GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELŐ TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZER- ÉRZÉKENYÍTŐ GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN

Átírás

1 GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELŐ TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZER- ÉRZÉKENYÍTŐ GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN DR. DÉSAKNAI SZILVIA SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA BUDAPEST, 2002

2 GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELŐ TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZER-ÉRZÉKENYÍTŐ GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN DR. DÉSAKNAI SZILVIA Programvezető: Prof. Dr. Falus András Témavezető: Dr. Sáfrány Géza Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Kopper László Dr. Sármay Gabriella Dr. Duda Ernő Bírálók: Dr. Kalabay László Dr. Pivarcsi Andor Bíráló bizottság: Prof. Dr. Varga Gábor Prof. Dr. Tímár József Dr. Prohászka Zoltán Készült a A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika c. Ph.D. program keretében Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest 2002

3 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 3 ÖSSZEFOGLALÓ... 4 SUMMARY BEVEZETÉS IRODALMI HÁTTÉR A génterápia története, fajtái Génterápiában alkalmazott vektorok Daganatok genetikai, immunológiai háttere Központi idegrendszeri daganatok sajátosságai Daganatok kezelése génterápiával Génterápia citokineket kódoló génekkel A citokin kutatás története, citokinek általános jellemzése, fajtáik Génterápia citokineket kódoló daganatsejt vakcinákkal Génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel Gyógyszer-érzékenyítő génterápia mechanizmusa Génterápia timidin-kinázzal Génterápia uracil-foszforibozil-transzferázzal Génterápia citozin-deaminázzal Bystander hatás Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja sugárterápiával CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK Sejtvonalak Adenovírus vektorok Adenovírusok fajtái, előállításuk Adenovírusok felszaporítása szuszpenziós kultúrában, vírustiter meghatározása Adenovírusokkal történő fertőzés hatékonyságának vizsgálata Kísérletek citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal Agytumoros egerek kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal és/vagy lokális besugárzással Immunrendszeri aktiváció mechanizmusa Citotoxikus T-limfociták aktivációja Immunhisztokémiai vizsgálatok CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel Statisztikai analízis Kísérletek gyógyszer-érzékenyítő génterápiával In vitro 5-fluoruracil, ganciklovir kezelés és besugárzás hatása gyógyszerérzékenyítő géneket tartalmazó Gl261 sejtekre

4 4.4.2 Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agy-, ill. szubkután tumorok kezelése 5-fluorouracillal, ganciklovirral, valamint lokális irradiációval Gyógyszer-érzékenyítő géneket tartalmazó agytumorok kezelése 5- fluorouracil és ganciklovir terápia, valamint citokin termelő daganatsejt vakcináció kombinálásával Daganatok utólagos kezelése gyógyszer-érzékenyítő génterápiával és besugárzással Statisztikai analízis EREDMÉNYEK Kezelés citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal A fertőzés hatékonyságának vizsgálata és a citokin termelés mérése Agytumorok kezelése citokineket termelő daganatsejt vakcinákkal T-limfociták aktivációjának vizsgálata Citotoxikus T-limfociták aktivációjának tanulmányozása Immunhisztokémiai vizsgálatok CD4+ és/vagy CD8+ sejtek deplécióját követő vakcináció GM-CSF-et termelő Gl261 sejtekkel Citokin termelő daganatsejt vakcináció és lokális sugárterápia kombinálása Kezelés gyógyszer-érzékenyítő génterápiával In vitro kísérletek fluorouracil/ganciklovir kezelés hatása kísérletes daganat modellen Bystander hatás vizsgálata Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja GM-CSF-et termelő daganatsejt vakcinációval Gyógyszer-érzékenyítő génterápia kombinációja lokális tumor besugárzással Daganat kezelés gyógyszer-érzékenyítő gének utólagos bejuttatásával és lokális besugárzással MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN NEMZETKÖZI FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN TARTOTT ELŐADÁSOK ÉS BEMUTATOTT POSZTEREK JEGYZÉKE IRODALOMJEGYZÉK

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Adex-CAUPTK uracil-foszforibozil-transzferáz és timidin-kináz enzimet kódoló adenovírus vektor CD citozin-dezamináz DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium FUMP fluorouridin-monofoszfát FdUMP fluorodezoxiuridin-monofoszfát GC ganciklovir Gl261 glioma 261 GM-CSF granulocita-monocita kolónia stimuláló faktor IL interleukin INF interferon LAK limfokin-aktivált killer sejt LIF leukémia inhibitor faktor LT limfotoxin PBS foszfát-puffer oldat TIL T-limfocitás infiltrátum TK timidin-kináz TNF tumor nekrózis faktor UPRT uracil-foszforibozil-transzferáz 5-FC 5-fluorocitozin 5-FU 5-fluorouracil 3

6 ÖSSZEFOGLALÓ Szerző: Dr. Désaknai Szilvia Programvezető: Prof. Dr. Falus András Témavezető: Dr. Sáfrány Géza Humán molekuláris genetika és géndiagnosztika c. program Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest, 2002 Munkánk során a génterápiás eljárások hatékonyságát tanulmányoztuk a malignus agydaganatok jelentős részét kitevő, rendkívül rossz prognózisú gliomák kezelésében. Részben a citokineket termelő daganatsejt vakcinák, részben a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását elemeztük in vitro körülmények közt és egér tumor modellen. A terápiás géneket adenovírus vektorok segítségével juttattuk a sejtekbe. Mindkét módszert lokális besugárzással is kombináltuk. Elsőként a citokin termelő tumorsejt vakcinák hatását vizsgáltuk. Eredményeink szerint a citokin szint lineárisan változik a vírus/sejt arány növelésével, így könnyen módosítható a tumorsejtek által termelt citokinek koncentrációja. Kimutattuk a citokin szint és a terápiás hatás szoros összefüggését, ami arra utal, hogy az optimális citokin koncentráció beállítása döntő fontosságú az eljárásnál. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF alkalmazásával 20-40%-os túlélést sikerült elérni. Az immunrendszeri aktiváció hátterében CD4+ limfociták, GM-CSF esetében ezenkívül CD8+ limfociták szerepét igazoltuk. Lokális besugárzással kombinálva a túlélés %-ra nőtt. Kísérleteink második felében a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását tanulmányoztuk a timidin-kináz/ganciklovir és az uracil-foszforibozil-transzferáz/5- fluorouracil rendszerek kombinálásával. Eredményeink alapján a két génterápiás rendszer együttes alkalmazása szinergista hatású volt: A kombinált 5-fluorouracil, ganciklovir kezelés sokkal nagyobb mértékben növelte az agydaganatos állatok túlélését (60-80%), mint az 5-fluorouracil (10-20%), vagy a ganciklovir (40-50%) önmagában. A lokális besugárzással történő kombináció pedig tovább javította a terápia tumorellenes hatását (90-100%-os túlélés). Vizsgálatainkkal tehát kimutattuk, hogy a citokin termelő daganatsejt vakcináció és a gyógyszer-érzékenyítő génterápia kísérletes egér tumor modellen eredményesen, nagy hatékonysággal működik, különösen lokális besugárzással kombinálva. A jövőben a génterápia a hagyományos tumorellenes módszerekkel kombinálva új utat nyithat a malignus daganatok kezelésében. 4

