OTKA K83642 számú pályázat zárójelentése

Átírás

1 OTKA K83642 számú pályázat zárójelentése A stressz hatására bekövetkező edződési, korai virágzási és elhalási folyamatok jellemzése gabonafélékben Összefoglalás Hipotézisünk szerint a különböző környezeti stresszek erősségüktől, időtartamuktól és a növények fejlődési állapotától függően edződést, korai virágzást vagy elhalást válthatnak ki. Kísérleteink célja az volt, hogy kiderítsük a redox rendszer ezen folyamatokban betöltött szerepét és az általa szabályozott anyagcsereutakat. Ozmotikus stressz, alacsony hőmérséklet, nehézfémek vagy redukáló- és oxidálószerek alkalmazásával módosítottuk a növények redox állapotát, amit az aszkorbát és a glutation redukált és oxidált formáinak mennyiségében és redukciós potenciáljában, valamint a hidrogén-peroxid koncentrációjában bekövetkezett változások jeleztek. Transzkriptomelemzéssel kimutattuk, hogy ezeket a változásokat a génkifejeződés jelentős módosulásai kísérték. A befolyásolt gének közt számos olyat találtunk, mely szerepet játszik a stresszválasz (Cbf transzkripziós faktorok génjei), a fejlődés (vernalizációs gének) és az elhalás (poli(adp-ribóz)-polimeráz génje) szabályozásában. Anyagcsereszinten a szabad aminosavak közül a glutaminsav koncentrációban bekövetkezett változásokat kell kiemelni, mivel ez az aminosav a stresszválaszban és a fejlődés szabályozásában fontos szerepet játszó glutation, prolin és putreszcin előanyaga. Eltérő stressztűrésű és fejlődési habitusú gabonagenotípusokat összehasonlítva korrelációs elemzéssel sikerült összefüggést találni a vizsgált biokémiai paraméterek változásai, a stressztűrés mértéke és a fejlődési folyamatok közt. Bevezetés A különböző környezeti stresszhatások egyik fontos következménye a reaktív oxigénszármazékok (hidrogén-peroxid, hidroxil-gyök, szuperoxid-gyök) felhalmozódása. Ezek egyrészt károsíthatják az életfontosságú makromolekulákat, másrészt viszont különböző jelátviteli utakon keresztül aktiválhatják a növény védekezési mechanizmusait és módosíthatják növekedését, valamint fejlődését (Kocsy és mtsai., 2013). Szélsőséges esetekben nagy koncentrációban felhalmozódva a sejtek elhalását is előidézhetik. A reaktív oxigénszármazékok eltávolítását az antioxidánsok végzik, melyek közül különösen fontos az aszkorbát és a glutation. A két molekula redukált és oxidált formájának mennyiségével és az ebből kiszámolható redukciós potenciállal jellemezhetjük a redox környezetet, melynek változása módosítja a redox-érzékeny gének és fehérjék aktivitását. Korábbi kísérleteinkben eltérő hidegtűrésű kukoricavonalak és eltérő fagytűrésű búzagenotípusok összehasonlításával mutattuk ki a glutation stresszválaszban betöltött szerepét. Jelen vizsgálatainkban a redox szabályozásnak a stressz hatására bekövetkező edződési, korai virágzási és elhalási folyamatokban feltételezett szerepét kívántuk tanulmányozni gabonafélékben. A redox változásokat közvetve stresszkezelésekkel (ozmotikus stressz és alacsony hőmérséklet; a hőkezelést a kísérleti rendszer egyszerűsítése érdekében kihagytuk) vagy közvetlenül vegyszeres kezelésekkel (redukáló- és oxidálószerek) idéztük elő, és az antioxidánsok és a reaktív oxigénformák mérésével mutattuk ki a levelekben és a bokrosodási csomókban. A növények redox-függő stresszválaszát és esetleges elhalását morfológiájuk, növekedésük, fotoszintézisük és életképességük vizsgálatával követtük nyomon. A virágkezdemények megjelenését a hajtástenyészőcsúcsok tanulmányozásával mutattuk ki. A bekövetkező élettani változásokat próbáltuk összekapcsolni az anyagcsere megfigyelt módosulásával a transzkriptumok (transzkriptom-elemzés) és a metabolitok (szalicilsav, szabad aminosavak, poliaminok) szintjén, hogy modellt alkothassunk a stresszválasz, virágzás és elhalás redox kontrolljáról. 1

