerClarus 500 gázkromatográf. A kolonnazebronzb-waxplus. A méréseket a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Karánaka Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékének a HPLC-csoportjánál végeztem. A Flora margarint választottam a kutatásom mintájának, mert már készült margarinra mintaelőkészítési és mérési szabvány, bár nem azok a berendezések álltak rendelkezésre. A szakdolgozat tematikája a következő: Először írok a gázkromatográfiáról. Ezután adok a zsírsavakról egy hosszabb összefoglalót.majd ismertetem a kísérletet és a módszereket. Későbbiekbenértékelem a kapott adatokat. A végén pedig összefoglalom az eredményeket. 3

4 2. Irodalom áttekintése 2.1 Gázkromatográfia 2.1.1Gázkromatográfia alapok A kromatográfia olyan elválasztási módszer, amely a vizsgálandó minta komponenseinek eltérő kölcsönhatásán alapszik, egy helyhez kötött állófázis és az ezzel érintkező mozgó fluid fázis között. (Dr. Balla, 2006)Az állófázis lehet szilárd és folyékony is, de feltétlenül kötöttnek és kölcsönhatásra képesnek kell lennie a mért komponensekkel. A mozgófázis halmazállapot lehet folyékony, szuperkritikus fluid vagy gáz. A mozgófázis halmazállapota határozza meg a kromatográfia típusát. A gázkromatográfiás kolonnáknak két alaptípusát különböztetjük meg a kolonnán lejátszódó fizikai szorpciós folyamat alapján. Vannak megoszlásos és adszorpciós kolonnák. Az előbbinél valamilyen abszorbens úgynevezett megosztó folyadék, utóbbinál valamilyen adszorbens az állófázis. Ha a szemcse kitölti a cső teljes áramlási keresztmetszetet, azt szemcsés töltetű kolonnának hívjuk. Ha a töltet a cső falán helyezkedik el, szabadon hagyva a gáz áramlását, akkor kapilláris kolonnának nevezzük. A szemcsés töltetű és a kapilláris kolonna is lehet megoszlásos vagy adszorpciós kolonna. A megosztó folyadék a megoszlásos gázkromatográfiában lehet a kapilláris cső belső falán folyadékfilmként vagy szemcsés anyag felületén, hordozón. Az előbbi az úgynevezett WCOT, a másik a SCOT. A gázkromatográf elvi berendezését az1. ábramutatja. A gázkromatográfiás elválasztás működhet izoterm és nem izoterm körülmények között. A programozott hőmérsékletű kromatográfia bevezetésének az oka, hogy csökkentsük a mérés időtartamát. A zsírsavösszetételének analízisére megfelelő lehet a gázkromatográfiás módszer, de a gázkromatográfiával csak olyan anyagok vizsgálhatók, amik illékonyak vagy 300 C-on illékonnyá tehetők. Ebből kifolyólag a zsírsavakból szükséges metil-észtereket szintetizálni, amik vizsgálhatók lesznek(csapó & Csapóné, 2003). 4

5 1. ábra gázkromatográfia elvi felépítése, forrás:(csapó & Csapóné, 2003) Lángionizációs detektor A detektoroknak különböző típusa létezik. Működési elv szerint négy csoportba sorolhatók. A hővezetéses detektorokra, ionizációs detektorokra, fotometriás detektorokra és molekulaszelektív detektorokra. A kísérleteim során ionizációs detektort használtam, abból is lángionizációsat. Ez a detektor tulajdonképpen egy hidrogénégőnek tekinthető, amelyben a láng két elektród között alakul ki. (Csapó & Csapóné, 2003)A hidrogénláng C hőmérsékleten a hidrogén is kismértékben ionizálódik, ami az elektródák között állandó alapáramot biztosít. Ha a kolonnáról szerves anyag jut a detektorba, a hidrogénlángban elégve ionok keletkeznek. Emiatt a gáz vezetőképessége és ennek megfelelően az ionáram is jelentősen megnő, ami megfelelő erősítés után regisztrálható. A detektor működését 2. ábra mutatja be. 5

6 2. ábra Hidrogén lángionizációs detektor, forrás: (Dr. Balla, 2006) 2.2 Zsírsavak Kémiai szempontból a zsírsavakat két irányból lehet megközelíteni. Egyfelől karbonsavak, másfelől lipidek. Ebben a bekezdésben mindkettőről írok Karbonsavak A karbonsavaknak olyan vegyületeket nevezzük, amelyek karboxilcsoportot tartalmaznak.(novák & Nyitrai, Szerves kémia, 1998)A karboxilcsoportban az sp 2 hibridállapotú szénatom hibrid pályái a hidroxilcsoport oxigénjének, az oxooxigénnek és hidrogénnek vagy szénatomnak atom- vagy hibrid pályáival három σ-kötést képeznek. A szénatom p z -pályája az oxigén atompályájával π-típusú kötést hoz létre, amely merőleges a σ- kötések síkjára. 6

