Molekuláris biológus M.Sc. Prokarióták élettana Sterilezés és dezinficiálás. Alapfogalmak STERILEZÉS DEZINFICIÁLÁS DEZINFICIENS/FERTŐTLENÍTŐSZER ANTISZEPTIKUM TARTÓSÍTÓSZEREK CSÍRASZÁMCSÖKKENTŐ (SZANITÁCIÓS) HATÁS CID HATÁS SZTATIKUS HATÁS 1
A fertőtlenítő hatás fokozatai Biocid/germicid hatás Bakteriosztatikus hatás Baktericid hatás Sporosztatikus hatás Sporocid hatás Virucid hatás Fungisztatikus hatás Fungicid hatás Paraziticid hatás A baktériumpusztulás kinetikája Túlélő mikroorganizmusok száma/gram anyag (log skála) 85 C-on töltött percek Pusztulási ráta: 1 N = log t N K 0 K = pusztulási ráta t = expozíciós idő N 0 = kiindulási csíraszám N = a t expozíciós idő után túlélő mikrobák száma Túlélő mikrobaszám: N = N 0 e Behatási idő: log t = K N N 0 Kt 2
A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők I. A fertőtlenítendő anyag tulajdonsága, minősége felület milyensége, szerkezete, víztaszító képessége A fertőtlenítendő anyag szennyezettsége vér, szérum, nyák, genny, széklet, vizelet; barrier és direkt inaktiválás A letális ágens természete, tulajdonságai fizikai hatások természet és intenzitás dezinficiensek kémiai összetétel, stabilitás, vízoldékonyság, stb. A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők II. A mikroorganizmusok száma és ellenállóképessége nagyobb mikrobaszám nagyobb intenzitás, hosszabb behatási idő intenzíven növekvő populációk fizikai hatások hőenergia és ultraibolya sugárzás dezinficiensek rezisztencia mechanizmusok; optimális koncentráció Prionok (CJD, BSE) Protozoonok - Sporozoa (Cryptosporidium) Baktériumspórák (Bacillus, Clostridium) Mycobacteriumok (M. tuberculosis, M. avium) Protozoonok cisztái (Giardia) Kis méretű burok nélküli vírusok (poliovírusok) Protozoonok trophozoitái (Acanthamoeba) Gram-negatív baktériumok (Pseudomona, Provodencia) Gombák vegetatív sejtjei (Candida, Aspergillus) Nagy méretű burok nélküli vírusok (Adenovírusok) Gram-pozitív baktériumok (S. aureus, Enterococcus) Burokkal rendelkező vírusok (HIV, HBV) 3
A fertőtlenítő eljárások hatásosságát befolyásoló tényezők III. Hőmérséklet A behatási idő A fertőtlenítőszer koncentrációja C = fertőtlenítőszer koncentrációja t = egységnyi mikrobapopuláció elpusztításához szükséges idő C n t = k k = mikrobától és dezinficienstől függő reakciókonstans n = konstans (0,8-1,2) A környezeti ph mikrobák túlélése és növekedési aktivitása mikrobák felületi töltése dezinficiensek ph függő aktivitása Kétértékű kationok (Mg 2+, Ca 2+ ) jelenléte Magas hőmérséklet Jellemző értékek termális pusztulási pont (thermal death point) termális pusztulási idő (thermal death time) termális redukciós idő (thermal reduction time, D- érték) Mechanizmus fehérje denaturáció, koaguláció DNS károsodás törések a DNS láncban (nukleázok) sejtmembránok károsodása ribonukleázok aktiválása riboszóma degradáció száraz hő sejtek kiszáradása fehérje denaturáció, oxidatív sérülések 4
Nedves hő Pasztörizálás (tej, joghurt, gyümölcslevek) 30 perc, 63-66 C 15 sec, 72 C 1 sec, 134-140 C Frakcionált hőkezelés (hőérzékeny folyadékok) 30 perc, 80 C, 3x ismételve Kifőzés, áramló gőz 30 perc, 100 C Túlnyomásos telített vízgőz autokláv 1 atm, 121 C, 30 perc 2 atm, 134 C, 3 perc 5