2 A redox állapot, a fagytűrés és a génkifejeződés változása a vegetatív/generatív átmenet során búzában Vizsgálataink célja annak a kiderítése volt, hogy a redox állapot, valamint a virágzással és fagytűréssel kapcsolatos gének kifejeződése milyen mértékben változik meg a vegetatív/generatív átmenet során búzában (Boldizsár és mtsai, 2015). A mérsékelten fagytűrő Triticum aestivum ssp. aestivum cv. Chinese Spring (CS) recipiens genotípust, a kevésbé fagytűrő CS(T. ae. ssp. spelta 5A) [CS(Tsp5A)] és a nagyobb mértékben fagytűrő CS(T. ae. ssp. ae. cv. Ch 5A) [CS(Ch5A)] szubsztitúciós vonalakat hasonlítottuk össze, mivel az 5A kromoszómán találhatók a virágzást és fagytűrést szabályozó gének. A vizsgált tiolok (cisztein, glutation és hidroximetil-glutation) redukált és oxidált formáinak mennyisége és redukciós potenciálja szignifikánsan különbözött egyes fejlődési állapotokban a 3 genotípus közt. A fagytűrésben szerepet játszó gének kifejeződése hideg hatására a vegetatív fázisban emelkedett, mely változás nagyobb volt a CS-ben és a CS(Ch5A)-ban a CS(Tsp5A)- hoz képest (1. ábra). A virágzással kapcsolatos gének expressziója a vegetatív/generatív átmenettől (kettő befűződés a hajtáscsúcson) fokozatosan nagyobb lett a fagytűrőképesség egyidejű csökkenésével. Ez az eredmény a hidegedződés és a vegetatív/generatív átmenet összehangolt szabályozását jelzi. Az egyes fejlődésekben bekövetkezett redox és génkifejeződési változások közt nem találtunk összefüggést ebben a kísérleti rendszerben. 1. ábra. A virágzás szabályozásában (VRN1) és a fagytűrésben (CBF14, COR14b, COR39) szerepet játszó gének expressziós változásai a vegetatív/generatív átmenet során búzában (Boldizsár és mtsai, 2015). VP: vegetatív fázis, DR: kettős befűződés (vegetatív/generatív átmenet jele), GP: generatív fázis. Az előző bekezdésben leírt vizsgálatokat vadtípusú Triticum monococcum-ban és annak VRN1 gént nem tartalmazó deléciós mutánsában (mvp2) is elvégeztük a VRN1 gén hatásának kimutatása céljából (Boldizsár és mtsai., nem publikált adatok). A tiolok mennyisége a kettős befűződés fejlődési állapotban jelentősen magasabb volt a többihez képest, de a vadtípusú és a mutáns növények közt nem volt szignifikáns különbség sem a levélben, sem a bokrosodási csomóban. Mivel a bokrosodási csomó tartalmazza a fagytűrésben és a vegetatív/generatív átmenetben fontos szerepet játszó hajtás-tenyészőcsúcsot, ebben a szervben hasonlítottuk össze a transzkripciós mintázatot a vegetatív/generatív átmenet (kettős befűződés) és a generatív fázis (kalászkezdemények kialakulása) idején a két genotípusban oligonukleotid microarray-jel ( oligo). Az array eredmények qrt- PCR-rel történő validálása során a két módszerrel kapott eredmények közt nagy korrelációt kaptunk (r 2 =0.98). Számos olyan gént (CBFIVB, ferritin génje) találtunk, melynek kifejeződése a vadtípusban a generatív fázisban változott jelentősen, míg a mutánsban folyamatosan nagyobb/kisebb volt a vadtípusban az átmenet idején mért értéktől. Ez az eltérés a VRN1 gén szabályozó hatásával magyarázható, melynek kifejeződése az átmenet után jelentősen csökkent, a mutánsból pedig hiányzik ez a gén. A VRN1 gén deléciója befolyásolta a szalicilsav és a metabolizmusában szereplő (hidroxi)fahéjsav mennyiségét is a vegetatív/generatív átmenet során. 2