7 SUMMARY Author: Dr. Szilvia Désaknai Scientific coordinators: Prof. Dr. András Falus, Dr. Géza Sáfrány Ph.D. program: The bases of human molecular genetic and gene diagnosis Semmelweis University, School of Ph.D. Studies Budapest, 2002 The aim of our study was to investigate the effect of gene therapeutic methods in the treatment of gliomas, which constitute a considerable part of malignant intracranial tumors. The therapeutic effect of cytokine producing cancer cell vaccines and gene directed enzyme pro-drug therapy was studied under in vitro circumstances and in a mouse tumor model. Adenovirus vectors were used to transduce the tumor cells with the therapeutic genes. Both methods were combined with local irradiation. First, the effect of cytokine producing cancer cell vaccines was investigated. According to our findings the cytokine level produced by the vaccines is linearly related to the number of viral particles per cell, thus it is easy to alter the cytokine level secreted by the gene-modified cancer cells. Our data suggested that the anticancer effect strongly depended on the concentration of cytokines, which indicated that the determination of the optimal cytokine level was essential. Vaccines producing IL-2, IL-4, IL-12, GM- CSF cured 20-40% of the mice. CD4+ lymphocytes were involved in the antitumor response of the vaccines, GM-CSF induced CD8+ infiltration of the tumors, as well. Combining the cytokine vaccination with local tumor irradiation increased the survival up to %. Next, the effect of gene directed enzyme pro-drug therapy was studied by combining the thymidine kinase/ganciclovir and the uracil phosphoribosyltransferase/5- fluorouracil systems. Our data indicated the synergistic effect of the two different drug sensitising system: The combined treatment with both 5-fluorouracil and ganciclovir enhanced the survival of brain tumor bearing mice more efficiently (60-80%), than the single agent treatment either with 5-fluorouracil (10-20%) or with ganciclovir (40-50%) alone. Combination with irradiation increased further the anticancer effect: % of the animals survived. Our results suggest that the cytokine producing cancer cell vaccines and gene directed enzyme pro-drug therapy are very effective in experimental brain tumor model, especially applied with local irradiation. Gene therapy combined with existing anticancer modalities might open a new potential on the treatment of malignant tumors. 5

8 1 BEVEZETÉS A malignus agydaganatok, köztük a gliomák prognózisa a hagyományos kezelési módszerek mellett rendkívül rossz. A gliomák az intrakraniális tumorok mintegy 35-40%-át teszik ki. Bár ritkán metasztatizálnak, rendkívül agresszívan növekednek. A hagyományos kezelés a sebészi eltávolítást követő kemo-, ill. sugárterápiából áll. A kezelés ellenére a betegek többsége egy éven belül meghal, az ötéves túlélés pedig mindössze 5-6%. A sebészi és kemoterápiás kezelés korlátai miatt nagy jelentősége van új terápiás eljárások kidolgozásának. Az utóbbi években számos génterápiás próbálkozás történt a daganatos betegségek, köztük az agytumorok kezelésére. Ennek során a beteg tumorsejtjeit, ill. egyéb autológ sejtjeit genetikailag módosítják. Az eljárásnak a gén beviteli módszertől, a módosított sejtektől, valamint a bejuttatott génektől függően számos vállfaja létezik. A terápiás géneket beadhatják közvetlenül a tumorba, de bevihetik a betegből eltávolított, sejtkultúrában növesztett sejtekbe is, melyeket később visszaoltanak a betegbe. Génbevitelre alkalmasak a beteg műtéti úton eltávolított tumorsejtjei, vagy más autológ sejtek (pl. limfociták, fibroblasztok). Alkalmaznak ezenkívül allogén sejtvonalakat is. Ilyenkor a sejtvonal HLA antigenitásának meg kell egyeznie a beteg HLA típusával. A gének bejuttatása különböző vektorokkal történhet: pl. liposzóma, plazmid, adeno-, retrovírus. A génterápiának számos módozata ismert: pl. immunterápia citokinekkel vagy B7 kostimulátor molekulákkal, gyógyszer-érzékenyítő génterápia, antiszensz stratégia, génterápia tumor szuppresszor génekkel stb. Jelen munkánk során kétfajta génterápiás módszert vizsgáltunk a gliomák kezelésében: részben a citokineket termelő daganatsejt vakcinák, részben pedig a gyógyszer-érzékenyítő génterápia hatását tanulmányoztuk. Kísérleteinket in vitro körülmények közt, valamint egérmodellen végeztük, vektorként adenovírusokat alkalmaztunk. 6

9 A citokinek az immunrendszer tumorellenes aktivációját idézik elő, hatásukat feltehetőleg az antigénprezentáló sejtek stimulálásával fejtik ki. A vakcinációs módszer lényege, hogy a beteg műtéti úton eltávolított daganatsejtjeiből sejtkultúrát állítanak elő, az in vitro növő sejteket genetikailag módosítják citokineket kódoló génekkel, majd besugarazzák a további sejtosztódás leállítása céljából és e sejtekkel szubkután vakcinálják a beteget. A vakcináció hatására aktiválódik az immunrendszer, amely elpusztíthatja mind a műtét után visszamaradt daganatsejteket, mind a metasztázisokat. A malignus tumorok hagyományos kezelésének alapját a sebészi-, a sugár- és a kemoterápia képezi. A kemoterápiás kezelés eredményességét gyakran csökkenti a daganatsejtek citosztatikumok iránti rezisztenciája. A génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel ígéretes új módszert kínál a daganatsejtek kemoterápeutikumok iránti rezisztenciájának legyőzésére és a nem kívánt mellékhatások csökkentésére. Az eljárás során a tumorsejtekbe olyan enzimeket kódoló géneket juttatnak be, amelyek érzékenyítik azokat egyes citosztatikumokra, vagy antivirális szerekre. Ezt követően a megfelelő gyógyszerekkel végzett kezelés a tumorsejtek szelektív pusztulásához vezet. A daganatok kezelésekor célszerű az új génterápiás eljárásokat a régi, már bevált módszerekkel, így pl. lokális besugárzással kombinálni. A besugárzás hatására megkisebbedett tumor ellen az immunrendszer nagyobb hatásfokkal tudja felvenni a küzdelmet, másrészt a besugárzott tumorsejtek nekrotizálnak, e sejtekből pedig nagy mennyiségben szabadulnak fel immunogén molekulák, melyek fokozzák az immunrendszer aktivációját. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiánál alkalmazott 5- fluorouracil pedig sugárérzékenyítő hatással is rendelkezik. Kísérleteink során mindkét génterápiás eljárást lokális besugárzással kombináltuk. 7

