B aromfitudomány A PULYKA GENETIKAI VIZSGÁLATÁRA ALKALMAS TYÚK MIKROSZATELLITEK Korom Edit, Pinke Orsolya, Veress Gyula, Kovács Balázs, Szabó Gyula, Varga László Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2101 Gödöllő, Szent-Györgyi A. u. 4. Összefoglaló: A madarak között a tyúk rendelkezik a legtöbb genetikai markerrel és a legfejlettebb genetikai térképpel is. Azonban a madárfajok genetikai hasonlósága miatt a tyúkra kifejlesztett genetikai markerek egy része (pl. a mikroszatellitek) interspecifikus adaptációt követően más madárfajokon is használhatók. A szerzők tyúk mikroszatellit markerek (MS) használhatóságát vizsgálták a pulyka genomján. Irodalmi adatok alapján 58 fluoreszcensen jelölt mikroszatellit markert választottak ki a vizsgálatokhoz, amelyeket 10 pulyka DNS mintán vizsgáltak, ABI Prism Genetic Analyser rendszerrel. A vizsgált mikroszatellitek közül 47-tel (81%) sikerült specifikus fragmenteket kimutatni a pulyka genomból, de csak 21 (36%) rendelkezett kettő vagy több alléllal (más szóval polimorf volt), míg a többinél csak egy allél volt kimutatható (monomorfnak bizonyult). Ez az arány megfelel a pulyka ismert alacsony genetikai variabilitásának. A mikroszatellitek kimutatására használt PCR (Polymerase Chain Reaction) hatékonyságának optimalizálását követően kimutatási szetteket hoztak létre MS-ek vizsgálatára. Ezekben duplex és triplex PCR-eket alakítottak ki, kapilláris gélelektroforézis során egyszerre elválasztható mikroszatellitek számára. Az egyik kimutatási szett 8 markert tartalmazott, amelyek egy duplex és két triplex PCR-ben, míg a második szett 7 markere egy duplex, egy triplex és két egyedi PCRben sokszorozhatók fel. A kialakított kimutatási szettek direkt módon felhasználhatók a különböző tenyésztési programokban. Így például a tenyésztők használhatják speciális párosítások kialakításához, származás ellenőrzéshez, de az egyedi genotípus-adatokból populációgenetikai indexek is számíthatók. Kulcsszavak: házityúk, mikroszatellit markerek, pulyka DOMESTIC FOWL MICROSATELLITES ARE SUITABLE FOR THE GENETIC INVESTIGATION OF TURKEY Abstract: Among the avian species chicken has the most genetic markers and the most detailed genetic map. On the basis of the genetical similarity between avian species, genetic markers developed for chicken (e.g.: microsatellites) can be adapted for other birds as an interspecific adaptation. The authors investigated the usability of chicken microsatellite markers (MS) on turkey genoms. 58 fluorescent dye labelled microsathellites were chosen according to literature data and examined they adaptability on 10 turkey DNA samples, and detected them by ABI 310 Genetic Analyser. 47 microsatellites (81%) amplified specific fragments from the turkey genomes, but only 21 (36%) had two or more alleles (polymorph), the others were monomorf. These dates are in agreement with the known low genetic variability of the turkey. After the optimalisation of the conditions of Polymerase Chain Reaction (PCR) to amplify the microsatellites effectively, microsatellite detec-tion sets were constructed for duplex and triplex amplification and collective identification of the MS in capillary electrophoresis. The first detection set contained 8 markers, which were amplified in one duplex and two triplex reaction, while an other set contained 7 markers that were amplified in one duplex, one triplex and two simplex PCRs. These detection sets can be used directly in breeding programmes. For example breeders will be able to set up special matings and pedigree analyses or from the individual genotypes population genetic indexes can be calculated. Keywords: domestic fowl, microsatellite markers, turkey 42