7 A karbonsavakban a szén-oxigén kettős kötés hossza megegyezik az oxovegyületekével (0,120nm). A szén-oxigén egyszeres kötés viszont rövidebb (0,134nm), mint az alkoholokban. A karboxilcsoportok száma szerint egy- és többértékű, azaz mono-, di-, trikarbonsavakat stb. különböztethetünk meg. A többértékű savakat a karboxilcsoportok viszonylagos helyzete szerint 1,2 vagy α-, 1,3- vagy β-, 1,4- vagy γ-dikarbonsavakraosztjuk. A karbonsavak feloszthatók még telített, telítetlen és aromás karbonsavakra a karboxilokhoz kapcsolódó szénhidrogén csoport típusától függően Nomenklatúra: Ha a karboxilcsoport szénatomját a főlánchoz tartozónak tekintjük, akkor a COOH csoportnak megfelelő utótag: sav. A karboxilcsoport szükségképpen a lánc végén helyezkedik el, ezért nem kell helyszámát megadni és a csoport szénatomját a láncba számítjuk bele. (pl.: heptánsav HOOC-[CH 2 ] 5 -CH 3 ). Ha a karboxilcsoport nem foglalható a láncba a főcsoport a karbonsav utótaggal jelöljük.a leggyakoribb karbonsavaknak van triviális neve, amit használunk is. A zsírsavak nagy része a természetben észterként található. Három típusa 1. Gyümölcsészterek: kis- és közepes szénatomszámú zsírsavak és kis- és közepes szénatomszámú egyértékű alkoholok észterei 2. Viaszok: a viaszok fő komponense nagyobb szénatomszámú zsírsavak és nagyobb szénatomszámú egyértékű alkoholok észterei 3. Zsírok, növényi olajok: nagyobb szénatomszámú telített és telítetlen zsírsavak(általában páros szénatomszámúak) glicerinnel képezett észterei Az észterek karbonsavvá és alkoholokká hidrolizálhatók savval, lúggal vagy enzimekkel. 7

8 Karbonsavak fizikai tulajdonságai: Az el nem ágazó szénláncú telített zsírsavak kilenc szénatomszámig színtelen, desztillálható folyadék. Az ennél magasabb szénatomszámúak csak vákuumban desztillálható, színtelen kristályos anyagok. A forráspont a szénatomszámmal párhuzamosan emelkedik és lényegesen magasabb, mint a molekulatömeg alapján számítani lehet. A magas forráspont oka az, hogy a karbonsavak még gázfázisban is erős hidrogénkötésekkel összekötött dimer szerkezetűek. A homológ sorozat első tagjai szúrós szagúak, a közepes szénatomszámúak kellemetlen avas vajszagúak, a magasabbak szagtalanok. A páros és páratlan szénatomszámú karbonsavak eltérő kristályrendszerben kristályosodnak. A karbonsavak vajsavig vízzel korlátlanul elegyednek, az oktánsavtól kezdődően vízben gyakorlatilag nem oldódnak. Szerves oldószerekben jól oldódnak. Az el nem ágazó telítetlen zsírsavak forráspontja és oldékonysága hasonló a telített analógjaikhoz, míg olvadáspontjuk alacsonyabb Karbonsavak kémiai tulajdonságai: Az aciditása lényegesen gyengébb, mint az ásványi savak, de az alkoholoknál erősebb. A karbonsavak aciditásuk folytán bázisokkal sókat képez. Alkálisók vízben jól oldódnak, szerves oldószerekben gyengén. A hosszabb szénláncú zsírsavak nátrium- és káliumsói a szappanok. A karboxilátanionbázicitása jelentős nukleofilitással párosul, így könnyen vehet részt nukleofil szubsztitúciós reakciókban, mint az észterezés Észterek: Az észterek a karbonsavakból a karboxilcsoport hidrogénjének szénhidrogéncsoportra vagy hidroxilcsoportjánakalkil- vagy ariloxicsoportra történő cseréjével levezethető vegyületek. 8