Száraz hő Hőlégsterilizálás 140-180 C, 2-3 óra Direkt hőhatás leégetés, elégetés Indikátorok - mechanikai - kémiai - biológiai 6
Hideghatás,fagyasztás Sztatikus hatás Ismételt fagyasztás, olvasztás Intracelluláris jégkristályképzés elektrolitegyensúly felborulása, fehérje denaturáció membránkárosodás ribonukleázok, peptidázok aktiválása Tenyészetek tartósítása, tartósítása Liofilizálás Ultraibolya sugárzás 240-280 nm DNS abszorpciós maximuma 260 nm DNS károsító hatás pirimidin dimerek lánctorzulás zavar a DNS replikációban keresztkötések fotohidrációja Repair folyamatok fotoreaktiváció hidrolitikus enzimek excíziós javító mechanizmusok 7
Alacsony energiatartam Kis áthatolóképesség Helyiségek, steril fülkék levegőjének fertőtlenítése 8
IONIZÁLÓ SUGÁRZÁS H 2 O radiolízis SZABADGYÖKÖK DNS sérülés Membrán foszfolipidek károsítása Replikációs zavar Hibás fehérjeszintézis Membrán integritás elvesztése SEJTHALÁL Ultrahang és hanghullámok Nagyfrekvenciájú hullámok 20-40 khz Folyamatos nyomásváltozás üregképződés (10µm) a folyadékokban, majd a buborékok összeomlása Legérzékenyebbek a Gram-negatív baktériumok Sejtszerkezet megbontása H 2 O 2 képződés makromolekulák depolimerizációja intramolekuláris csoportátrendeződés kettős szálú törések a DNS-ben 9
Szűrés Hőérzékeny oldatok (infúziós oldatok, injekciós készítmények) - pirogén hatás kivédése Seitz-féle azbeszt szűrő porcelánszűrő diatomaföld szűrők üvegszűrők membránszűrők (cellulózacetát) 14-0,023µm; (baktérium 0,22 µm; vírus 0,01 µm Levegő szűrése HEPA szűrők Adszorpció Szűrés méret alapján Gázsterilizálás formaldehid glutáraldehid etilén-oxid béta-propiolakton orto-ftálaldehid alkiláló hatás ATTEST 10
Plazmasterilezés hőérzékeny anyagok sterilezése alacsony hőmérsékletű H 2 O 2 gáz plazmaállapotban alacsony hőmérséklet (46±4 C) alacsony páratartalom széles hatásspektrum nem toxikus, nem környezetszennyező nincs szükség szellőztetésre elektromos vagy mágneses erőtér alkalmazásával a H 2 O 2 plazmaállapotba kerül szabadgyök és biológiailag aktív anyagok hatnak normál nyomáson és vákuumban működő rendszer hatásfokozás UV-sugárzás alkalmazásával lépései 1. vákuum kialakítása 2. felmelegítés 3. H 2 O 2 és H 2 O befecskendezés, diffúzió, penetráció 4. plazmafázis létrehozása 5. nyomáskiegyenlítés Módszer Mechanikus hatások (fagyasztás-olvasztás, UH) Direkt hőhatás Alkalmazási terület Speciális elsősorban kísérletes felhasználás Fémeszközök (szike, kés) sürgős sterilezése Száraz hő Üvegeszközök Nedves hő Textíliák, üvegeszközök, hőrezisztens porok, gyógyszerkészítmények, folyadékok; fertőző anyagok inaktiválása Szűrés UV Hőérzékeny folyadékok, infúziós, injekciós készítmények, levegő Kisebb munkaterületek, boxok, légtér fertőtlenítése Gamma-sugárzás Egyszer használatos orvosi eszközök (fecskendők, injekciós tűk) Gázsterilezés Ruhanemű, helyiségek, műanyag eszközök Plazmasterilezés Folyadékok, porok, textíliák, cellulóz- és lentartalmú anyagok, zárt konténerben lévő anyagok NEM sterilezhetők 11