A Baromfi VII. évf. 2004/4. 1. Bevezetés A mennyiségi teljesítmény mellett az állattenyésztésben előállított termékeknek egyre magasabb minőségi követelményeknek kell megfelelniük, mind a hazai, mind a külföldi fogyasztók körében. A magasabb minőségi szint eléréséhez a klasszikus állatnemesítési eljárásokon felül ma már felhasználhatók a molekuláris genetika e területen született legújabb eredményei, mint például a molekuláris DNS markerek, amelyek közé például az MS marker is tartozik. Ezek a molekuláris markerek úgy tekinthetők, mint a kromoszómákon elhelyezkedő jelzőkövek, amelyekkel nyomon követhető az egyes kromoszómarészletek öröklődésének menete. Ez az egyes fontos gazdasági tulajdonságok (zsír és hús mennyiség stb.) öröklődésének vizsgálatakor nyújt segítséget, illetve viszonyítási alapként szolgál. Segítséget nyújthatnak továbbá a háziállatokon végzett géntérképezési munkák mellett az állományok genetikai variabilitásának felméréséhez csakúgy, mint a fajok és fajták fenntartási, nemesítési munkáinak hatékonyabb elvégzéséhez. A genetikai variabilitás, változatosság felmérése különösen nagy hangsúlyt kap a génrezerv állományok fenntartási munkájánál, míg a molekuláris markerekkel készített genetikai térképek a tenyésztők és nemesítők munkájának hatékonyságát segíthetik. A tyúk (Gallus gallus) a genetikai kutatásokban a madarak (Aves) közül a legtöbbet vizsgált faj, köszönhetően kiemelkedő gazdasági szerepének. Így a tyúkról napjainkra már jelentős menynyiségű molekuláris genetikai információ gyűlt össze. Ezek az eredmények közvetlenül nagyon ritkán használhatók fel más madárfaj esetében, de egy részük adaptálható, mint az kiderült a japán fürj (Coturnix coturnix japonica), a fácán (Phasianus colchicus) és még számos madárfaj vizsgálata során (Inoue- Murayama et al, 2001; Kayang et al, 2000; Baratti et al, 2001). Az eredmények adaptálása tehát nagymértékben elősegítheti azoknak a fajoknak a vizsgálatát is, amelyekről jelenleg még kevés genetikai információval rendelkezünk. A gazdaságilag egyre jelentősebb szerepet betöltő pulykáról (Meleagris gallopavo) is hiányosak még a molekuláris genetikai ismereteink, ezért a kisszámú kutatási munka mellett ma már adaptációs vizsgálatok is folynak a pulyka fajjal (Liu et al, 1996; Reed et al, 2000; Smith et al, 2000), ami meggyorsíthatja a tenyésztésben is alkalmazható eredmények születését. Az MS-ek, mint genetikai markerek (Litt és Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber és May, 1989; Goodfellow, 1993) számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, így például gyors, pontos és ismételhető eredményt adnak, kimutatásuk könnyen elvégezhető, ami nagyban segítette ezeknek a markereknek széleskörű elterjedését és alkalmazását. Használták például azokat genetikai térképek készítésére, származásellenőrzési vizsgálatokra, populációk genetikai változatosságának illetve