9 Elnevezés: Ha a molekulában az észter funkcióscsoportja a főcsoport, akkor előtagként megnevezzük az R csoportot, majd utótagként a savmaradékot. pl: metil-palmitát Az észterekben a szén-oxigén kettős kötés hossza megegyezik az oxovegyületekével, a szén-oxigén egyszeres kötés rövidebb, mint az alkoholokban. A monokarbonsavak metil- és etil-észterei 15 szénatomig szobahőmésékleten folyadékok. Vízben alig, szerves oldószerekben jól oldódnak. A nagyobb szénatomszámú észterek szilárdak, a glicerin észterei olajos-félszáraz konzisztenciájú Lipidek: Az élőszervezetekben előforduló vízben és poláros oldószerekben alig oldódó vegyületek, amelyeket apoláris oldószerekkel vonhatunk ki. (Novák, Nyitrai, & Hazai, Biomolekulák kémiája, 2001)Szerkezetüket tekintve egymástól nagyon eltérő vegyületcsoportok, amelyeket hagyományosan az élőlények szervezetében betöltött szerepük alapján osztályozunk. 1. Egyszerű lipidek a. Neutrális zsírok (zsírok, növényi olajok) b. Viaszok 2. Összetett lipidek a. Poláros lipidek (foszfolipidek) b. Szfingolipidek c. Glikolipidek, Glicerinéterek d. Egyéb összetett lipidek(terpenoidok, szteroidok, stb.) Kísérletem során a neutrális zsírokkal foglalkoztam. Általában glicerin legtöbbször páros szénatomszámú 4-30 szénatomot tartalmazó karbonsavval képzett észtereként fordul elő, amit a trigliceridnek nevezünk. 9

10 Az állati sejtekből nyert zsírok egyenes láncú telített karbonsavak és 1-6 szén-szén kettős kötést tartalmazó telítetlen karbonsavakat tartalmaznak. Közülük a legelterjedtebb a palmitinsav (C 16 ), sztearinsav (C 18 ) és az olajsav (C 18, egy kettős kötéssel). A telítetlen zsírsavakban a szén-szén kettős kötés cisz-konfigurációjú. Az transz-konfigurációjú kettős kötést tartalmazó zsírsav ritka. A telítetlen zsírsavak jelölésére egyszerű kódokat használunk, amelyben feltüntetjük a szénatomok számát, a kettős kötések számát és a karboxilcsoporttól legtávolabbi kettős kötés távolabbi pillératomjának helyzetét a láncvégi metilcsoporttól számozva. Például az olajsav jelölése: [18:1 n-9] A növényi sejtekből nyert zsírok (olajok) összetétele változatosabb. Tartalmazhatnak szén-szén hármaskötést, hidroxil- és oxocsoportokat, valamint ciklopropán és ciklopentán gyűrűket is. A szobahőmérsékleten szilárd triglicerideket zsíroknak, a folyadék állagúakat olajoknak hívjuk. A zsírok olvadáspontja a szénlánc hosszától, valamint a telített és telítetlen zsírsav arányától függ. Minél nagyobb a telített zsírsavak aránya, annál magasabb a zsír olvadáspontja, minél több telítetlen zsírsavat tartalmaz a zsír, annál alacsonyabb hőmérsékleten dermed. zsírsavat tartalmaz a zsír, annál alacsonyabb hőmérsékleten dermed. A telítetlen kötés jelenléte megváltoztatja a zsírsav térbeli szerkezetét. Míg a telített láncban a kötések mozgékonysága folytán végtelen számú konfiguráció alakulhat ki, a kettős kötés korlátozza a két szomszédos szénatom forgását és helyén a lánc meghajlik. A kettős kötés transz konfigurációja nem befolyásolja lényegesen a lánc lefutását. A természetes zsírsavakban a cisz konfiguráció labilisabb, a stabilabb transz alak konfigurációja viszont megegyezik a telítettével. Az élőlényekben a zsírsavak a szénhidrát lebontásával képződő acetil-koenzim-a-ból kiindulva épülnek. (Novák, Nyitrai, & Hazai, Biomolekulák kémiája, 2001)A többlépéses reakciósor első lépésében a karboxil-transzferáz enzim malonil-koenzim-a-t készít, amit a transzaciláz enzim proteinhez köt. A képződött malonil-acp reagál az acetil-koenzim-abóltranszaciláz hatására keletkezett acetil-acp-vel a szintetáz enzim katalizálta reakcióban. A reakciótermékét, a 3-ketobutiril-ACP-t a reduktáz enzimrendszer 3-hidroxi-butiril-ACP-vé redukálja, amiből a víz elemeinek eliminációjával but-2-enoil-acp keletkezik. Az utóbbit egy reduktáz enzimrendszer butiroil-acp-vé alakítja. A butiroil-acp kapcsolása acetil-acp- 10