Dezinficiálás Dezinficiensek Antiszeptikumok Tartósítószerek Hatásmód nem szelektív szerek több támadáspont koncentráció-függő hatás (támadáspont, sztatikus-cid hatás) Támadáspontok 1. sejtmembránt károsító szerek 2. fehérje denaturáló szerek 3. fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjait károsító szerek Kiválasztás kritériumai széles spektrum kis koncentráció rövid behatási idő jó oldékonyság jó penetrációs képesség ne károsítsa a fertőtlenítendő anyagot ne legyen káros az alkalmazóra, felhasználóra nézve gazdaságos alkalmazás több szer együttes használatakor ne alakuljon ki káros interakció 12
Dezinficiensek hatékonyságának értékelése I. Fenol-koefficiens meghatározása Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Szuszpenzió teszt (Suspension test) Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa standard csíraszám több hígításban piszkos körülmények kétértékű kationok jelenlétében maradék dezinficiens neutralizálása BH <koncentráció> = logn K -logn D Dezinficiensek hatékonyságának értékelése II. Használati teszt (in-use test) mintavétel a fertőtlenítendő objektumról a rutinszerűen végzett dezinficiálás előtt és után a gyártó által előírt koncentrációban 32 C-on (3 nap) és szobahőn (7 nap) inkubálva Szimulált használati teszt (Simulated-use test) felület direkt kontaminációja tiszta és piszkos körülmények dezinficiens vizsgálata a gyártó által megadott munkahígításban Használati hígítási vagy hordozó teszt (usedilution or carrier test) tesztelés alkalmazási hígításban Salmonella choleraesius Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Korongdiffúziós teszt 13
Sejtmembrán károsító szerek Sejtmembrán integritásának megbontása makromolekulák kiáramlása és az ozmotikus egyensúly felborulása transzportmechanizmusok károsodása energia metabolizmus károsodása (elektrontranszportlánc és ATPáz funkció kiesése szintetikus funkciók kiesése Sejtmembránt károsító szerek Felületaktív vegyületek hidrofób és hidrofil csoportok kationaktív tenzidek anionaktív tenzidek nem ionos tenzidek amfoter tenzidek Kationaktív detergensek kvaterner ammóniumvegyületek (+) töltésű kationaktív molekularész spektrum és hatáserősség az apoláros oldallánctól függ baktericid, virucid hatás fungicid, sporocid és paraziticid hatásuk nincs nagyobb koncentrációban fehérje denaturáló hatás neutrális vagy enyhén lúgos ph-n aktívak kevéssé toxikus, nem irritáló, nem korrozív szerek jó vízoldékonyság könnyen inaktiválódnak kombinációk (biguanidok, jódszármazékok) cetilpiridinium-klorid, benzalkonium-klorid, cetiltrimetil-ammónium-bromid, dimetilbenzil-ammóniumklorid, stb. egyes szerek tartósítószerként is alkalmazhatók 14
Anionaktív detergensek szappanok anionos molekularész szennyoldó hatás gyengén savas ph-n hatékonyak Na-lauril-szulfát, Na-n-dodecilszulfonát, Na-palmitát Nem-ionos tenzidek nincs ionos csoport poláros rész alkohol-, éter- vagy észter-csoportokból áll szennyoldó hatás fokozzák a kationaktív tenzidek dezinficiáló hatását pentaeritril-palmitát, glicerol-monosztearát, PEG-lauril-éter, PEGsztearát Amfoter tenzidek Sejtmembránt károsító szerek Felületaktív vegyületek bázikus és savas csoport neutrális ph jó fertőtlenítő és szennyoldó hatás baktericid és virucid hatás a szerves szennyeződésekre kevésbé érzékenyek alkil-betainok, alkil-amidopropil- betainok (alkil- amidopropilbetain) Sejtmembránt károsító szerek Alkoholok lipidstruktúrák dezintegrációja fehérje denaturáció vízelvonó hatás hatáserősségük, penetrációs képességük, vízoldékonyságuk és toxicitásuk a lánchossztól függ baktericid, virucid, fungicid hatás sporosztatikus tartalmazhatnak spórákat - szűrés 60-90% etanol (70%) izopropil-alkohol (60-70%) kombinációban is alkalmazhatók (pl. jódszármazékokkal) egyes alkoholok tartósítószerként alkalmazhatók (klórbutanol, fenil- és fenoxi-etanol, fenoxipropán-2-ol) 15
Fenol Sejtmembránt károsító szerek Fenol és fenolszármazékok membrán dezintegráció membránhoz kötött enzimek (oxidázok, dehidrogenázok) károsítása fehérje denaturáló hatás baktericid, paraziticid hatás virucid hatás változatos fungisztatikus és sporosztatikus hatás Alkilált fenolszármazékok alkil-lánc hossza > hatáserősség, toxicitás, oldékonyság, érzékenység a szerves szennyeződésekre emulgeáló szerek hozzáadása krezol Halogénezett bifenil-származékok triclosan, hexaklorofén kifejezett antibakteriális hatás a Gram-pozitívakkal szemben Gram-negatívakkal és gombákkal szembeni hatása fokozható EDTA hozzáadásával fogkrémek, szájöblítők Sejtmembránt károsító szerek Biguanidok Biguanidok baktericid és virucid spektrum klórhexidin-acetát, -glukonát, hidroklorid Gram-pozitív spektrum nem irritáló aktivitásvesztés (szennyeződés, ionok, ph) kézmosószerek, szájöblítők enyhén lúgos közegben aktív alexidin - gyorsabb baktericid hatás biguanid-polimerek vantocil szemcseppek, élelmiszeripar Gram-pozitív és negatív spektrum membránkárosítás, enzimek inaktiválása NH NH Diamidinek propamidin dibromopropamidin sebfertőtlenítés, szepcseppek inaktiválás savas ph, szennyeződések NH (CH2)6 NH C NH C n 16
Fehérje denaturáló szerek Felületaktív vegyületek Fenol és fenolszármazékok Alkoholok Savak és lúgok baktericid, virucid, sporocid hatás környezeti ph változás szervetlen savak (HCl, H 2 SO 4 ) és lúgok (NaOH) - disszociációs képesség - lúgoknál a fémionok toxikus hatása is érvényesül szerves savak ecetsav, tejsav, citromsav, propionsav, benzoesav és észterei; tartósítószerek - nem disszociált formában hatnak - ozmotikus egyensúly felborítása - egyes savak (pl. citromsav) kelátorként is működnek Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Nehézfém vegyületek Higany, ezüst, arzén, réz vízoldékony sói -SH oldalláncokkal inaktiválása, merkaptánok képzése reverzibilis károsítás Higanyvegyületek -SH, karboxil-, foszfát-csoportok, aminok baktericid hatás irritáló és toxikus hatás Hg(II)-klorid szerves kötésű Hg-vegyületek tiomerzál, fenilmerkuri-citrát és acetát antiszeptikmok bőrfertőtlenítés, tartósítószerek Ezüstvegyületek baktericid hatás szervetlen AgNO 3 szerves Ag-acetát (1%) kolloidális Ag-vegyületek szemészet, bőrgyógyászat (antiszeptikum) 17
