Nanomedicina Szimpózium, 28 Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet
ÉLŐ SEJTBEN: BONYOLULT FEHÉRJE NANOGÉPEZETEK None decompressor H.264 decompressor Tovacsúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás H.264 decompressor H.264 decompressor Vevikulum transzport kinesinnel Fehérjeszintézis riboszómán http://multimedia.mcb.harvard.edu
MIÉRT EGYEDI MOLEKULÁK? 1. Térbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik párhuzamos útvonalakon haladó folyamatok, pl. fehérjegombolyodás G Konformációs tér Kitekeredett állapot 2. Időbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik Sztochasztikus folyamatok, pl. fluorofór pislogás Jel (a.u.) Idő (s) GFP Natív állapot GFP pislogás (Moerner) 3. Biomolekuláris mechanika Molekuláris rugalmasság, motorfehérje funkció Photo - JPEG decompressor 4. Egyedek azonosítása, követése sokaságban Egyedi mikro- Tubulusok (Borisy) Kinesin motorfehérje Térbeli és időbeli transzport útvonalak (pl. víruspartikulumok celluláris mozgása, citoszkeletális filamentumok dinamikája) Video decompressor Bakteriofágból kiszabadult DNS Aktin "speckle" mikroszkópia (Small)
EGYEDI MOLEKULÁK MECHANIKAI MANIPULÁLÁSA "Rugólapka alapú" módszer: atomerő-mikroszkóp (AFM) "Mező alapú" módszer: lézercsipesz Lézernyaláb kitérés Lézer fókusz Lézer Rugólapka elhajlás = F/k molekula Latex gyöngy Video decompressor z molekula Mozgatható mikropipetta Kellermayer, Physiol. Meas. 26, R119, 25 Kettős szálú DNS molekula megnyújtása
BIOMOLEKULÁRIS RENDSZEREK 1. Titin óriás izomfehérje 2. Rekombináns titin fragmentumok 3. Miozin vastag filamentum 4. Amiloid fibrillumok
TITIN: MOLEKULÁRIS RUGÓ AZ IZOMSZARKOMERBEN Izomköteg PEVKdomén Izomrost Miofibrillum Szarkomer Z Vékony filamentum M Vastag filamentum Z Ig-domén (7-szálú ß-hordó) Titin I-szakaszbeli szegmens tandem Ig-régió tandem Ig-régió
DOMÉNSZERKEZET A TITINBEN Ig domén PEVK szegmens egyedi szekvenciák szívizom N2-B I1 I15 N2-B I27 I84 I15 NH 2 COOH vázizom (soleus) I1 I15 I27 I79 N2-A PEVK I84 I15 NH 2 COOH I55-62 I II III konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió differenciálisan expresszálódó tandem Ig régió Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió
TITIN NANOMECHANIKA LÉZERCSIPESSZEL Nem-lineáris rugalmas erőválaszra szuperponált átmenetek 16 14 12 "Wormlike chain" (WLC) modellgörbe D A-B C Erővezérelt szerkezeti változások Erő (pn) 1 8 6 4 2 Nemlineáris rugalmasság A B F 1 2 3 4 5 6 C Domén kitekeredés Molekulahossz (µm) E Nemlineáris rugalmasság D E F Kellermayer et al. Science 276, 112, 1997 Nemlineáris WLC rugalmasság Perzisztencia hossz Erő Graphics decompressor Vég-vég távolság
TITIN NANOMECHANIKA ATOMERŐ-MIKROSZKÓPPAL Egyedi molekula erőspektroszkópia Erő-fűrészfogak: mechanikailag stabil domének nem-kooperatív kitekeredése 5 Erő (pn) 4 3 2 Erő (pn) 14 12 1 8 6.22.24.26.28.3.32.34 Megnyúlás (µm) Video decompressor 1 2 4 6 8 1 12 Kellermayer et al. BBA 164, 15, 23 Megnyúlás (nm) Molekuladinamika szimuláció, K. Schulten