beltenyésztettségének vizsgálatára, különbségek kimutatására vagy fajok közötti összehasonlító elemzésekre is. Emellett a MAS (Marker Assisted Selection markerek segítségével végzett szelekció) alkalmazásával ami bár költségesebb, mint a hagyományos szelekciós módszerek (Soller és Beckmann, 1990; Soller és Andersson, 1998), növelhetjük a szelekció hatékonyságát, vagy a tenyészértékbecslés megbízhatóságát. A MAS használata mellett a MS-ek nagy segítségünkre lehetnek a populációvizsgálatokban, hiszen felhasználásukkal sokat megtudhatunk az egyes populációk genetikai struktúrájáról, történetéről. A MS-ek olyan egyszerű ismétlődő szekvenciák (néhány bázispár ismétlődéséből álló DNS motívumok), amelyek nagy számban fordulnak elő a genomban, a kódoló és a nem kódoló régióban egyaránt. Szerkezetüket sematikusan az 1. ábra mutatja be. Az ismétlődő motívum (négyzet) hossza mindöszsze 1-6 bázispár, a motívumok ismétlődésének a száma 2 40 között változhat. Polimorfizmusuk (különbözőség) az is- 1. ábra A mikroszatellit (MS) felépítése (sematikus ábra) - Ismétlődő motívum - Határoló szekvenciák - A kimutatáshoz tervezett nukleotidok (primerek). (Az ismétlődő motívumok számának változásával változik a mikroszatellit allél hossza). 43
B aromfitudomány A Baromfi VII. évf. 2004/4. 2. ábra ABI Prism Genetic Analyzer 310 gélelektroforézis és fragmentanalizáló berendezés 2. Anyag és módszer métlődések számának eltéréséből adódik. Egyediségüket az ismétlődéseket határoló, a genomban máshol nem található szekvencia részek adják (vonal). Megfelelő körülmények között az ezekre tervezett rövid nukleotidok (nyíllal jelölve az ábrán) segítségével sokszorozhatók (PCR technika alkalmazásával) és azt követően vizsgálhatók. (Hearne et al, 1992; Goodfellow, 1993; Schötterer et al, 1998). A MS-ek adaptálása annyit jelent, hogy az egyik fajban kifejlesztett markereket a közeli rokon fajokon is megpróbálják alkalmazni, azaz a kimutatáshoz használt primerekkel az adott fajra jellemző specifikus fragmenteket sokszorozni (amplifikálni). Ennek eléréséhez az eredeti fajnál a kimutatáshoz alkalmazott PCR technika (a DNS darabot kimutatható mennyiségűre sokszorosítja) beállításain és kimutatási körülményein kell változtatni, mint pl. az alkalmazott összetevők (MgCl 2, primerek) mennyisége, vagy az alkalmazott hőmérsékleti profilok. Napjainkra egyre több pozitív példa van arra, hogy az adaptálás elősegítheti a gazdaságilag kevésbé fontos, illetve a genetikai információt tekintve alig ismert fajok vizsgálatát. Ennek érzékeltetésére néhány számadat, ami a munkánk kezdetekor a következő képen alakult: a tyúk konszenzus genom térképére 1889 lokusz került feltérképezésre, ebből 801 MS, míg a pulyka esetében addig 56 specifikus MS szekvencia volt ismeretes, de ezek térképpozíciója még ismeretlen (Groenen et al., 2000). Ezzel szemben az egéren már több, mint 6000 MS volt ismert (Whitehead Institute/MIT Center, 1999). Ez jól jelzi a fajok közötti adaptációs munkálatok szükségességét és jelentőségét. Ugyanis ezek eredményesség esetén meggyorsíthatják a tenyésztésben is használható eredmények gyakorlati alkalmazását (Reed et al, 2000, Liu et al, 1996). A vizsgálatok első lépéseként, irodalmi adatok alapján, a rendelkezésünkre álló több száz fluoreszcensen jelölt tyúkspecifikus MS-ből kiválasztottunk 