10 2 IRODALMI HÁTTÉR 2.1 A génterápia története, fajtái Amint az 1970-es évektől egyre többet sikerült felderíteni a gének működéséről és számos öröklődő betegség hátterében álló gént azonosítottak, megkezdődtek a génterápiás kísérletek. Az első génterápiát 1990-ben, egy letális géndefektusban, adenozin-dezamináz hiányban szenvedő betegnél végezték. 1 Az eredmények biztatóak voltak, ami serkentette újabb klinikai kipróbálások létrejöttét. Azóta számos humán génterápiás vizsgálatot végeztek részben öröklődő genetikai betegségek (pl. cisztikus fibrózis, 2 hemofília 3 ); részben daganatok kezelésére. 4,5,6 Elvileg a kívánt gént be lehetne juttatni célzottan a hibás gén helyére, jelenleg azonban a gyakorlatban az irányított génbevitel még nem megoldható in vivo körülmények közt. Általában ez nem is szükséges, elegendő a gént bevinni a megfelelő sejtbe, ahol kompenzálni tudja a hiányzó vagy hibás működésű gént, illetve új tulajdonságokat hozhat létre. A gének két fő úton: ex vivo, ill. in vivo juttathatók a betegekbe. 7,8 Az első, általánosan elterjedt módszer során a betegből eltávolítják a megfelelő sejteket, laboratóriumi körülmények közt genetikailag módosítják azokat, majd visszaoltják a szervezetbe. Az in vivo eljárás alkalmával a terápiás gént tartalmazó vektort közvetlenül a betegbe injektálják. A gén bevitele a sejtekbe többféle vírus, ill. nem vírus alapú vektor segítségével történhet (ld ). A génterápiát csoportosíthatjuk a célsejtek szerint is: módosíthatók maguk a tumorsejtek, illetve a szervezet egyéb sejtjei is. Elvileg öröklődő genetikai betegségeknél alkalmazható lenne a csírasejtek génterápiája, mivel így az abból keletkező valamennyi szomatikus sejt a megfelelő géneket hordozná, ez azonban számos technikai nehézséget és etikai problémát vet fel. 8

11 2.2 Génterápiában alkalmazott vektorok A génterápia sikerében kulcsszerepe van olyan génszállító eszközök -nek, azaz vektoroknak, melyek biztonságosan, hatékonyan alkalmazhatók. A vektorok összefoglaló tulajdonságait a következő táblázat mutatja (1. táblázat). 7,9,10 Előny Hátrány Adenovírus -nem okoz komoly humán -átmeneti génexpresszió betegséget -immunrendszer aktivációja -nincs inszerciós mutagenezis -magas titerben állítható elő -nagyméretű idegen gén juttatható be Retrovírus -tartós génexpresszió -inszerciós mutagenezis -csak osztódó sejteket fertőz -alacsonyabb titerben állítható elő Adeno-asszociált vírus -nem okoz humán betegséget -kis méretű DNS fér bele Liposzóma, Plazmid -nem okoz betegséget -vírusoknál kevésbé hatékony géntranszfer 1. táblázat Génterápia során alkalmazott vektorok tulajdonságai. I. Vírus alapú vektorok Hatékony szállítóeszközök a vírusok, mivel az evolúció során sejtekbe való bejutásra és ott génjeik expressziójára specializálódtak. Az adenovírusok számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek más vektorokkal szemben: 7,10 mind a szaporodó, mind a nyugalmi fázisban levő sejteket képesek 9

12 megfertőzni; nagy titerben állíthatók elő; valamint genomjuk nem épül be a sejt DNSébe, ezáltal nem alakulhat ki inszerciós mutagenezis. Fontos, hogy embernél nem onkogén hatásúak. Fő hátrányukat viszont a szervezet vírus ellen irányuló immunreakciója adja, mely korlátozza a génexpresszió időtartamát, valamint a vektor ismételt bejuttatását Az adenovírusokat 50 különböző szerotípusba, valamint A-tól G-ig terjedően alcsoportokba sorolhatjuk. 11 Közülük az A és B újszülött állatokban onkogén potenciállal rendelkezik, a génterápiában alkalmazott, C alcsoportba tartozó ezzel szemben nem okoz tumorokat. A C alcsoport csak enyhe légúti betegséget hozhat létre embereknél. 1. ábra Adenovírusok felépítése A vírus az adenovírus receptorokon keresztül fertőzi meg a sejteket, az endoszómába kerül, majd annak lízise során kiszabadul a citoplazmába. Ezt követően a maghártyán keresztül a sejtmagba jut, ahol a vírus genom episzómális marad. A genom 36 kb nagyságú, lineáris, dupla szálú DNS molekulákból áll (1. ábra). Mindkét végén rövid, fordított, terminális ismétlődések (ITR) helyezkednek el, melyek a vírus replikációjához szükségesek. Az 5 ITR szekvenciát követően helyezkedik el az enkapszidációs szignál, mely a genom becsomagolásához nélkülözhetetlen. A genom korai (E1-E4) és késői (L1-L5) régiókból áll. A korai gének általában a vírus replikációját segítik elő, a későiek pedig struktúr fehérjéket kódolnak. Az E1 szakaszt celluláris transzkripciós faktorok írják át és a régió által kódolt proteinek részt vesznek a többi korai gén aktiválásában. Az E1b régióról kimutatták, hogy onkogén potenciállal rendelkezik. 12 Az E2a szakasz egy DNS-hez kötődő proteint, az E2b pedig a DNS 10

13 polimerázt kódolja. Az E4 géntermékek befolyásolják a virális és celluláris proteinek expresszióját, a vírus DNS replikációját. Feltehetőleg az E4 régió az E1b-hez hasonlóan onkogén tulajdonságú. 13 A génterápiánál alkalmazott adenovírusok genomját genetikailag módosítják: egyes, a replikációhoz szükséges géneket eltávolítanak annak érdekében, hogy a vírus a célsejtekben ne tudjon szaporodni. Az adenovírusok többségénél az eltávolított E1 régió helyére juttatják be az idegen gént. Egyes esetekben az E3 szakaszt is kivágják, ezáltal több hely nyerhető a genomban. Az E1, ill. E3 régiót nem tartalmazó adenovírusokat első generációs vektornak nevezik. Ezekbe mintegy 8 kb nagyságú exogén DNS vihető be. 14 Az adenovírus vektorokat általában a hasított vírus genom és a terápiás gént hordozó plazmid homológ rekombinációval állítják elő. 10,15 Az idegen gént tartalmazó transzkripciós egységet plazmidba helyezik. A plazmid tartalmazza a bal oldali ITR régiót, enkapszidációs szignált (ψ), valamint a transzgén expressziós kazettát. Az expressziós kazetta a génből, promoterből és poliadenilációs szignálból áll. A promoter megfelelő megválasztása növelheti a génexpressziót. Erős promoter például az adenovírus késői promotere, a Rous szarkóma vírus és a citomegalovírus promotere, valamint a hibrid citomegalovírus enhanszer ß aktin promoter. Szövetspecifikus promoterek segítségével pedig célzott expresszió érhető el. Az eredeti adenovírusból restrikciós enzimatikus hasítással eltávolítják a genom bal oldali részét (az 5 ITR régiót és a ψ-t). A plazmidot és a hasított vírus genomot megfelelő sejtvonalba juttatják, ahol a homológ rekombináció történik. Másik lehetséges módszer az adenovírus vektorok előállítására a plazmid szekvenciák direkt klónozása az adenovírus genomba a restrikciós helyeken keresztül. E módszer alkalmazását korlátozza az egyedi restrikciós helyek kis száma a nagyméretű genomban. Mivel az adenovírus vektorokból hiányoznak egyes, a replikációhoz szükséges gének, felszaporításuk csak olyan speciális sejtvonalakban lehetséges, mely tartalmazza azokat. Legáltalánosabban használt a besugárzással összetört adenovírus DNS-el transzformált humán embrionális vese sejtekből álló 293-as sejtvonal. 16 A felszaporítás során a vektor magas titerben termelődik, akár plakk-képző egységet is kaphatunk milliliterenként. Ez nagyságrendekkel több, mint amennyi retrovírus, vagy 11