11 velaz előzőekben tárgyalt típusú lépéseken keresztül hexanoil-acp-t eredményez, aminek további enzimkatalizált reakciói a tárgyalt páros szénatomszámú telített zsírsavakat adja. A telített zsírsavakból a deszaturáz enzim összetett reakcióban telítetlen zsírsavakat képez. A telítetlen zsírsavak három sorozata különös jelentőségű. Az úgynevezett n-9 sorozat alapmolekulája a szinte minden zsiradékban megtalálható olajsav. Az olajsavból enzimkatalizált dehidrogénezéssel (6cisz,9cisz)-oktadekadiénsav képződik, amiből lánchosszabítássalejkozadiénsavat kapunk. Az utóbbiból dehidrogénezéssel a sorozat utolsó tagja az ejkozatriénsav keletkezik. Az állati sejtek nem képesek olyan zsírsavakat szintetizálni, amelyekben a kettős kötés a karboxilcsoporttól több mint kilenc szénatom távolságra van. A metilcsoport felől számítva hányadik szénatomon kezdődik az első kettős kötés, ω9-, ω6-, ω3-zsírsavcsaládok különböztethetünk meg. Számunkra is az ω6 és ω3sorozat alapmolekulái, a linolsav és a linolénsav és a belőlük levezethető arachidonsav és EPA eszenciális zsírsavak, azaz a táplálékkal kell felvennünk. Ugyanúgy nem tudunk linolsavbóllinolénsavat előállítani. Ezeket az átalakításokat csak a növényi sejtek és tengeri fitoplanktonok végzik. Szerencsére a linolsav előfordul a növényi magvakban és a belőlük készült olajokban (szója-, napraforgóolaj ). Az ω6 sorozatnál a linolsav kettős kötés beépüléssel és lánchosszabbítással dihomo-γlinolénsavvá alakul, majd további kettős kötés bevitellel arachidonsavat kapunk. Az ω3 sorozatban a linolénsav a fenti tipusú átalakításokkal ejkozatetraénsavon keresztül ejkozapentaént (EPA) ad. Az EPA-ból egymást követő lánchosszabbítással és dehidrogénezésseldokohexaénsav keletkezik Főbb funkcióik: 1. raktározott üzemanyag 2. a fehérjékkel közösen membránok alkotórészei 3. sejtmembrán borító védőanyag 4. bioaktív vegyületek 11

12 Speciális tulajdonságaik révén az élelmiszer-előállítás fontos komponensei. Segítségükkel jellegzetes konzisztencia, aroma, aroma-visszatartó képesség és zamatérzet alakítható ki.(csapó & Csapóné, 2003) 20 szénatomszámú többszörösen telített zírsavakból hormonszerű anyagokat szintetizál a szervezet lipogenáz vagy ciklooxigenáz enzimrendszerek által irányított folyamatokban, amiknek az összefoglaló neve ejkozanoidok. Például aprosztaciklin, ami gátolja a trombociták kicsapódását, az erek űrterét tágítja és citoprotektív hatású, tromboxán, ami az erek összehúzódását és a légcső kontrakcióját váltja ki. A lipidek energia forrásai és energia tárolás anyagai. Szervezetünk az energiaigényes folyamatokban, a szénhidrátok után, a zsírokat használja fel. A trigliceridek tartaléktápanyagként előnyösek, mert a zsírsavakban a szénatomok redukált formában vannak és így oxidációjukkor sok energia nyerhető. A trigliceridek metabolikus oxidációjában több mint 37 kj/g energia szabadul fel (szénhidrátokból és fehérjékből 17 kj/g).a zsírok lebontását és felhalmozódását enzimek irányítják. Amikor fölöslegben fogyasztunk szénhidrátot, akkor a felesleg glikogénné alakul. Ha a glikogénraktár megtelik, a szénhidrát zsírrá alakul és a zsírszövetekben trigliceridként tárolódik. Egy férfi súlyának 17% triglicerid, azonban a zsírok felhalmozódásának nincs határa. Élettani szempontból nagyon fontos a szerepe a zsírsavaknak. Különösen a többszörösen telítetteknek.(seppänen-laakso, 2002) Emiatt indokolt, hogy minél több módszer legyen a zsírsavak vizsgálatára. 12

