Növényi fenoloidok kapcsolt tandem tömegspektrometriás vizsgálata Doktori (Ph.D.) tézisek Blazics Balázs Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Kéry Ágnes, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Báthori Mária, Ph.D., D.Sc. Dr. Drahos László, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság: Dr. Klebovich Imre, Ph.D., D.Sc. Dr. Lemberkovics Éva, Ph.D. Dr. Vékey Károly, Ph.D., D.Sc. Budapest, 2010
Összefoglalás A gyógynövénykivonatok és növényi gyógyszerek mindig több, nem ritkán többszáz komponensű, kémiailag gyakran nem pontosan definiált szerkezetű ható- és ballasztanyagok keverékei. Mindez a növényi gyógyszer minőségi vizsgálatában és analitikai értékelésében komoly kihívást jelent. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS) érzékenységének, hatékonyságának és robosztusságának köszönhetően választ jelenthet a kihívásra, hiszen széleskörűen alkalmas komplex folyékony minták vizsgálatára. Jelen munkánkat kettős célkitűzés vezette. Egyrészt hozzá kívántunk járulni néhány fenoloid tartalmú tradícionális gyógynövény újraértékeléséhez tartalmi/hatóanyagaik feltárásával és mennyiségi vizsgálatával, másrészt további bizonyítékokat, konklúziókat kívántunk szolgáltatni az LC-MS módszerek fitokémiai és fitoanalitikai lehetőségeinek megismeréséhez. Az Euphrasia rostkoviana Hayne, Filipendula ulmaria L. MAXIM, Sempervivum tectorum L., Satureja hortensis L. és az Epilobium parviflorum Schreb. metanolos és vizes-metanolos extraktumainak vizsgálatára LC-DAD-MS/MS módszereket adaptáltunk és fejlesztettünk ki. A vizsgálatokat elektroporlasztásos ionforrással (ESI) ellátott hármas kvadrupól tömegspektrométerrel végeztük negatív ionizációs üzemmódban. Az Euphrasia rostkoviana potenciális hatóanyagának feltárása céljából bioassay (szabadgyökfogó képesség in vitro dekolorizációs módszer) vezetett extrakciót és frakcionálást választottunk. Vizsgálatainkat nagy érzékenység és jó szelektívitás mellett nagy áteresztőképességgel sikerült elvégeznünk. A kapcsolt tandem tömegspektrometria univerzális kvalitatív és kvantitatív analitikai eszköznek bizonyult a fenoloidok vizsgálatára az egyszerű fenolsavaktól a bonyolultabb flavonoid glikozidokon át a makrociklusos polifenolokig. A single reaction monitoring (SRM) üzemmód jó precízitás és pontosság mellett ppb szinten tette lehetővé az Euphrasia vezető antioxidáns hatóanyagának (akteozid) meghatározását. A szemvidítófű kivonatokban összesen tizenhét egyszerű fenolos komponenst és flavonoid glikozidot azonosítottunk és/vagy jellemeztünk. Antioxidáns hatásvizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy a jelentős koncentrációban feldúsuló akteozid a szemvidítófű hatóanyagának tekinthető. [1, 2]. Kísérletesen igazoltuk a Satureja kivonatok példáján, hogy, egy vélhetően az ionorrásban végbemenő, nem-kvantitatív dimérképződés miatt az antioxidáns rozmaringsav kvantálása tömegspektrometriás detektálással sem selected ion monitoring (SIM), sem SRM módban nem végezhető el. Így meghatározását UV detektálással végeztük. Salicin és szalicilsav standardek segítségével hat szalicilát mennyiségét határoztuk meg SIM üzemmódban, valamint számos flavonoidot azonosítottunk a Filipendula mintákban [3]. A fragmens ionok és a gyökös fragmens ionok relatív intenzitásarányai alapján sikerrel térképeztük fel számos Sempervivum flavonoid glikozilációs profilját, a cukrok kapcsolódási helyét és sorrendjét. [4]. Az egyszeres [M-H] - és kétszeres [M-2H] 2- töltésű molekulaionok szimultán detektálása és fragmentációja alapján elsőként írtuk le az oenothein B makrociklusos fenoloid tömegspektrometriás fragmentációját [5]. A változatos szerkezetű fenoloidok LC-MS/MS adattárának bővítése mellett rámutattunk néhány, a módszer előnyeihez képest nem jelentős hátrányra is (pl: izoméria). 1. Blazics B, Ludányi K, Szarka Sz, Kéry Á. (2008) Investigation of Euphrasia rostkoviana Hayne Using GC-MS and LC-MS. Chromatographia 68: S119-S124. 2. Blazics B, Alberti Á, Béni Sz, Kursinszki L, Tölgyesi L, Kéry Á. Identification and LC-MS/MS determination of acteoside, the main antioxidant compound of Euphrasia rostkoviana, using the isolated target analyte as external standard. Közlésre elfogadva J Chrom Sci, nyomdában. 3. Blazics B, Papp I, Kéry Á. Qualitative Analysis and Simultaneous Determination of Six Filipendula Salicylates with Two Standards by LC-MS. Közlésre elfogadva Chromatographia, nyomdában. 4. Alberti Á, Blazics B, Kéry Á. (2008) Evaluation of Sempervivum tectorum L. flavonoids by LC and LC-MS. Chromatographia 68: S107- S111. 5. Hevesi Tóth B, Blazics B, Kéry Á. (2008) Polyphenol composition and antioxidant capacity of Epilobium species. J Pharm Biomed Anal 49: 26-31. 2