3 A redox állapot vegyszeres módosításának hatása a vegetatív/generatív átmenetre és a fagytűrésre búzában Ezekben a kísérletekben azt vizsgáltuk, hogy a redoxállapot redukáló- (aszkorbinsav, glutation) és oxidálószerekkel (H 2 O 2, glutation-diszulfid) történő közvetlen, vagy ozmotikumokkal (polietilénglikol és NaCl) történő közvetett módosítása milyen hatással van a búza fagytűrésére és virágzására (Gulyás és mtsai., 2014). Egy tavaszi fagyérzékeny (Triticum aestivum ssp. spelta, Tsp) és egy őszi fagytűrő búzagenotípus (T. ae. ssp. aestivum cv. Cheyenne, Ch) bokrosodási csomójában hasonlítottuk össze a vegyszerekkel előidézett redoxváltozásokat, melyeket a tiol és tiol-diszulfid (cisztein/cisztin, (hidroximetil)glutation/(hidroximetil)glutation-diszulfid) redoxpárok redukciós potenciáljával jellemeztünk. A legtöbb vegyszer növelte a redukciós potenciált a Ch-ban. A Tsp-ben csak a glutationnak és az aszkorbinsavnak volt ilyen hatása. A növények növekedése lelassult a kezelések miatt, de látható sérüléseket nem figyeltünk meg, valamint a fotoszintézis hatékonysága és a H 2 O 2 hajtás-tenyészőcsúcsban történő felhalmozódása sem változott. A vegyszerek hidegedzéssel történő kombinációja következtében a Ch fagytűrése nagyobb, a Tsp-é pedig kisebb lett (kivéve a Tsp-nél a H 2 O 2 -ot, NaCl-ot és a polietilén-glikolt) a mebránsérülés vezetőképességi mérésekkel történő vizsgálata alapján. A kezelések nem befolyásolták a hajtás-tenyészőcsúcs vizsgálatával nyomon követett vegetatív/generatív átmenetet a Ch-ban, viszont a NaCl és az aszkorbinsav felgyorsította azt a Tsp-ben. Számos virágzással és stresszválasszal kapcsolatos gén redox-függő változásait követtük nyomon. A vizsgált paraméterek korrelációs elemzése alapján egy modellt hoztunk létre (2. ábra), mely szerint a vegetatív/generatív átmenetet szabályozó, hőmérséklet- és redox állapot-függő ZCCT2 gén aktiválása a fagytűréssel kapcsolatos gének indukciója révén növeli a Ch fagytűrését, míg repressziója a virágzási gének befolyásolása révén gyorsítja a virágkezdemények kialakulását a Tsp-ben. 2. ábra. A redox kezelések vegetatív/generatív átmenetre és fagytűrésre búzában kifejtett hatását magyarázó modell, melyben a ZCCT2 gén központi helyet foglal el. (Gulyás és mtsai., 2014). Az ábra baloldalán a fagytűréssel, jobboldalán a virágzással kapcsolatos gének szabályozási hálózata látható. E GSH/GSSG : a glutation redukciós potenciálja. 3

4 A rövid és a hosszú távú ozmotikus stressz által előidézett szabad aminosav- és poliaminfelhalmozás összehasonlítása búza kromoszóma szubsztitúciós vonalakban A kísérletek célja az volt, hogy a stresszválaszban fontos szerepet betöltő 5A kromoszómának a rövid és hosszú távú ozmotikus stressz során a szabad aminosav-felhalmozódásra kifejtett szerepét a a CS, a Ch és a Tsp búzafajtákból előállított 5A kromoszóma szubsztitúciós vonalakban összehasonlítsuk (Kovács és mtsai., 2012). Az összes szabad aminosav-tatalom már 3 nap polietilénglikol (PEG) kezelés után is emelkedett, de nagymértékű változás csak 21 nap után volt detektálható, mely a CS(Ch5A)-ban kisebb volt a másik két genotípushoz képest. A legtöbb aminosav mennyisége egy átmeneti növekedést mutatott 3 nap ozmotikus stressz után, ahogy ez a glutaminsav esetében is megfigyelhető (3. ábra). Ezután egy folyamatos, de lassúbb növekedés volt tapasztalható a 21 napos kezelés során. A glutaminsav a glutation, a putreszcin és a prolin prekurzora, ezért