13 3. Kísérletek, módszerek 3.1 Felhasznált vegyszerek: Heptán (VebJenapharm-LaborchemieApolda) Bór-trifluorid (Aldrich 14% metanol oldat) Metanol (LhiChrosolv ) Desztillált H 2 O (készítő: ElixAdvantage 3 UV, adagoló Elix E-POD ) Nátrium-hidroxid (Merck) Nátrium-szulfát (Merck) Nátrium-klorid (Merck) 3.2 Mintaelőkészítés: Kiindulási módszeraeuropean Pharmacopoeia szabvány. A Flora margarint, amiből a mintát vettem hűtőben tároltam a saját dobozában. (Sanches-Silva, 2004)0,1 g vizsgálandó anyagot csiszolatos lombikba mérése. 2 ml 20g/l-es metanolos NaOH-t adunk hozzá(ilia, 2002). 30 percig forraljuk 140 C-os olajfürdőn visszafolyóhűtő alkalmazásával. Ez a folyamat egy elszappanosítás, ami során Na sók keletkeznek a zsírsavakból, a hő és a lúg hatására. Hűtőn keresztül 2,0 ml bór-trifluorid-oldatot adunk hozzá és további 30 percig forraljuk. Ez a folyamat egy savkatalizált észterezés. Nátrium-metoxiddal is hasonló eredményt lehet elérni, mint a bór-trifluoriddal az átészterezéskor. Habár egyes zsírsav komponenseknél kevésbé hatékony az észterezési folyamat. A Nátrium-metoxid használata a gépi mintaelőkészítésnél megszokott.(de Koning, van der Meer, & Alkema, 2001)Az észterezés során metil-észterek keletkeznek. 4 ml heptánt adunk a hűtőn keresztül és 5 percig forraljuk. A szerves oldószerekben jól oldódó metil-észtereket oldjuk bele ekkor. Lehűtjük, majd csavaros üvegben 10,0 ml telített nátrium-klorid oldattal rázzuk(tranchida, 2012). Utána még egyszer megismételjük a rázást további 10,0 ml nátrium-klorid oldattal. Ez azért szükséges, hogy a vízoldható komponenseket kimossuk a heptánból, hogy a mérést könnyítse. Ehhez még hozzáadtunk 6 ml desztillált vizet, hogy könnyebben elválasztható legyen a heptános fázis a vizestől. Felső heptános fázist vízmentes nátrium-szulfáttal megszárítjuk(indarti, 2005). Az így kapott oldat injektálható. 13

14 3.3 Mérési módszer: A mérés Perkin Elmer Clarus 500 gázkromatográf készülékkel történt. Lángionizációs detektort használtam. A felhasznált kolonnaegy Phenomenex által gyártott Zebron ZB-WAXplus típusú poláris kolonna. A kolonna hossza 300cm, átmérője 0.25mm és a rétegvastagsága 0.25µm. Működési tartomány 20-tól 250/260-ig C. A megosztó folyadék polietilén-glikol. A kiértékelést TotalChrom Navigator program és Microsoft Excel 2010 segítségével végeztem. A mérési körülmények injektálás 1:45 split arány mellett 1 µl 280 C-on. A vivőgáz hidrogén(contarini, 2013),(Cruz-Hernandez, 2013) és 1 ml/perc áramlási sebességgel áramlott. A kemence hőmérséklet programmal működött. 100 C on tartottuk 2 percig, majd 10 C/perc fűtési sebességgel felmelegítettük 240 C-ig és 14 percig tartottuk.a detektor 250 C-on, 45.0 ml/perc hidrogén és 450 ml/perc áramú levegővel működött. A legnagyobb nehézséget a megfelelő split arány eltalálása jelentette. A split arányért egy mintaáram elosztó felelős, ami a minta csak a kisebb, szükséges mennyiségét juttatja a kolonnára. A megfelelő arányt 1240 ppm-esmetil-oleát oldattal végeztem. 50-es split aránnyal kezdtem a puhatolózást, mert a korábban említett szabvány azt ajánlotta. A cél, hogy megtaláljuk azt a legkisebb split arányt, amikor még nem fronting-os a görbe. Ha túl nagy a split arány, akkor a kisebb csúcsokat nem lehet megkülönböztetni a zajtól. A3. ábrán a 40- essplit, 45-össplit és egy 50-es split arányú kromatogram látható. 3. ábraa. 40 split, b. 45 split, c