14 mérete. 10 Gyakran használt génterápiás eszközök a retrovírusok, melyeket az 1980-as adenoasszociált vírus esetében nyerhető. Problémát jelenthet azonban a replikáció kompetens adenovírusok esetleges keletkezése a vektor és 293-as sejtek E1 régiója közti rekombinációval. Ennek csökkentésére az E1 régión kívül gyakran az E2A és E4 régióban is deléciót hoznak létre, ezáltal csökken a szekvencia homológia a vektor és a 293-as sejtek genomja közt. 17 A magas fertőzési és expressziós arány ellenére a génexpresszió időtartama korlátozott. A legtöbb esetben rövidebb, mint egy hónap, bár beszámoltak több hónapig tartó expresszióról is. Ez részben a vektor direkt toxicitásával, részben a szervezet immunreakciójával áll összefüggésben. Citotoxikus T-limfociták infiltrálják, majd elpusztítják a transzformált sejteket. Az immunreakció csökkenthető további vírusgének deléciójával. Így a harmadik generációs vektorok esetében mind az E1, E2a és E3 régiókat eltávolítják. Előállítottak már E1 és E4 deléciót tartalmazó adenovírusokat is. 17 Végül beszámoltak olyan vektorokról, melyek csak a csomagoló szekvenciát és a transzgén expressziós kazettát tartalmazták. 18 A vírus ismételt alkalmazásánál problémát jelent a szervezet humorális immunválasza a vírus kapszid proteinek ellen. A reakció dózisfüggő és immunszupresszív szerekkel gátolható. Az adeno-asszociált vírusok nagy előnye, hogy emberben nem ismert általuk kiváltott betegség. Genomjuk azonban kisméretű, ezáltal korlátozott a bevihető gén évek óta alkalmaznak. 7,10 Előnyt jelent a tartós génexpresszió, legnagyobb veszélyük viszont az esetleges karcinogén hatás. Véletlenszerűen épülnek be a genomba, a beépülés helyétől függően megzavarhatják a gének működését, ezáltal inszerciós mutagenezis révén daganatot okozhatnak. Szintén hátrányt jelent, hogy csak az osztódó sejteket képesek megfertőzni, ugyanis a maghártya feloldódása előfeltétele a sikeres transzfekciónak. A retrovírusok genomja két egyszálú RNS-ből áll, mely dupla szálú DNS-sé íródik át a fertőzött sejtben reverz-transzkriptáz enzim segítségével, majd beépül a gazdasejt DNS-ébe. Az integráció véletlenszerűen történik, bár az aktívan átíródó régiók némi előnyt élveznek. Amennyiben a vírus egy protoonkogénbe, vagy annak környezetébe épül be, fennáll tumorok kialakulásának lehetősége. Az integrálódott vírus 12

15 DNS, (az ún. provírus) a celluláris génekhez hasonlóan íródik át. A provírus a genom stabil részét képezi a sejt teljes élettartalma alatt és tovább adódik az osztódással keletkezett utódsejteknek. Ezen tulajdonságuk miatt a retrovírusok ideális vektort jelentenek a hosszú időtartamú génexpresszió számára. 2. ábra Retrovírusok felépítése Az integrálódott vírus transzkripcióját az 5 long terminal repeat (LTR) területén elhelyezkedő promoter és az enhanszer elemek irányítják, a terminációért pedig a 3 LTR felelős (2. ábra). A retrovírusok három fő gént tartalmaznak: a gag gén a core proteinek kialakításáért felelős, a pol gén a reverz-transzkriptázt, az envelope pedig az envelope fehérjéket kódolja. 10 A keletkezett primer transzkriptum adja az információt részben az új virionok genomjának számára, másrészt a gag és pol fehérjék szintéziséhez. Egy másik, hasítással keletkezett transzkriptum pedig az envelope proteinek felépítésében vesz részt. A virionok genomjának becsomagolásához a gag régió kezdetén található ún. enkapszidációs szignál (ψ) szükséges. Vektorként elsősorban az egér leukémia vírust használják. A struktúr gének helyére építik be a kívánt gént, így a vírus önálló replikációra képtelen. A felszaporításhoz ún. csomagoló sejtvonalra van szükség, mely tartalmazza a vektorból hiányzó struktúr géneket, így biztosítja a szükséges szerkezeti fehérjéket, ugyanakkor a ψ régió hiányában nem képes a saját virális RNS-ét becsomagolni. A vektor genomjának és a csomagoló sejtvonal fehérjéinek összekapcsolódásával keletkeznek az új vírusok. A felszaporítás során azonban nem érhető el olyan magas titer, mint az adenovírusoknál. A keletkezett vírusok a gazdasejtbe juttatva integrálódnak a DNS-be, de replikációra képtelenek a struktúrgének hiánya miatt. A vírus felszaporítása során azonban ritkán mégis keletkezhetnek replikáció kompetens retrovírusok, amennyiben a 13

16 vektor és a csomagoló sejtvonal genomja közt homológ rekombináció jön létre. Ennek minimálisra csökkentése érdekében továbbfejlesztették a rendszert és különböző megoldások születtek. Ezek közé tartozik például két különböző csomagoló sejtvonal használata, melyekből az egyik a gag és pol, másik az envelope fehérjéket kódolja. Ezáltal csökken a rekombináció valószínűsége. 19 A vírusok megfelelő sejtekbe juttatása elérhető az envelope proteinek genetikai módosításával (infekciós targeting), a gének célsejtben történő kifejeződése (expressziós targeting) pedig specifikus promoterek segítségével valósítható meg. A lentivírusok a retrovírusok alosztályába tartoznak. Jelentős előnyük, hogy a retrovírusoktól eltérően osztódó sejteket is képesek megfertőzni. Hatékony pomoterük révén nagyfokú génexpresszió érhető el. Egyik fő hátrányukat képezi, hogy csak alacsony titerben állíthatók elő. A herpeszvírusok közül leggyakrabban a herpesz szimplex vírus 1-es típusát alkalmazzák vektorként, mely az emberben általában enyhe lefolyású betegséget okoz. A szemen, bőrön, nyálkahártyákon bejutva, az idegvégződéseken keresztül a neuronokba kerül, amelyekben replikálódva a sejtek pusztulását okozhatja, vagy látens állapotba kerülve hosszú ideig perzisztálhat a neuronokban. Ilyenkor episzómálisan helyezkedik el a sejtmagban. A genom dupla szálú DNS molekulából áll, mely ún. U L és U S szakaszokra osztható. Mindkét szegmentumot ismétlődő szekvenciák fogják közre. A vírus litikus ciklusa az egyes gének szigorúan szabályozott, meghatározott sorrendben történő kaszkádszerű aktivációjával megy végbe. A látens állapotba kerülés mechanizmusa nem ismert egészében. A vírust neurotropizmusa és a sejtekben való perzisztálása különösen alkalmassá teszi a központi idegrendszer génterápiájára. Megfelelő genetikai módosításokkal csökkenthető citotoxicitása, valamint elérhető mind konstitutív, hosszú időtartamú; mind szabályozható, tranziens génexpresszió. 20 Bizonyos mutációkkal előállíthatók ún. feltételesen replikálódó vírusok is, melyek elsősorban a daganatsejtekben szaporodnak. 21 II. Nem vírus alapú génbevitel A génbeviteli módszerek másik csoportját a nem vírus alapú eljárások képezik. Legnagyobb előnyüket biztonságos alkalmazásuk jelenti: nem okozhatnak daganatot és 14