felhalmozódása a 3 felsorolt vegyület fokozott szintézisét is lehetővé teszi. E feltétezésnek megfelelően a prolin koncentrációjának növekedését is megfigyeltük, mely különösen nagy mértékű volt a CS és CS(Tsp5A) genotípusokban (3. ábra). A prolin felhalmozódása azért fontos az ozmotikus stressz során, mert csökkenteni képes annak károsító hatását a sejt ozmotikus nyomásának befolyásolása révén. Számos aminosav esetében, ahogy ez a glutaminsavnál és a prolinnál is látható, eltért az akkumuláció mértéke a genetikai háttérül szolgáló CS-ben és a két szubsztitúciós vonalban. Ez azt jelzi, hogy az 5A kromoszóma stresszválaszban betöltött szerepéhez a szabad aminosavak felhalmozódásnak szabályozása is hozzátartozik. A szabad aminosavakhoz hasonlóan, a poliaminok felhalmozódása is jellegzetesen eltért a rövid és hosszú távú oxidatív stressz során. 3. ábra. Az ozmotikus stressz hatása a glutaminsav és a prolin koncentrációjára búzában (Kovács és mtsai., 2012). CS: Triticum aestivum ssp. aestivum cv. Chinese Spring, CS(Tsp5A): CS(T. ae. ssp. spelta 5A) szubsztitúciós vonal, CS(Ch5A): CS(T. ae. ssp. ae. cv. Cheyenne 5A) szubsztitúciós vonal, PEG: polietilén-glikol. A nitrogén-oxid szerepe a kukorica szabad aminosavtartalmának szabályozásában a sóstressz során Vizsgálataink célja az volt, hogy megfigyeljük az NO-szintézis módosításának hatását a sóstressz által előidézett aminosavfelhalmozásra és stressztűrésre kukoricában (Boldizsár és mtsai., 2013). NaCl hatására csökkent a kukorica hajtásának és gyökerének friss tömege. Ez a csökkenés kisebb volt az NaCl és az NO-donor együttes alkalmazása esetén, és nagyobb az NaCl és az NO-szintézist gátló L- NNA tápoldathoz történő egyidejű hozzáadásakor. Érdekes módon, NO hatására kisebb lett a glutation mennyiségének NaCl által indukált növekedése, és az NaCl kezeléstől eltérően, nem növekedett a glutation redukciós potenciálja. Az NO-kezelés következtében megváltozott a szabad aminosavak mennyisége és aránya. Ezek közül a változások közül ki kell emelni, hogy az NaCl és az NO-donor együttes alkalmazása esetén a sóstresszt követő regenerációs szakaszban jelentősen na- 4

5 4. ábra. A nitrogén-oxid szerepe a kukorica szabad prolintartalmának szabályozásában a sóstressz során (Boldizsár és mtsai., 2013). DETA/NO: NO donor, L-NNA: NO szintézis gátlója. gyobb volt a prolin mennyisége a többi kezeléshez képest (4. ábra). A prolin felhalmozódásnak fokozása jelentős szerepet játszhat az NO sóstressz elleni védőhatásában. Génkifejeződési vizsgálataink alapján a szabad aminosavak szintjének módosulása sok esetben a megfelelő gének expressziós változásaival magyarázható. A különböző hormonok hatása a redox rendszerre, a stresszválaszra és a fejlődésre búzában Ezekben a kísérletekben arra voltunk kíváncsiak, hogy az NO, a szalicilsav (SS) és az abszcizinsav (ABS) kezelések milyen hatással vannak a búza hajtásának redox állapotára, fejlődésére és stresszválaszára. A növények tápoldatához adtuk a három vegyületet vagy szintézisük gátlószereit. A 3 napos, 20/17 C-on történő ABS-kezelés hatására mind a glutation, mind a prekurzor cisztein mennyisége csökkent, mely a szintézis gátlására utal. A kezeléseket 4 napig 5 C-on folytatva az SSnek és az NO-képződés gátlásának volt hasonló hatása. Ez a két kezelés növelte a tiolok oxidált formáinak arányát is. Tehát mind a három kezelés befolyásolta a tanulmányozott tiolok redoxállapotát. Az NO, ABS, SA, valamint gátlószereik az alkalmazott koncentrációban nem voltak hatással a