REKOMBINÁNS TANDEM-IG FRAGMENTUM MECHANIKÁJA Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje E k off Tranziciós állapot Fx ß 3 2 Natív állapot Kitekert állapot Reakció koordináta 1 L 2 x ß Gyakoriság 15 2 pn 1 5 5 nm Grama et al. Croat. Chem. Acta 78, 45, 25. L = 29,8 3,5 nm 1 2 3 4 Kitekeredési erő (pn)
REKOMBINÁNS PEVK FRAGMENTUMOK MECHANIKÁJA Erő Force (pn) (pn) 12 1 8 6 4 2 Nagy et al. Biophys. J. 89, 329, 25. AFM rugólapka Au S PEVK szegmens His 6 Glymo-NTA-Ni Reverzíbilis nemlineáris erőválasz PEVKI 5 1 15 2 25 Megnyúlás Extension (nm) A PEVK domén elektrosztatikusan hangolható molekula-teleszkóp Effective persistence length (nm) Effektív perziszenciahossz (nm) 2.5 2 1.5 1.5 Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII 5 1 15 2 25 3 35 Ionic strength (mm) Ionerősség (mm) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
TITIN NANOMECHANIKA KONSTANS ERŐVEL Erővisszacsatolt lézercsipesz titin Mért jel (erő) Referencia Feedback Erő(pN) 1 2 Megnyúlás (nm) 15 1 Kitekert állapot Gyors összeesés Titin feltekeredés konstans erő alatt Szerkezeti fluktuációk Végső kontrakció Kitekeredés Mozgatható mikropipetta Szabályzás (piezo mozgás) 5 Feltekert állapot 3 4 5 6 7 8 9 x1 3 Idő(s)
MIOZIN VASTAG FILAMENTUM NANOMECHANIKÁJA Szintetikus miozin filamentum vizualizálása és manipulálása AFM-mel A repetitív erőcsúcsok periodicitása korrelál a miozin gerinc menti, elektrosztatikusan töltött régiók periodicitásával Húzás - Relaxáció -1pN # # # # 4.15 nm 11.8-1pN 2.1 28.4 36.7 45. 53.3nm 8.3 nm 2 nm Kitérés Erő -2pN 29.9 54.8 79.7 14.6 129.5nm 14.3 nm Rugólapka Lézer -1pN 59.2 87.8 116.4nm 43 nm Vastag filamentum 23 66 Megnyúlás 19 152nm csillám A reverzíbilis átmenetek (#) spontán össyezippzározódási folyamatra utalnak. Decker and Kellermayer, J.Mol.Biol. 322, 37, 28.
AMILOID FIBRILLUMOK NANOMECHANIKÁJA Amiloid ß1-4 peptid Amiloid protofilamentum Erő (pn) 4 3 2 1 2 4 6 8 1 12 14 Megnyúlás (nm) Kellermayer et al. JBC 28, 8464, 25 Count 5 4 3 2 1 Gyakoriság 1 Aβ1-4 33 pn 2 3 4 5 6 4 8 12 16 2 24 Plató erő (pn) F
AZ AMILOID SZÉTZIPPZÁROZÁS REVERZÍBILIS Erő (pn) 12 8 4 2 R Erő (pn) 3 2 1 Plató erő (pn) -2 2 4 6 8 1 Megnyúlás Extension (nm) 3 25 2 15 1 5 Erő (pn) 6 4 2-2 76 78 8 82 84 86 88 Megnyúlás (nm) 16 14 12 1 8 6 24 26 28 3 32.1 1 1 Nyújtási sebesség (µm/s) -4 2 4 6 8 1 Megnyúlás (nm) Kellermayer et al. JBC 28, 8464, 25; Karsai et al. J. Chem. Inf. Mod. 45, 1641, 25
KÖSZÖNET László Grama Tamás Huber Ünige Murvai Attila Nagy Árpád Karsai Brennan Decker Pasquale Bianco Balázs Kiss Paola Cacciafesta Zsolt Mártonfalvi András Kengyel Margit Benke Együttműködések: Penke Botond (Szeged) Henk L. Granzier (WSU) Carlos Bustamante (U.C. Berkeley) TIFF (Uncompressed) decompressor TIFF (Uncompressed) decompressor Dávid Szatmári Jusztina Kungl Károly Zieber Howard Hughes Medical Institute European Union OTKA, ETT, NKTH