17 nem váltanak ki immunreakciót sem. In vitro körülmények közt általában hatékonyan működnek, in vivo azonban a vírusoknál lényegesen kisebb a transzformáció hatásfoka. In vitro alkalmazható a kálcium-foszfát precipitáció és az elektroporáció. A kálcium-foszfát precipitáció során a vegyület DNS-el alkotott csapadékát a sejtek endocitózissal felveszik. A DNS egy része a sejtmagba is bejut, ott azonban nukleázok hatására általában gyorsan lebomlik. Esetenként azonban egyes DNS molekulák beépülhetnek a kromoszómákba is. Az elektroporáció lényege, hogy a sejteket rövid időre erős mágneses térbe helyezik, melynek hatására pórusok képződnek a sejtmembránban. Ezáltal a membrán átjárhatósága megnő és DNS molekulák is átjuthatnak a pórusokon. Az in vivo transzformáció során a DNS bejuttatható közvetlenül plazmid formájában 22, valamint liposzómák 23 segítségével, illetve receptor mediált úton. Az utóbbi során a DNS-hez specifikus ligandot kapcsolnak, melyet a megfelelő sejtfelszíni receptorok felismernek, így célzott génbevitel érhető el. Új terápiás lehetőséget képez az őssejtek vektorként történő alkalmazása. Fontos felfedezés, hogy e sejtek úgy tűnik képesek felismerni a károsodott területeket és bevándorolni annak területére. Így pl. kísérletes agytumoroknál a daganattól távolra, az agy másik részére injektált őssejtek kimutathatók voltak a tumorban. A terápiás gének így a későbbiekben feltehetően célzottan a megfelelő helyre juttathatók majd. Jelenleg az őssejtes kísérletek még kezdeti stádiumban vannak, de már most rendkívül ígéretesnek tűnnek. 24 Az egyes vektorok alkalmazásánál mérlegelni kell azok előnyeit és hátrányait. Például, amennyiben egy örökletes genetikai betegségnél azt szeretnénk elérni, hogy a bevitt gén terméke egész életen át jelen legyen, célszerű retrovírust használni. Abban az esetben, ha csak időleges génexpresszióra (pl. daganatok kezelésénél) van szükségünk, adenovírusok, liposzómák, vagy csupasz DNS a megfelelőbb választás. 2.3 Daganatok genetikai, immunológiai háttere Daganatos betegségekre jellemző a sejtkeletkezés és pusztulás szabályozási zavara, aminek hátterében genetikai hibák állnak. A daganatok tehát genetikai 15

18 betegségeknek tekinthetők. 7,8 A géndefektusok lehetnek veleszületettek, vagy szerzettek. Öröklődő daganatoknál már a csírasejtekben jelen vannak (pl. retinoblasztoma), így valamennyi szomatikus sejtben megtalálhatók, ezzel szemben exogén hatásra keletkezett tumorok esetében csak a daganatsejtekben mutathatók ki. A génhibák a proliferációt elősegítő és/vagy a sejtpusztulást gátló onkogének, illetve a proliferációt gátló és/vagy a sejtpusztulást serkentő tumor szuppresszor géneknél, következhetnek be. Általában a daganatok progressziója során a géndefektusok halmozódása figyelhető meg. Az előnyös mutációval rendelkező tumorsejtek kiválogatódnak (klonális szelekció). A génállomány instabillá válása miatt egyre könnyebben jelennek meg újabb hibák, az onkogén és szuppresszor régiókon kívül egyéb gének is gyakran érintettek. A számos genetikai változás révén új tulajdonságokra tesznek szert a sejtek, melyek elősegítik növekedésüket, terjedésüket, a gazdaszervezet elleni védekezést. Bár a daganatok kialakulásában alapvetők a proliferáció és az apoptózis szabályozásában résztvevő gének hibái, ezeken kívül számos egyéb genetikai működési zavar is létrejöhet: Több daganatnál kimutatható a DNS-repair zavara (pl.: herediter nem-polipózus vastagbélrák). A repair hibája következtében megnő a mutációk kialakulásának esélye. A normál sejtekkel szemben a tumorsejtek többségénél észlelhető telomeráz aktivitás. Az enzim a mitózisok során folyamatosan rövidülő kromoszómákhoz szintetizál ismétlődő szekvenciákat, ezáltal biztosítja a tumorsejtek túlélését. Gyakran a daganatsejtek nem a vártnak megfelelően reagálnak a kemoterápiás kezelésre. Ennek hátterében olyan genetikai változások állnak, melyek képesek megvédeni a tumorsejtet számos citosztatikumtól. A multidrug rezisztencia gén terméke, az ATP-kötő transzportfehérjékhez tartozó P-glikoprotein képes bizonyos szereket kipumpálni a daganatsejtekből és ezáltal csökkenteni intracelluláris koncentrációjukat. Fontos szerep tulajdonítható a daganatok stromájának is. A stromának nem csupán passzív támasztó funkciója van, hanem képes növekedési faktorokat megkötni, tárolni, a sejtek felé jeleket továbbítani, aktiválni, inaktiválni. A tumor befolyásolja a stroma tulajdonságait is. Erre utal, hogy a primer tumornál és az áttétnél is azonos a stroma felépítése az anatómiai helytől függetlenül. A daganatsejt a környezetében 16