növekedésre, ahogy ezt a gyökerek és hajtások friss tömegének változása jelezte. Az ABS szintézisének gátlása jelentősen csökkentette a fagytűrést, mely hatás közvetítésében szerepet játszhatott a glutation mennyiségének ABS által előidézett csökkenése. Redox-érzékeny mikrorns-ek és célgénjeik azonosítása és szerepük vizsgálata Kísérleteink célja a mikrorns-eken (mirns) és a redox rendszeren alapuló szabályozó mechanizmusok kapcsolatának feltárása volt. Hidrogén-peroxiddal kezelt és kontroll búzanövények (cv. Chinese Spring) leveléből készült mikrorns- és degradom-könyvtárak következő generációs szekvenálásával történő összehasonlításával (Y. Yao pekingi laboratóriumával együttműködve) választottuk ki azokat a mirns-eket és célgénjeiket, melyeknek kifejeződése redox kotnroll alatt áll. A H 2 O 2 -vel előidézett redox változásokat a H 2 O 2, mennyiségének, az aszkorbát és a glutation redukált és oxidált formái arányának és redukciós potenciáljának mérésével monitoroztuk. 11 redox-érzékeny mirns-t és azok 15 célgénjét azonosítottuk, melyek a transzkripció, a fotoszintézis, a sejtosztódás, a fejlődés és a stresszválasz szabályozásában vesznek részt. Részletes vizsgálatra a taemir3106a-t és annak β-karotén-izomerázt kódoló célgénjét választottuk ki. Az enzim a hajtások és gyökerek 5

6 elágazását szabályozó strigolaktonok szintézisében vesz részt. A búzagénnel árpát és Arabidopsis-t transzformáltunk, a gén beépülését és kifejeződését bizonyítottuk. A homozigóta transzformánsok kiválogatása és jellemzése folyamatban van. A strigolakton-szintézissel kapcsolatos Arabidopsis mutánsokat is beszereztünk a gén funkcionális jellemzése céljából. A β -karotén-izomerázt és a zöld fluoreszcens fehérjét kódóló fúziós konstrukcióval transzformáltunk Arabidopsis-t a későbbi in situ lokalizáció, illetve FRET-en (fluorescent resonance energy transfer) alapuló fehérjekölcsönhatási vizsgálatok céljából. A génkifejeződés és az antioxidánsok in situ vizsgálata A fejlődés és a stresszválasz szabályozásának jobb megértése céljából elvégeztük a virágzást és a hidegedződést befolyásoló vernalizációs gének (VRN1, VRN3) kifejeződésének in situ vizsgálatát búzahajtás-tenyészőcsúcsokban (Boldizsár és mtsai, nem publikált eredmények). A génexpresszió jellegzetes eltéréseket mutatott a hidegkezelés és a vegetatív/generatív átmenet különböző szakaszaiban. A VRN1 gén nagy mértékű kifejeződését mutattuk ki a hajtástenyészőcsúcs középső részén a vegetatív fázisban és a kalászkezdemény kialakulása során (5. ábra). Állandó szinten kifejeződő kontrollként a foszfoglukanát-dehidrogenázt használtuk. A mikrorns-ek esetében a szabályozott célgének in situ vizsgálatához hoztuk létre a célgén és a zöld fluoreszcens fehérje génjének fúziós konstrukcióival transzformált Arabidopsis növényeket. Az anyagcseretermékek közül a glutation in situ kimutatását kezdtük el a búza-apexekben. Nehézséget okozott a minták előkészítése során a különböző reagenseknek a hajtástenyészőcsúcs vastagabb részeibe történő bejuttatása. 5. ábra. A VRN1 gén kifejeződésének in situ vizsgálata a CS(Ch5A) szubsztitúciós vonal hajtástenyészőcsúcsában. 6