58- at (1. táblázat) annak érdekében, hogy teszteljük ezek adaptálhatóságát az általunk használt genotipizálási rendszerbe (Reed et al, 2000). A kiválasztott MS-ek vizsgálatához 10 különböző állományból származó pulykából vérmintát vettünk, majd ezekből a mintákból sós-kicsapásos eljárással DNS-t izoláltunk. Az adaptációs munka során a PCR reakció körülményeket változtattuk - elsősorban a MgCl 2 koncentrációt (1-3 mm) és a primer feltapadási hőmérsékletet (63 C- 51 C), állandó és változó ( touch down ) körülmények között. Ez utóbbi felhasználható több, a feltapadási hőmérsékletükben csak kis eltéréseket mutató mikroszatellit egyetlen PCR reakcióban történő sokszorosításához, mivel az egymást követő PCR ciklusok feltapadási hőmérséklete változik a folyamat első részében. Az ilyen multiplex reakciók kialakításával csökkenthetjük a költségeket és felgyorsíthatjuk a vizsgálatokat. 3. ábra A MS számítógép által készített grafikus ábrázolása. A görbék csúcsai egy-egy MS különböző alléljainak felelnek meg 44
A Baromfi VII. évf. 2004/4. 1. táblázat A vizsgált 58 mikroszatellit, közülük 47 működött pulykán, amelyeket dőlt betűvel jelöltünk Tyúk MS elnevezés Allél méret tartomány pulykán Tyúk MS elnevezés Allél méret tartomány pulykán ADL0106 152-135 ADL0310 123 ADL0109 - ADL0314 204 ADL0114 - ADL0353 143-151 ADL0118 121 ADL0359 - ADL0120 233 ADL0361 100-120 ADL0134 121 ADL0366 237 ADL0142 207-217 ADL0367 - ADL0143 141 LEI0043 99-111 ADL0146 195-197 LEI0088 - ADL0147 - LEI0091 201 ADL0149 222-224 LEI0099 - ADL0150 138 LEI0120 272 ADL0160 127 LEI0121 - ADL0166 - LEI0134 281 ADL0173 - LEI0161 72-75 ADL0180 146-159 LEI0319 86 ADL0191 138-140 MCW0007 233 ADL0234 131-131 MCW0018 200 ADL0236 120 MCW0029 149-167 ADL0240 - MCW0035 216-218 ADL0254 90-104 MCW0037 206-212 ADL0260 122 MCW0068 158 ADL0266 95-103 MCW0080 276-280 ADL0268 92 MCW0083 75 ADL0272 159-166 MCW0089 295 ADL0292 128-130 MCW0102 209 ADL0293 85-99 MCW0115 244 ADL0300 145 MCW0169 99 ADL306 109-113 MCW0178 74 A PCR-rel felsokszorozott MS-ek kimutatására egy automata kapilláris gélelektroforézis és fragmentanalizáló készüléket használtunk (2. ábra). A kapilláris gélelektroforézis során az elválasztás egy igen kis átmérőjű (50 mm), folyékony, alacsony viszkozitású polimerrel töltött kapillárisban történik elektromos feszültség hatására. A MS vizsgálatok esetében a primerek közül az egyik fluoreszcens festékkel jelölt, míg a másik nem. A lézeres megvilágítással gerjesztett fluoreszcens festékek emissziós kibocsátását számítógép elemzi az elektroforézis folyamán, a kapilláris egy adott pontján. A detektorhoz tükörrendszeren keresztül jut az emissziós sugár, amit a tükrök megszűrnek és szétbontanak, így csak a 520 nm és 650 nm közötti hullámhossztartományban folyik az adatgyűjtés. Az elválasztott, sokszorosított (amplifikált) MS termékek hosszát és azok intenzitását a készülék egy méretstandardhoz képest állapítja meg, majd grafikus formában ábrázolja. (3. ábra). A módszer előnyös tulajdonsága a pontosság (1 nukleotidnyi különbség is kimutatható), az ismételhetőség (belső molekulasúly standard), a nagy érzékenység, az automatizálhatóság és az egy mintára vetített viszonylag alacsony költség (Wenz et al, 1998). Emellett a módszer lehetőséget kínál több, eltérő termékméretű és eltérő fluoreszcens