19 levő normál sejteket olyan faktorok termelődésére készteti, melyek saját növekedését, terjedését segítik elő. A tumorok szervezet elleni védekezésében döntő szerepe van azoknak a mechanizmusoknak, melyek révén az immunrendszer daganatellenes válaszreakcióját képes semlegesíteni. E mechanizmusok a következők lehetnek: 25,26 A tumorantigének leválnak a tumorsejtek felszínéről, ami által csökken a sejt immunogenitása. A levált szolubilis antigének reagálnak az ellenanyagokkal és az effektor immunsejtekkel, így elirányítják az immunreakciókat a tumorsejtektől. Egyes esetekben a tumor ellen termelődő ellenanyagok paradox módon a daganat növekedését idézik elő, mivel az antigénekhez kötődve elfedik azokat. Gyakran csökkent az MHC molekulák expressziója, amit különböző mutációk okozhatnak, melyek az MHC molekulák szintézisét, vagy transzportját befolyásolják. A citotoxikus T-limfociták az MHC-hez kapcsolt antigéneket ismerik fel, MHC hiányában így elmarad a tumorsejtek felismerése. Sok esetben csökkent a B7 kostimulátor molekulák expressziója. Egyes tumorok az immunrendszer működését gátló citokineket, pl. IL-10-et, TGF-ß-át termelnek. Leírták Fas ligand megjelenését is a tumorsejtek felszínén, ami apoptózist indukálhat a tumort infiltráló limfocitáknál. 2.4 Központi idegrendszeri daganatok sajátosságai A központi idegrendszer megkülönböztetett szerepet foglal el az immunrendszerben. Ebben fontos szerepet játszik egy speciális endoteliális szerkezet, a vér-agy gát, mely meggátolja bizonyos makromolekulák, vírusok és sejtek agyba történő bejutását. Jellemző sajátosság még a nyirokkeringés hiánya, valamint az MHC molekulák csökkent expressziója. Mindezek ellenére azonban bizonyított, hogy a T limfociták képesek átjutni a vér-agy gáton. 27 Az intrakraniális daganatok mintegy 35-40%-át alkotó gliomáknál több genetikai változást írtak le. 5 Ezek közül gyakoriak a p53 gén mutációi, valamint az EGFR gén amplifikációja. Az EGFR fokozott expresszióját a gliomák 40%-ánál írták le. A 17

20 tumorsejtek által termelt növekedési faktorok, valamint citokinek elősegítik a tumor növekedését és gátolják a szervezet immunrendszerének aktivációját. Számos esetben megfigyelték a PDGF, IGF, VEGF, TNF-α, IFN-ß, TGF-ß fokozott termelődését glioma sejtekben. 2.5 Daganatok kezelése génterápiával Sajnálatos módon a hagyományos eljárásokkal (sebészi eltávolítás, kemo-, sugárterápia) a daganatos betegeknek csak kevesebb, mint fele gyógyítható 7. E tény a kutatókat újabb eljárások kifejlesztésére ösztönözte. Mivel a daganatok tulajdonképpen genetikai betegségeknek tekinthetők (ld. 2. 3), kézenfekvő a génterápiás módszerek alkalmazása. A daganatok hátterében többféle genetikai változás állhat, ezért a génterápiás módszereknek is számos vállfaja létezik. Ezek közül gyakran alkalmazott eljárás az immunterápia. Ennek során olyan molekulákat juttatnak be az immunrendszer effektor sejtjeibe vagy a tumorsejtekbe, ill. egyéb sejtekbe (pl. fibroblasztok, antigénprezentáló sejtek), melyek képesek az immunrendszer tumorellenes aktivitását fokozni. Ilyen molekulák például a citokinek (ld. részletesen 2. 6) és a B7 kostimulátor molekula. Az antigénprezentáló sejtek felszínén található B7 molekulák jelenléte fokozza az MHC antigénekkel kombinációban megjelenő idegen epitópok elleni immunválaszt. Jelenlétük elengedhetetlen az immunrendszer aktiválásához, a T-sejtek CD28, ill. CTLA-4 molekuláihoz kapcsolódnak. A B7 gént tartalmazó tumor sejtekkel történő vakcináció során megnőtt a sejtek immunogenitása, javult a terápia hatékonysága. 28 Szintén gyakran alkalmazott módszer a gyógyszer-érzékenyítő génekkel történő terápia (ld. 2. 7). Kísérletek történtek a tumor szuppresszor gének, elsősorban a p53 gén tumorsejtekbe juttatására. Kimutatták, hogy a gén képes volt megállítani a tumor növekedését és apoptózist indukált. 29 A hibás génműködés gátlásán alapuló eljárás az antiszensz stratégia, mely a nukleinsavak komplementaritásán alapul. 30,31 A génműködés gátlása két fő úton érhető el: megakadályozhatjuk a gén átíródását (anti-kód stratégia), vagy a már átíródott RNS-t gátoljuk (antiszensz stratégia). Megfelelően tervezett oligonukleotid hibridizál a gátolni kívánt DNS szakasszal, így triplex alakul ki, mely felfüggeszti az RNS-polimeráz 18

21 működését, valamint megakadályozza a szabályzó fehérjék DNS-hez kötődését. Másik lehetőség az oligonukleotid szakasz mrns-hez kötődése, mely a fehérjévé történő átírást gátolja. A komplex aktiválhatja az endogén RNáz-H-t, mely az mrns-t bontani képes. Fontos a specificitás kérdése: olyan nukleotid szekvenciát kell választani, mely a genomban csak egyszer fordul elő, ezenkívül rezisztensnek kell lennie nukleázokkal szemben, valamint előnyös, ha Rnáz-H aktiváló hatással rendelkezik. A feltételek teljesítéséhez többféle módosítást hajtanak végre az oligókon. Próbálkozások folynak tumorspecifikus ellenanyagok megfelelő vektorba építésével és azok tumorhoz szállításával is Génterápia citokineket kódoló génekkel A citokin kutatás története, citokinek általános jellemzése, fajtáik A limfokin kutatás történetét általában 1966-ig vezetik vissza, 33 mikor felfedezték az antigén expozíciónak kitett limfociták MIF termelését, mely a makrofágok működését gátolja. Ezt követte a limfotoxin kimutatása aktivált limfocita kultúra felülúszójából 1968-ban ben pedig megszületett a limfokin elnevezés azokra szolubilis faktorokra, melyeket specifikus antigénnel aktivált limfociták termelnek. Az 1970-es években fedezték fel a T-sejtek növekedésében és funkcióiban központi szerepet játszó IL-2-t. Az elsőként megismert monocita/makrofág eredetű citokin pedig 1975-ben a TNF volt. A kezdeti felfedezéseket sorra követte újabb citokinek megismerése. A folyamat napjainkban sem zárult le, folyamatosan bővül a citokinek listája. A citokinek kis molekulatömegű glikoproteidek (10-40 kda), melyek az immunválasz szabályozásában vesznek részt. 25,26 Korábban különbséget tettek limfociták és monociták által termelt faktorok közt és ennek megfelelően az előbbieket limfokineknek, az utóbbiakat monokineknek nevezték. Későbbiekben kiderült, hogy e faktorokat nemcsak az immunrendszer sejtjei képesek termelni, valamint egy faktor többféle eredetű is lehet. Ezért bevezették az általános citokin elnevezést. A citokinek a sejtek membránján elhelyezkedő citokin receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Általában parakrin úton, a környező sejtek működését befolyásolják, de visszahathatnak az azt termelő sejtre (autokrin hatás) és ritkán távolabbi sejteket is 19