15 Ebből látszik, hogy 40-es split aránynál elég fronting-os a kromatogram. A 45-ös split arányúnál alig áll fenn ez a probléma. Az 50-esnél gyakorlatilag nincs. Ezért választottam a 45-ös split-arányt. 3.4 Kalibráció: A kalibrációs módszer használatakor a módszer érzékenységét határozzuk meg kísérletileg úgy, hogy az ismert összetételű mintát gázkromatografáljuk, és a kapott csúcsterületekből a tömeg ismeretében kiszámoljuk az érzékenységet. Így a mérendő alkotó csúcsterületét megmérve annak tömege kiszámítható.(dr. Balla, 2006) A kalibráció lehet egypontos és többpontos. Kísérlet folyamán a többpontos kalibrációt alkalmaztam, ami a jelanyagmennyiség függvény elkészítését takarja. Ha egyenes arányosságot feltételezünk, akkor meghatározhatunk egy origóból kiinduló egyenes egyenletét. Ennek két módja létezik. Az egyik, hogy különböző összetételű, de ismert koncentrációjú oldatokból azonos térfogatokat mérünk, a másik, hogy adott koncentráció mellett eltérő térfogatokat injektálunk a készülékbe. Én az előbbit használtam. A kalibrációs oldatokat Merck által gyártott metil-észterek segítségével készítettem olyan módon, hogy minden egyes észterrel körül-belül 1000 ppm-es oldatot kapjunk 10 ml-es mérőlombikban. Az észtereket heptánban oldottam, mivel a mért zsírsavak észterei is heptánban lettek extrahálva. Az első kalibrációkat csak a palmitinsav-(7. ábra), a sztearinsav- (8. ábra), az olajsav-(9. ábra), a linolsav-(10. ábra) és a linolénsav (11. ábra) metil-észtereivel végeztem el, majd később a laurinsavéval (5. ábra) és a mirisztinsavéval (6. ábra) is.a hígítási sort az 1. táblázat foglalja össze. A kalibrációs oldat kromatogramja a 4. ábra, ami egy névlegesen 200 ppm-es pont. Balról jobbra laurinsav-, mirisztinsav-, palmitinsav-, sztearinsav-, olajsav-, linolsav-, linolénsavmetil-észterei.a kalibrációs egyeneseket 0 pontból húztam. A részletes mérési eredmények és az anyagok bemérései a függelékben találhatók. 15

16 Névleges koncentráció (ppm) Törzsoldat (µl) Heptán (µl) táblázat hígítási sor 4. ábra Kalibrációs görbe 200ppm-es pontjának kromatogramja 16

17 Laurinsav kalibráció y = 0.469x R² = ábra laurinsav mérés kalibrációs egyenese Mirisztinsav kalibráció y = 0.451x R² = ábra laurinsav mérés kalibrációs egyenese 17

18 Palmitinsav kalibráció y = 0.431x R² = ábra palmitinsav mérés kalibrációs egyenese Sztearinsav kalibráció y = 0.454x R² = ábra sztearinsav mérés kalibrációs egyenese 18

19 Olajsav kalibráció y = 0.412x R² = ábra mérés kalibrációs egyenese Linolsav kalibráció y = 0.419x R² = ábra mérés kalibrációs egyenese 19

20 Linolénsav kalibráció y = 0.347x R² = ábra mérés kalibrációs egyenese 20

21 4. Eredmények és értékelésük 4.1 Zsírsavak meghatározása Aminták megmérése után a kalibrációs görbék segítségével meghatározható a zsírsavak mennyisége. Az értékeket a mintákkal egy napon mért kalibrációs sor eredményeivel számoltam. A spike-olt mintáknál a spike-olt zsírsavak mennyiségét a számolásból kihagytam. A mirisztinsav metil észteréhez tartozó alacsony csúcsterülete miatt a végső összegzésből kihagytam. A mennyiségeket az1. egyenlettel számoltam ki. g zsírsav csúcsterület 4 ml heptán hígítás 10 = 10g margarin meresekség bemérés egyenlet a zsírsav mennyiségére vonatkozó összefüggés Az ezerrel történő osztások a ppm-ből g-ba történő átváltás. A tízzel történő szorzás pedig a tíz g margarinra vonatkoztatott érték, amire azért volt szükség, mert a margarin dobozán is ebben az arányokban történik a zsírsavak megadása. A mérések nagy részében ötszörös hígítást alkalmaztam, ami 200 µl minta és 800µl heptánból áll. A 12. ábra a margarin minta kromatogramját mutatja. 12. ábra Margarin minta kromatogramja 21

22 A 2. táblázat a számolt zsírsav mennyiségek értékek átlagát, szórását és relatív szórását adja. A teljes táblázat a függelék 32. oldalán található. C12 C16 C18 C18-1 C18-2 C18-3 átlag g/10g 0,138 0,812 0,194 1,287 2,034 0,693 szórásg/10g 0,008 0,054 0,017 0,132 0,353 0,146 RSD (%) 5,878 6,617 8,843 10,251 17,357 21, táblázat A zsírsav mennyiségek átlaga, szórása és relatív szórás A számolt értékek az látszik elsőre, hogy a szénatomszám növekedésével nő a mérés relatív szórása, különösen a telítetlen zsírsavaknál. Az utóbbi azért lehetséges, mert a telítetlen kötések érzékenyek a kémiai reakcióra. Ebből kifolyólag érdemes lesz védővegyületekkel együtt végezni a minta előkészítését. Például antioxidánsokkal. A C-vitamin megfelelő lehet, mert a vizes mosással eltávolítható.az összehasonlítva a Flora margarin dobozon levő értékekkel, nagyon hasonló adatokat kaptam, amit 3. táblázatban illusztáltam. Ezáltal a módszert elfogadhatónak tarthatjuk. g/10g mért csomagon telített 1,144 1 telítetlen egyszeres 1,287 1 telítetlen többszörös 2,728 2,5 omega3 0,693 0,55 omega6 2,034 1,8 összesen 5,159 4,5 3. táblázat Összehasonlítása a mért értékeknek és a margarin dobozán levő értékeknek 22