festékkel jelölt MS egyidejű kimutatására. Azonban ehhez a megfelelő MS kombináció összeválogatásával ún. vizsgálati szettek kialakítása szükséges. Mi két ilyen vizsgálati szett kialakítását végeztük el. 3. Eredmények és értékelésük A vizsgált 58 MS-ből 47 esetében kaptunk pulykaspecifikus fragmenteket, de ezekből csak 21 MS mutatott polimorfizmust, azaz több allélváltozatot, míg a többi monomorf volt, azaz csak egyfajta allélt tudtunk kimutatni (1. táblázat). Ez az arány megfelel a pulyka irodalmi adatokból ismert alacsony genetikai variabilitásának. A termékméret és a primer feltapadási hőmérséklet alapján elkülönülő mikroszatellitekből 2 db duplex és 3 db triplex PCR reakciót alakítottunk ki, aminek következtében elértük, hogy egyetlen reakció során 2 ill. 3 mikroszatellitet tudunk sokszorosítani. A multiplex reakciók kialakításával csökkentettük a PCR alkalmazásának költségeit. A kialakított multiplex PCR reakció öszszetétele: 50 ng DNS template, 200-250 nm primer (MS-től függően), 2 mg/ ml BSA, 2,5-3 mm MgCl 2 (MS-től függően), 0,80 mm dntp, 0,05 U/ml Taq polimeráz, 0,5ml 10*PCR puffer és 10 ng/ml pulyka DNS, steril desztillált vízzel kiegészítve 5 ml össztérfogatra. A 45
B aromfitudomány A Baromfi VII. évf. 2004/4. 2. táblázat A 8 MS-ből álló, a vizsgálatban alkalmazott I. szett bemutatása MS elnevezés Primer koncentráció (nm) ADL0292 200 MCW0018 200 ADL0293 200 ADL0272 200 ADL0149 200 ADL0266 200 ADL0150 250 MCW0080 200 MgCl 2 koncentráció (mm) PCR hőmérséklet ( C) Multiplex PCR azonosító 3 63-53 A 2,5 63-53 B 3 63-53 C PCR-t MJ Research PTC-200 berendezéssel végeztük. A reakció körülményei: 95 C 4 percig, ezután 10 ciklusban 95 C 30 másodpercig, 63 C 30 másodpercig ciklusonként 1 C-onként csökkentve, így a 10. ciklusban már 53 C lesz, 72 C 45 másodpercig, majd ezután 25 ciklusban ismételve 95 C 30 másodpercig, 53 C 30 másodpercig, 72 C 45 másodpercig, a ciklus végén 72 C 5 percig. A költségek további csökkentése és a kimutatás hatékonyságának növelése céljából, az előzetes kísérletek alapján egy 8 mikroszatellitet tartalmazó vizsgálati szettet állítottunk össze (a szettbe tartózó MS-ek elnevezése a 2. táblázatban található). Ezt a szettet 3 multiplex PCR-reakcióban amplifikáltuk, majd a reakciótermékek összekeveré- sét követően a 8 MS-et egyetlen kapilláris elektroforézissel detektáltuk az ABI Prism 310 berendezés segítségével. Ezt követően megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy a többi polimorf MS kimutatásához további szettek kialakítása lehetséges-e. A fragmentméreteket és a jelölő festékeket figyelembe véve még egy szettet sikerült kialakítanunk, ami 7 MS-et tartalmaz, ezek egy része szintén felsokszorozható multiplex reakcióban (3. táblázat). 4. Következtetések és javaslatok A kialakított két MS szett, a fluoreszcens jelöléseknek és ABI Prism 310 Genetic Analyser-en történő kimutatásnak köszönhetően, alkalmas volt pulyka egyedek és populációk genetikai állományának korszerű, gyors, hatékony és költségtakarékos vizsgálatára. Az ismertetett módszerrel kapott eredmények közvetlenül felhasználhatók a tenyésztők számára a nemesítési munkában, így például: párosítási tervek kialakításában, származásellenőrzési vizsgálatok során, a populációk genetikai változatosságának (variabilitás), illetve beltenyésztettségük mértékének felmérésében és összehasonlításában, továbbá az egyedi és populációk közötti különbségek keresésekor. 3. táblázat A 7 MS-ből álló, a vizsgálat során alkalmazott II. szett bemutatása MS elnevezés Primer koncentráció (nm) MCW0083 200 ADL0146 200 ADL0353 200 ADL0361 200 ADL0142 200 MgCl 2 koncentráció (mm) PCR hőmérséklet ( C) Multiplex PCR azonosító 3 63-53 D 3 63-53 E LEI0043 200 3 65-55 F ADL0191 200 3 61-51 G 46