7 A glutation és a fitokelatinok részvétele a nehézfémek fitoextrakciójában vízinövényekben Bár ezeket a kísérleteket nem gabonafélékben végeztük, témájuk kapcsolódik az OTKA pályázathoz, mivel a glutationból képződő fitokelatinok nehézfém-kivonásban betöltött szerepét tanulmányoztuk vízinövényekben (Török és mtsai., 2015). A témát Majdik Kornélia (Kolozsvár, Babes- Bolyai E.) megkeresésére kezdtük el, akinek PhD-hallgatója laboratóriumunkban végezte el kísérletei egy részét. A 3 vizsgált vízinövény közül a Lemna minor halmozta fel a fitokelatinokat a legnagyobb mennyiségben és polimerizációs fokban (1. táblázat). A fitokelatinok koncentrációja összefüggést mutatott a szintézisükben részt vevő anyagcseretermékek mennyiségével és enzimek aktivitásával, valamint a nehézfém-felhalmozási képességgel. 1. táblázat. A nehézfémek hatása a fitokelatinok koncentrációjára vízinövényekben (Török és mtsai., 2015). PC x : fitokelatin x polimerizációs fokkal, C: kontroll, Cd: kadmium, M: egyidejű cink + réz + kadmium kezelés. A különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan különbözők (P<5%). Következtetések 1. A búza alacsony hőmérsékleten történő vegetatív/generatív átmenete során a glutation-függő redox állapot, valamint a fagytűréssel és a virágzással kapcsolatos gének kifejeződése különbözik egymástól az eltérő fagytűrésű és fejlődési habitusú 5A kromoszóma szubsztitúciós vonalakban. 2. A virágzást szabályozó ZCCT2 fehérje génjének kifejeződése függ a redox állapottól, és összehangoltan szabályozza a hidegedződést és a virágkezdemények kialakulását búzában. 3. A szabad aminosavak és a poliaminok mind a rövid, mind a hosszú távú ozmotikus stresszhez történő alkalmazkodásban fontos szerepet tölthetnek be, amit a koncentrációik jellegzetes változásai mutatnak 3 és 21 nap stressz után. 4. Az NO befolyásolja a sóstressz során végbemenő szabad aminosav felhalmozódást, és ezen keresztül a stressztűrőképességet kukoricában. 5. A H 2 O 2 -függő mikrorns-ek célgénjeinek funkciói alapján feltételezhető, hogy a mikrorns-ek szerepet játszanak a búza fejlődésének és stresszválaszának redox szabályozásában. 6. A vízinövények nehézfém-extrakciós képessége függ a glutationból képződő fitokelatinok polimerizációs fokától. 7

8 A pályázat eredményeit bemutató impaktfaktoros cikkek: 1. Kovács Z., Simon-Sarkadi L., Vashegyi I., Kocsy G. (2012): Different Accumulation of Free Amino Acids during Short- and Long-Term Osmotic Stress in Wheat. The Scientific World Journal, ID: , 10 pages IF: 1,730; független hivatkozások száma: 2 2. Boldizsár Á., Simon-Sarkadi L., Szirtes K., Soltész A., Szalai G., Keyster M., Ludidi N., Galiba G., Kocsy G. (2013): Nitric oxide affects salt-induced changes in free amino acid levels in maize. J. Plant Physiol., 170: IF: 2,770; független hivatkozások száma: 2 3. Kocsy G., Tari I., Vanková R., Zechmann B., Gulyás Z., Poór P., Galiba G. (2013):Redox control of plant growth and development. Plant Sci., 211: IF: 4,114; független hivatkozások száma: 7 4. Gulyás Z., Boldizsár Á., Novák A., Szalai G., Pál M., Galiba G., Kocsy G. (2014): Central role of the flowering repressor ZCCT2 in the redox control of freezing tolerance and the initial development of flower primordia in wheat. BMC Plant Biology, 14:91. IF: 3, Boldizsár Á., Carrera D.Á., Gulyás Z., Vashegyi I., Novák A., Kalapos B., Pál M., Galiba G., Kocsy G. (2015): Comparison of redox and gene expression changes during the vegetative/generative transition in crowns and leaves of wheat chromosome 5A substitution lines at low temperature. Journal of Applied Genetics, doi: /s , in press. IF: 1, Török A., Gulyás Z., Szalai G., Kocsy G., Majdik C. (2015): Phytoremediation capacity of aquatic plants is associated with the degree of phytochelatin polymerization. Journal of Hazardeous Materials, doi: /j.jhazmat , in press. IF: 4,529 Összesített IF: 18,43; független hivatkozás: 11 8