23 4.2 Visszanyerés: Vizsgáltuk a minta előkészítés hatékonyságát is. Három margarin hasonlítottunk össze három spike-olt margarin mintával. Három különböző zsírsavra végeztem el a próbát, amik a palmitinsav, sztearinsav és az olajsav. A palmitinsav és a sztearinsavat a Supelco gyártotta. Az olajsavat a Fluka. Ezeket a mintákat tízszeresre hígítottam, hogy benne legyen a kalibrációs tartományban, ami 100 µl mintát és 900 µl heptánt jelent. Úgy állapítottuk meg az átalakulást, hogy a három margarin minta vizsgált zsírsavtartalmát átszámítottam 1g margarinra. Ezeknek az átlagából kiszámoltam, hogy mennyi zsírsavnak kéne lennie a spike-olt mintákban. A spike-olt mennyiségből kivonva az előző mennyiséget megkaptuk a spike-ból átalakult mennyiségét. A spike mennyiségét elosztva a bemérési tömegekkel és szorozva százzal, megkapható a visszanyerés százalékban.a kapott értékek a 4. táblázatban lett összefoglalva. Az első oszlopban az elkészítés dátum látható és a minták száma. A részletes számítások táblázatosana függelékben található a 31. oldalon. 05.máj C16 C18 C , , , , , , , , ,698 átlag 115, , ,585 (%) szórás 6,447 2,398 19,746 (%) RSD (%) 5,599 2,134 15, táblázat A minta előkészítés hatásfoka Az átlagok alapján megfelelő visszanyerést kaptunk. A 100%-nál nagyobb érték oka, hogy a metil-észterek moláris tömege nagyobb, mint a kiindulási zsírsavaké. Ezzel magyarázható, hogy nagyobb értékeket kaptunk, mint ami a margarinos dobozon szerepel. Ebből a táblázatból is látszik, hogy a telítetlen zsírsavak érzékenyebbek erre a mintaelőkészítésre, mert nagynak mondható a relatív szórás is, és az értékeket megnézve van kiugró érték. 23

24 4.3 Eltarthatóság: Kísérletek során kíváncsiak voltunk, hogy a minták eltarthatóak-e mélyhűtőben.(indarti, 2005) Ennek a vizsgálatára a standard törzsoldatot mértük le több alkalommal névlegesen 100 ppm-es (5. táblázat), 200 ppm-es (6. táblázat) hígításban és magát a törzsoldatot (1000ppm) hígítás nélkül (7. táblázat). Az április 22-ei és az április 28-ai minták azonosak. Az április 29-ei és a május 5-ei minták új hígítások. A táblázatban szereplő értékeke csúcsterületek. 100 ppm C12 C14 C16 C18 C18-1 C18-2 C máj 41,72 41,62 48,84 40,45 66,33 56,91 45,97 29.ápr 40,72 40,35 45,66 37,11 60,21 51,1 42,18 28.ápr 41,64 43,25 51,3 44,28 70,59 61,1 49,14 22.ápr 41,2 41,37 50,58 43,23 69,48 60,29 48,38 átlag 41,32 41,65 49,10 41,27 66,65 57,35 46,42 szórás 0,46 1,20 2,51 3,21 4,66 4,54 3,13 RSD(%) 1,12 2,88 5,12 7,77 6,99 7,92 6,75 5.táblázat 100 ppm-es kalibrációs oldat csúcsterületei 200 ppm C12 C14 C16 C18 C18-1 C18-2 C máj 83,38 83,1 95,96 80,24 128,02 110,18 89,27 29.ápr 88,61 88,54 103,92 88,47 140,87 121,01 99,21 28.ápr 85,66 86,26 100,98 86,07 137,68 118,07 96,22 22.ápr 81,45 81,61 96,95 82,18 128,97 111,46 91,29 átlag 84,78 84,88 99,45 84,24 133,89 115,18 94,00 szórás 3,08 3,12 3,69 3,72 6,37 5,20 4,54 RSD(%) 3,64 3,67 3,71 4,41 4,76 4,52 4,83 6. táblázat 200 ppm-es kalibrációs oldat csúcsterületei 1000 ppm C12 C14 C16 C18 C18-1 C18-2 C máj 378,45 373,63 455,65 411,62 647,85 552,54 449,45 29.ápr 370,42 372,92 459,32 412,69 649,78 555,87 453,02 28.ápr 384,4 390,13 482,05 433,97 682,85 583,31 475,92 22.ápr 380,04 382,13 464,68 416,12 654,85 557,69 455,8 átlag 378,33 379,70 465,43 418,60 658,83 562,35 458,55 szórás 5,84 8,11 11,69 10,42 16,28 14,13 11,87 RSD(%) 1,54 2,14 2,51 2,49 2,47 2,51 2,59 7. táblázat 100 ppm-es kalibrációs oldat csúcsterületei 24