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek Halogén származékok -SH-csoportok, amino- és indolcsoportok tirozin fenolgyűrűjének OH-csoportja Jódszármazékok baktericid, fungicid, virucid hatás; sporocid és paraziticid hatás enyhén savas ph elemi jód hatékony alkoholos jódoldat - jódtinktúra jodoforok elemi jód detergensekkel alkotott komplexei bőr fertőtlenítése szerves szennyeződések Klórszármazékok -SH csoportok oxidálása, amino- és indol-csoportok károsítása baktericid, fungicid, virucid, sporocid és paraziticid hatás makromolekulák klórozása (DNS stabilizáló poliaminok) mellett oxidatív hatás stabilitás - szerves anyagok, hőmérséklet, koncentráció, ph, fény irritáló és korrozív hatás hipokloritok Na-, Ca-hipoklorit (klórmész) NaOCl + H 2 O HOCl + NaOH klóraminok klóramin-b (Neomagnol), diklóramin-b, halazon Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Peroxidok Oxidáló hatás S-S kötések bontása, -SH-csoportok oxidálása baktericid, fungicid, virucid, sporocid és paraziticid hatás Hidrogén-peroxid - 3% oldat - kataláz, peroxidáz inaktiválja - nincs toxikus bomlástermék - DNS törés - kontaktlencse tisztítók, sebek, plazmasterilizátor Peroxiecetsav - < 0,3% oldatban hatásos - plazmasterilizátor - nincs toxikus bomlástermék - peroxidázok nem inaktiválják - irritáló és korrodáló hatású - szinergista hatás 18
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Festékek Bakteriosztatikus és fungisztatikus hatás, ritkábban paraziticid Foszfát-csoportok Könnyen inaktiválódnak szennyeződések Korlátozott alkalmazhatóság karcinogén hatás Bőrgyógyászat, diagnosztika Anilinfestékek trifenil-metán származékok brillantzöld, malachitzöld, kristályibolya Gram-pozitívak gátlása Gram-negatívakkal szemben hatástalanok (külső membrán) citoplazmamembrán szemipermeabilitása interferálnak a sejtfal egységek szintézisével Akridinfestékek vagy flavinok akriflavin baktericid és bakteriosztatikus hatás interkaláció - nukleinsav és fehérjeszintézis megzavarása Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek - Aldehidek Alkiláló szerek Legszélesebb hatásspektrum - baktericid, tuberculocid, fungicid, virucid, paraziticid és sporocid hatás Formaldehid karboxil-, hidroxil-, SH-csoportok fehérje-dns keresztkötések >>> gátolja a DNS replikációt formalin, paraformaldehid (aktiválás) 20 C, 60-80% páratartalom toxicitás, irritáló hatás, rossz penetráció, inaktiválódás felület fertőtlenítés, gázsterilezés formaldehid kondenzátumok (noxythiolin, polynoxylin, taurolidin) Glutáraldehid nagyobb hatékonyság, kevésbé toxikus, nem érzékeny szerves szennyeződésekre alkalikus ph-n jobb aktivitás, stabilitás savas ph mellett - aktiválás Orto-ftálaldehid még nagyobb hatékonyság kevéssé irritáló széles ph tartományban aktív nincs szükség aktiválásra endoszkópok fertőtlenítése 19
Fehérjék és nukleinsavak funkciós csoportjaira ható szerek Etilén-oxid Béta-propiolakton Etilén-oxid gázsterilizálás speciális eszközigény, hőmérséklet és páratartalom széles hatásspektrum alkiláló hatás fehérjék, nukleinsavak robbanásveszélyes, irritáló és korrozív hatás jól penetrál, alacsony hőmérsékleten is aktív toxikus, mutagén és karcinogén hatás Béta-propiolakton nagyobb hatékonyság, kevésbé toxikus speciális alkalmazási körülmények (magas páratartalom, 25ºC) irritáló, instabil vegyület Fertőtlenítőszer kombinációk Alkohol + klórhexidin Alkohol + kvaterner ammóniumvegyületek Alkohol + Na-hipokorit Alkohol + jódszármazékok Kationaktív tenzidek + fenolszármazékok Kationaktív tenzidek + aldehidek Peroxid-származékok H 2 O 2 + hangyasav Bioaktív felületek kialakítása ezüst-sók, biguanidok, triclosan Aldehid + UH Biguanid + UH H 2 O 2 + UV Szuperoxiddal kezelt víz oxidálószerekkel kombinálva 20