22 szabályozhatnak (endokrin hatás). Jellegzetes tulajdonságuk a pleiotrópia, ami azt jelenti, hogy egy adott citokin különböző sejteknél más-más hatást fejt ki. Ennek alapja a célsejtek, illetve a jelátviteli utak sokfélesége. Ugyanakkor több, különböző citokinnek is lehet azonos biológiai hatása (redundancia jelensége). A citokineket az immunreakciókban betöltött szerepük szerint 3 fő csoportra osztjuk: az elsőbe tartozók a természetes immunitásban és gyulladásban vesznek részt, a második csoport a limfociták aktivációját és differenciálódását szabályozza, a harmadik tagjai pedig az immunsejtek érésére hatnak. 25,26 Az első csoportba, a természetes immunitásban és gyulladásban résztvevők közé sorolhatók az akut fázis reakcióban szereplő citokinek (TNFα, IL-1, IL-6). E citokineket elsősorban a makrofágok termelik nagy mennyiségben, pleiotróp hatással rendelkeznek: fokozzák a makrofágok tumorsejt-ölő aktivitását, aktiválják a neutrofil granulocitákat, stimulálják a T-sejtek citokin termelődését, B-sejtek proliferációját, ellenanyag termelését, elősegítik a fibroblasztok, endotélsejtek, epitélsejtek proliferációját, citokin termelését, a mellékveséből glükokortikoidokat, a májból akutfázis proteineket, az agyból prosztaglandinokat szabadítanak fel. Szintén a természetes immunválaszban vesznek részt az interferonok, melyek közül az α és a ß a vírussal fertőzött leukocitákból és fibroblasztokból szabadul fel, a γ-t pedig a NK-sejtek és a T-sejtek termelik. Az INFγ pleiotróp hatású, fontos szerepet játszik a mononukleáris sejtek aktiválódásában, elősegíti a citotoxikus effektor sejtek kialakulását, fokozza a NK-sejtek citotoxikus aktivitását, a B-sejtek differenciálódását, ellenanyag termelését. Számos sejten növeli az MHC antigének expresszióját. Az IL-10 több immunfunkciót gátol, így a T H 1 sejtek aktiválódását, valamint a makrofágok citotoxikus aktiválódását. Fontos viszont a B-sejtek éréséhez, ellenanyag termeléséhez. Az IL-12 részt vesz a NK-sejtek és a citotoxikus effektor sejtek aktiválásában. Serkenti a T-limfociták T H 1 sejtekké alakulását, proliferációját, valamint INFγ termelésüket. A természetes immunválaszt szabályozzák a kemokinek is. E kis molekulatömegű, szerkezetileg rokon molekulákat szinte valamennyi sejtféleség képes termelni. Részt vesznek a sejtek adhéziójának fokozásában, kemotaxis indukálásában és az effektor leukociták aktiválásában. A második csoportba, a limfociták aktivációját és differenciálódását szabályzó citokinek közé sorolható az IL-2, mely a T-sejtek fő autokrin növekedési faktora. 20

23 Elősegíti a naív T-sejtek, a T H 1 sejtek, a CD8+ effektor T-sejtek és a NK-sejtek aktiválását, citotoxikus funkcióit. Szerepe van a B-limfociták proliferációjában, differenciálódásában. Az IL-4 sokféle, különböző sejttípusra hat: gátolja a makrofágok aktivitását, elősegíti a T H 2 sejtek kialakulását, proliferációját, B-sejteken indukálja az MHC és kostimulátor molekulák megjelenését, serkenti proliferációjukat, differenciálódásukat, részt vesz a hízósejtek érésében, endotélsejteken indukálja egyes adhéziós molekulák megjelenését. A TGF-ß az immunrendszer működését általában negatív módon befolyásolja: gátolja a T-sejtek proliferációját és citokin termelését, a B- sejtek proliferációját és ellenanyag-termelését, a NK-sejtek és monociták citotoxikus funkcióit. A harmadik csoportba, az immunsejtek érésére ható citokinek közé tartozik a GM-CSF, az IL-3, melyek a granulociták, makrofágok érését segítik elő, az IL-5, mely az eozinofil granulociták érésében, aktivációjában veszt részt. A SCF a csontvelői őssejtek érésére hat, az IL-7 a B-limfociták csontvelői érését és a timociták fejlődését stimulálja. Az eddig említetteken kívül még számos egyéb citokin ismert, számuk napjainkban is folyamatosan bővül Génterápia citokineket kódoló daganatsejt vakcinákkal Egyes klinikai megfigyelések daganatok spontán regressziójáról számolnak be, ami az immunrendszer tumorellenes aktivitására utal. Sajnálatos módon azonban ez általában nem képes a tumor legyőzésére. Az utóbbi évtizedekben az immunológiai kutatások rávilágítottak a citokinek központi szerepére a daganatellenes válaszban. Szisztémás használatukat azonban súlyos mellékhatásaik, valamint gyors eliminációjuk gátolják. 34 E megfigyelések vezettek az alternatív, génterápiás eljárásokhoz, melynek során citokineket kódoló géneket juttatnak a tumor vagy egyéb sejtekbe, majd a genetikailag módosított sejtekkel vakcinálják a beteget. A daganatsejteket felismerő T-sejtek gyakran nem, vagy csak kis mennyiségben szekretálnak citokineket, ami nélkül az effektor T-sejtek proliferációja és differenciálódása kismértékű. A citokinek bejuttatása a T-sejtek környezetébe tehát elősegíti azok effektor sejtekké alakulását. Citokinekkel történő immunizálás 21

24 alkalmával valóban kimutatták CD8+ és T H 1 sejtek jelenlétét a tumorsejtek körül. 33,35,36,37 Citokinek hatására kialakul egyrészt egy lokális gyulladásos infiltrátum a tumor környezetében, de sok esetben létrejön egy szisztémás, T-sejt közvetítette tumorellenes immunreakció is, ami az eredeti tumortól távol eső helyeken is hatékony daganat elleni választ tesz lehetővé. A citokinek tumorellenes hatásában talán legfontosabb tényező, hogy a tumorantigének prezentációjának hatásfokát növelik. 33,38,39 A különböző citokinek különböző effektorsejtek révén, különböző mechanizmussal hatnak (2. táblázat). 7 Citokin Fő effektor sejtek Egyéb lehetséges effektor sejtek G-CSF Neutrofil makrofág, eozinofil, CD8+ GM-CSF CD4+, CD8+ IFN-γ CD8+ NK INF-α CD8+, NK TNF-α CD4+, CD8+ makrofág IL-1 Nincs adat nincs adat IL-2 CD8+ NK, neutrofil, eozinofil, makrofág IL-4 Eozinofil makrofág, CD8+ IL-6 CD4+, CD8+ NK, makrofág IL-7 IL-12 CD4+, CD8+, makrofág CD4+, CD8+, NK IL-18 NK CD4+, CD8+ 2. táblázat Citokinek effektor sejtjei. 22