25 Az 1000 ppm-es törzsoldat RSD értékeiből látszik, hogy gyakorlatilag nem változik a törzsoldat koncentrációja. A 100 ppm-es és a 200 ppm-es hígításoknál a nagyobb RSD értéket a hígításból eredő pontatlanság okozza. 4.4 Vizsgálat más élelmiszerekkel Kipróbáltam más élelmiszert, aminek márkája Family napraforgó étolaj. Ennek a vizsgálatát nem sikerült optimalizálni, de mérések bizakodásra adnak okot. Az első puhatolózások alapján a mintában palmitinsav, sztearinsav, olajsav és linolsav található, ami a 13. ábrán látható. 13. ábra Étolajminta kromatogramja 25

26 5. Összegzés: A kísérletem célja, hogy találjak egy másik módszert zsírsavak meghatározására élelmiszerekben.a mérések során találtam egy másik alkalmazást, amivel lehet vizsgálni a margarin minták zsírsavösszetételét, az adott készülék elrendezésre. A mérések során kiderült a telítettlen zsírsav-észterek relatív szórásából, hogy érzékenyebbek a minta előkészítésre, mint a telítettek, mivel érintkeznek a zsírsavak oxigénnel a folyamatban. Emiatt ez a módszer még finomításra szorul. Megoldást adhat erre, hogy a főzés közben antioxidánst adjunk hozzá. Jó választás lehet a C-vitamin, mivel a mosás során eltávolítható. További lehetséges folytatása a kutatásnak, hogy átültessük ezt a módszert más élelmiszerekre. Erre jó példa lehet a már vizsgált étolaj. A legfőbb kérdés, hogy használható-e a margarinnál működő észterezési folyamat. A munkámat nehezítette, hogy a műszerek időnként nem megfelelően működtek, például történt eltömődés a kolonnán, aminek az oka bizonytalan, emiatt szükség volt újraoptimalizálásra. A nehézségek ellenére a későbbiekben megfelelő eredményeket kaptunk. Remélem az itt megszerzett ismereteket a későbbiekben is alkalmazhatom. 26

27 Idézett forrásmunkák Contarini, G. (2013). Interlaboratory evulation of milk fatty acid composition by using different GC operating conditions. Journal of Food Composition and Analysis, 134. Cruz-Hernandez, C. (2013). Direct quantification of fatty acids in human milk by gas chromatography. Journal os Chromatography A, 175. Csapó, J., & Csapóné, Z. K. (2003). Élelmiszer-Kémia. Budapest: Mezőgazda Kiadó. de Koning, S., van der Meer, B., & Alkema, G. (2001). Automated determination os fatty acid methyl ester and cis/trans methyl ester composition of fats and oils. Journal of Chromatography A, 397. Dr. Balla, J. (2006). A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai. Budapest: Edison House Kft. Ilia, B. (2002). Development of fatty acid analysis by high-performance liquid chromatography, gas chromatography, and related techniques. Analytica Chimia Acta, Indarti, E. (2005). Direct FAME synthesisfor rapid total lipid analysis from fish oil and cod liver oil. Journal of Food Composition and Analysis, 163. Novák, L., & Nyitrai, J. (1998). Szerves kémia. Budapest: Műegyetemi Kiadó. Novák, L., Nyitrai, J., & Hazai, L. (2001). Biomolekulák kémiája. Budapest: Magyar Kémikusok Egyesülete. Sanches-Silva, A. (2004). Study of the effect of light on fatty acids of potato crisps using a gas chromatographic method. Analytica Chimica Acta, 199. Seppänen-Laakso, T. (2002). Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Analytica Chimica Acta, 40. Tranchida, P. Q. (2012). A flow-modulated comprehensive gas chromatogrpaphy-mas spectrometry method for the analysis of fatty acid profiles in marine and biological samples. Journal of Chromatography A,