Rezisztencia mechanizmusok a fertőtlenítőszerekkel szemben 1. Természetes vagy intrinzik rezisztencia sejtfalstruktúra spóraképzés cisztaképzés aktív efflux mechanizmusok biofilmképző képesség 2. Szerzett rezisztencia mutáció mobilis genetikai elemek fenotípusos adaptációs képesség Jelentőség dezinficiensek, antiszeptikumok hatástalansága szelekció keresztrezisztencia korezisztencia Prionok (CJD, BSE) Protozoonok - Sporozoa (Cryptosporidium) Baktériumspórák (Bacillus, Clostridium) Mycobacteriumok (M. tuberculosis, M. avium) Protozoonok cisztái (Giardia) Kis méretű burok nélküli vírusok (poliovírusok) Protozoonok trophozoitái (Acanthamoeba) Gram-negatív baktériumok (Pseudomona, Provodencia) Gombák vegetatív sejtjei (Candida, Aspergillus) Nagy méretű burok nélküli vírusok (Adenovírusok) Gram-pozitív baktériumok (S. aureus, Enterococcus) Burokkal rendelkező vírusok (HIV, HBV) Baktériumok rezisztencia mechanizmusai 1. Természetes rezisztencia Gram-pozitív baktériumok jól átjárható sejtfal glikokalix-képzés Enterococcusok (VRE, VSE) Gram-negatív baktériumok LPS hidrofil porincsatornák Mg2+ és foszfát-tartalom intrinzik aktív efflux, pl. E. coli, Pseudomonas Acr AB Mycobacteriumok sejtfalstruktúra hidrofil szerek rossz penetrációja Baktériumspórák cortex, köpeny, exosporium fokozatosan kialakuló és fokozódó rezisztencia small acid-soluble spore proteins (UV, peroxidok) Biofilmképzés 21
Baktériumok rezisztencia mechanizmusai 2. Szerzett rezisztencia Mutáció a több target miatt kevéssé jelentős szelekciós nyomás fertőtlenítőszer szuboptimális koncentrációban történő alkalmazása target módosulás E. coli enoil-acil-protein reduktáz (triclosan) efflux pumpa Pseudomonas nfxb regulátorgén akridinfestékek Mobilis genetikai elemek Ag-vegyületek csökkent felvétel Hg-vegyületek enzimatikus inaktiválás szűk spektrumú rezisztencia Hg-sók és néhány szerves Hgvegyület (enzimatikus redukció) széles spektrumú rezisztencia összes Hg-vegyülettel szemben (enzimatikus hidrolízis) kvaterner ammóniumvegyületek efflux pumpák (qaca-d) biguanidok aktív efflux és enzimatikus inaktiválás (klórhexidin) festékek aktív efflux (qaca-d) formaldehid enzimatikus inaktiválás Fenotípusos adaptáció tápanyagellátottság zsírsavak, fehérjék, tápanyaghiány stresszreakciók 22
Gombák rezisztencia mechanizmusai fonalas gombák ellenállóbbak, mint a sarjadzó alakok intrinzik rezisztencia - sejtfal barrierképzése szaporodási fázistól függ >>> változó a sejtfal porozitása (log <> stacioner) mikrokörnyezet zsírsavtartalom és citoplazmamembrán fluiditása (etanol) enzimatikus degradáció (formaldehid-dehidrogenáz) és neutralizálás (H 2 S- termelés, nehézfém-vegyületek) Vírusok rezisztencia mechanizmusai intrinzik rezisztencia vírusburok jelenléte vagy hiánya vírusaggregátumok kialakulás biofilmhez hasonló hatás mutáció? Protozoonok rezisztencia mechanizmusai intrinzik rezisztencia ciszta alak cisztafal mint barrier biofilmképzés - Acanthamoeba Prionok rezisztencia mechanizmusai abnormális fehérjék 23