25 Számos citokin vált ki T-sejt közvetítette immunválaszt: GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-7, 1L-12, IL-18. Az eozinofil granulociták az IL-4 fő effektor sejtjei, de részt vesznek az IL-2 által kiváltott immunválaszban is. Neutrofil granulocitáknak van szerepe a G-CSF, makrofágoknak a GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-7 esetében. Fontos kiemelni az IL-4-nél, hogy jelentősen növeli a dendritikus sejtek beáramlását a tumorba, ami magyarázhatja ezen citokin különösen hatékony daganatellenes hatását. Egyes citokinek (IFN-γ, INF-α, IL-1, IL-4) fokozzák az endotél sejteken az adhéziós molekulák expresszióját, mely elősegíti a gyulladásos sejtek szövetekbe áramlását az ereken keresztül. A citokinekkel végzett génterápia során a citokin géneket bejuttathatják magukba a tumorsejtekbe, valamint limfocitákba, fibroblasztokba, endotél- és antigénprezentáló sejtekbe. A tumorsejtek genetikai módosítása citokinekkel 4,35,36 két úton történhet: autológ sejtek esetében eltávolítják a beteg tumorát, majd a daganatsejteket in vitro körülmények közt citokint kódoló génekkel módosítják és vakcinálják velük a beteget. Végezhető az immunizálás standard, allogén sejtvonalba bejuttatott citokin gének segítségével is. Ilyenkor fontos követelmény, hogy az allogén sejtek a beteg tumorsejtjeivel közös antigéneket tartalmazzanak. A két módszer közül a második egyszerűbben megvalósítható, viszont az autológ daganatsejtekkel történő vakcináció nagyobb eséllyel aktiválja a beteg immunrendszerét. Mindkét esetben a vakcinációhoz használt tumorsejteket a betegre oltás előtt besugarazzák, annak érdekében, hogy osztódásképtelenné váljanak és ne alakuljon ki belőlük tumor. A limfociták genetikai módosítása is gyakran alkalmazott technika. 40 Előnyt jelent, hogy megfelelő stimulus hatására proliferálnak, valamint vándorolnak a szervezetben. Számos tumor esetében kimutatható T-limfocitákból álló infiltrátum (TIL), ami az immunrendszer lokális daganatellenes aktivitására utal, ezért kedvező prognosztikai jelnek tekintik. Több kutatócsoport eredményesen alkalmazott citokin génekkel transzformált TIL-t vakcinációhoz. 41 Mások endotélsejtekbe 42 juttatják be a citokin géneket. Az endotélsejtek citokineket és növekedési faktorokat képesek termelni. E sejtek több szempontból is alkalmasak génbevitelre: egyrészt in vivo körülmények közt képesek proliferációra, 23

26 másrészt a tumorok növekedéséhez alapvetően fontos angiogenezis helyén expresszálják a terápiás fehérjéket. Fibroblasztok 43,44 is felhasználhatók citokin termelésre. Gyakran a beteg autológ tumorsejtjeiből nem könnyű sejtkultúrát létrehozni. Ilyenkor egyszerűbb megoldást kínál az autológ fibroblasztok alkalmazása. Terápiás célra megfelelők az antigénprezentáló sejtek is, 45 melyek nélkülözhetetlenek a tumor reaktív T-sejtek indukálásához. A leghatékonyabb antigénprezentáló sejtek a dendritikus sejtek, melyek jelen vannak minden szövetben. Számos citokin termelésére képesek (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IFN-α, TNF-α, GM-CSF). A kutatások során fény derült a citokinek központi szerepére az tumorantigének antigénprezentáló sejtek általi bemutatásában. Feltehetőleg a dendritikus sejtek éretlen állapotban találhatók a szövetekben és a citokinek általi stimuláció révén válnak hatékony antigénprezentáló sejtté. Nem egyszerű feladat elegendő mennyiségű dendritikus sejtet izolálni, mivel a vérben található mononukleáris sejteknek mindössze 0,05-0,3%-át teszik ki. Napjainkra azonban sikerült hatékony eljárásokat kifejleszteni: dendritikus sejtek előállíthatók hemopoetikus progenitor sejtekből GM-CSF, TNF, SCF tartalmú médium hozzáadásával, vagy a perifériás vérben található sejtek GM-CSF-el és IL-4-el történő kezelésével. 2.7 Génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel Gyógyszer-érzékenyítő génterápia mechanizmusa A kemoterápiás kezelés eredményességét gyakran csökkenti a daganatsejtek citosztatikumok iránti rezisztenciája. 46 A kemoterápiás szerek dózisának növelése ugyan fokozza a tumorellenes hatást, ennek azonban gátat szab a gyógyszerek egészséges szövetekre gyakorolt toxikus hatása. Amennyiben génterápiás módszerekkel növelni tudjuk a tumorsejtek érzékenységét a megfelelő gyógyszerrel szemben, kisebb dózisnál jelentkezik a terápiás hatás, ezáltal a daganatellenes hatás fokozható, az egészséges szöveteket érő toxicitás pedig csökken. A génterápia gyógyszer-érzékenyítő génekkel ígéretes új módszert kínál a daganatsejtek kemoterápeutikumok iránti rezisztenciájának legyőzésére és a nem kívánt mellékhatások csökkentésére. Az eljárás során a tumorsejtekbe olyan enzimeket kódoló géneket juttatnak be, amelyek érzékenyítik azokat egyes citosztatikumokra, vagy antivirális szerekre. 7 Ezt követően a módosított 24

27 daganatsejtekben termelődő enzimek metabolizálják a megfelelő, szisztémásan beadott gyógyszereket. Így lokálisan, a daganatban magasabb aktív metabolit koncentráció érhető el, mint az egészséges szövetekben, ami a tumorsejtek szelektív pusztulásához vezet és egyúttal a szisztémás toxicitás is csökkenthető. A gyógyszer-érzékenyítő génterápiának számos módozata ismert. Az ún. öngyilkos génterápia során alkalmazott öngyilkos gének olyan enzimeket kódolnak, melyek normál körülmények közt nincsenek jelen az eukarióta sejtekben és képesek egyébként nem toxikus szereket toxikussá alakítani. Ezekkel a génekkel transzformált tumorsejtek elpusztulnak a többi sejtre nem toxikus szerrel végzett kezelés hatására. E csoportba sorolható a herpesz szimplex vírus eredetű timidin-kináz (TK) gén. Bejuttatásával a daganatsejtek érzékennyé tehetők a herpesz szimplex fertőzésben használt, a vírusmentes sejtekre egyébként nem toxikus ganciklovir (GC) iránt (ld ). Szintén az öngyilkos gének közé tartozik a bakteriális vagy élesztőből származó citozin-deamináz enzimet (CD) kódoló gén. Az enzim az önmagában nem toxikus 5- fluorocitozinból toxikus 5-fluoruracil-t (5-FU) állít elő (ld ). Gyógyszer-érzékenyítő hatású az E. coli eredetű uracil-foszforibozil-transzferáz (UPRT) enzim is, mely serkenti az egyik leggyakrabban használt kemoterápiás szer, az 5-FU metabolizmusát (ld ) Génterápia timidin-kinázzal A leggyakrabban alkalmazott öngyilkos génterápián alapuló gyógyszerérzékenyítő eljárás során a daganatsejteket a herpesz szimplex vírus eredetű TK génnel transzformálják. A TK enzim az antivirális szerként alkalmazott ganciklovir metabolizmusához szükséges. A vegyületet a TK ganciklovir-foszfáttá, majd a celluláris kinázok ganciklovir-trifoszfáttá alakítják (3. ábra). Ez beépül a DNS-be, ezáltal gátolja annak szintézisét. 6,47,48,49 Mivel az eukarióta sejtek nem tartalmaznak TK-t, a ganciklovir csak a gén bevitele után vált ki citotoxikus hatást. Amennyiben a TK gént szelektíven a tumorsejtekbe visszük be, ganciklovir kezelés hatására csak a transzformált sejtek pusztulnak el, az egészéges sejtek nem károsodnak. 25