A Baromfi VII. évf. 2004/4. Irodalomjegyzék Baratti, M.-Alberti, A.-Groenen, M-Veeneddal, T., and Fugheri, F. D. (2001): Polymorphic microsatellites developed by cross-species amplifications in common pheasant breeds. Anim. Gen. 32: 222-225. Goodfellow, P. N. (1993): Microsatellites and the new genetic maps. Curr. Biol. 3:149-151. Groenen, M. A. M.-Cheng, H. H.-Bumstead N.-Benkel B. F.-Briles W. E.-Burke T.-Burt D. W.- Crittenden L. B.-Dogson J.-Hillel J.-Lamont S.-De Leon A. P.-Soller M.-Takahashi H.-Vignal A. (2000): A consensus linkage map of the chicken genome. Genom Res. 10:137-147. Hearne, C. M.-Ghosh, S.-Todd, J. A. (1992): Microsatellites for linkage analysis of genetic traits. TIG, 8:288-293. Inoure-Murayama, M.-Kayang, B. B.-Kimura, K.-Ide, H.-Nomura, A.-Takahashi, H.-Nagamine, Y.-Takeda, T.-Hanada, H.-Tatsuda, K-Tsudzuki, M.-Matsuda, Y.-Mizutani, M.-Murayama, Y., and Ito, S. (2001): Chiken microsatellite primers are not efficient markers for Japenese qual. Anim. Gen. 32: 7-11. Kayang, B. B.-Inoure-Murayama, M.-Nomura, A.-Kimura, K.-Takahashi, H.-Mizutani, M., and Ito, S. (2000): Fifty microsatellite markers for Japanese quail. J. Heredity, 91: 502-505. Litt, M.; Luty, J.A. (1989: A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Human Gen. 44:397-401 Liu, Z.-Crooijmans, R. P. M. A.-van der Poel, J. J, and Groenen, M. A M. (1996): Use of chicken microsatellite markers in turkey: a pessimistic view. Anim. Gen. 27:191-193. Reed, K. M.-Mendoza M, K., and Beattie, C. W. (2000): Comparative analysis of microsatellite loci in chicken and turkey. Genome 43: 796-802. Schlötterer, C. (1998): Genome evolution: Are microsatellite really simple sequences? Curr. Biol. 8: R132-R134. Smith, E.-Shi, L.-Drummond, P.-Rodriguez, L.-Hamilton, R.-Powrll, E.-Nahason, S.-Ramlal, S.- Smith, G., and Foster, J. (2000): Development and characterization of expressed sequence tags for the turkey (Meleagris gallopavo) genome and comparative sequence analysis with other birds. Anim. Gen.31: 62-67. Soller, M. and Beckmann J. S. (1990): Marker-based mapping os quantitative trait loci using replicated progeny. Theor. Appl. Genet., 80:205. Soller, M. and Andersson L. (1998): Genomic approches to the improvement of disease resistance in farm animals. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 17:329-345. Tautz, D.(1989: Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res. 17: 6463-6471 Weber, J.L.; May, P.E. (1989: Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396. Wenz, H.-M.-Robertson, J. M.-Menchen, S.-Oaks, F.-Demorest D. M.-Scheibler, D.-Rosenblum, B. B.-Wike, C.-Gilbert, D. A., and Eflavitch, J. W. (1998): High-precision genotyping by denaturing capillary electrophoresis. Genome Res. 8: 69-80. Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Mouse Genomic Mapping Project Database, Data Release 16, May 1999 47