Summary Medicinal plant extracts and herbal preparations are complex mixtures of active- and ballast substances which may contain numerous, not infrequently up to several hundreds of different constituents with not exactly defined structures. Quality, safety and efficacy of these herbs is thus a great issue and their analysis is challenging. Tandem mass spectrometry coupled to high performance liquid chromatography (LC-MS/MS), as a sensitive, powerful and robust technique, capable of analysing very diverse complex liquid samples, may offer a solution. The aim of our work was to revaluate traditionally well known, but less characterized herbs of various phenoloid content by the qualitative and quantitative analysis of their active substances, and to study the versatile capabilities of mass spectrometry in phytochemistry, and draw general conclusions regarding phytoanalytical mass spectral applications. For the analyses of the methanolic and/or aqueous methanolic extracts of Euphrasia rostkoviana Hayne, Satureja hortensis L., Filipendula ulmaria L. MAXIM, Sempervivum tectorum L., and Epilobium parviflorum Schreb. LC-DAD-MS/MS methods were adopted and developed. Samples were analysed with a triple quadrupole analyzer with electrospray ionsource (ESI) in negative ion mode. For revealing the potential active components of Euphrasia rostkoviana a bioassay (in vitro antioxidant decolorization assay) guided extraction and fractionation was accomplished. All measurements were accomplished with great selectivity and sensitivity at high throughput. LC coupled mass spectrometry served indeed as a universal analytical tool for the qualitative and quantitative analysis of phenolics from simple phenolic acids and salicylates towards more complex structures, like flavonoid glycosides and macrocyclic phenolics. The single reaction monitoring (SRM) mode enabled the quantitation of the leading active substance of the Euphrasia sample, acteoside, at ppb level by great precision and accuracy. A total of seventeen different phenolic acids and flavonoid glycosides were identified or characterized in the extract and in its fractions [1, 2]. Quantification of the antioxidant rosmarinic acid in Satureja hortensis was not amenable nor in selected ion monitoring (SIM) nor in SRM mode due to non-quantitative dimer formation, thus UV based quantitation was performed. Contents of six salicylates were determined with salicin and salicylic acid standards in SIM mode in the Filipendula ulmaria sample, and several flavonoids were characterized [3]. A comprehensive LC-MS characterization of the glycosilation profile of the Sempervivum flavonoids was accomplished based upon rel. intensities of the fragment ions and radical fragments [4]. The simultaneous formation of the single [M-H] - and double [M- 2H] 2- charged molecule ion of oenothein B helped the interpretation of its fragmentation in the Epilobium sample [5]. However some limitations regarding constitutional isomeria and stereochemistry (sugar moieties) of mass spectrometry in phytochemistry were pointed out which, still, are of almost no significance if compared to the possibilities of the technique. 1. Blazics B, Ludányi K, Szarka Sz, Kéry Á. (2008) Investigation of Euphrasia rostkoviana Hayne Using GC-MS and LC- MS. Chromatographia 68: S119-S124. 2. Blazics B, Alberti Á, Béni Sz, Kursinszki L, Tölgyesi L, Kéry Á. Identification and LC-MS/MS determination of acteoside, the main antioxidant compound of Euphrasia rostkoviana, using the isolated target analyte as external standard. Accepted for publication in J Chrom Sci, in press. 3. Blazics B, Papp I, Kéry Á. Qualitative Analysis and Simultaneous Determination of Six Filipendula Salicylates with Two Standards by LC-MS. Accepted for publication in Chromatographia, in press. 4. Alberti Á, Blazics B, Kéry Á. (2008) Evaluation of Sempervivum tectorum L. flavonoids by LC and LC-MS. Chromatographia 68: S107-S111. 5. Hevesi Tóth B, Blazics B, Kéry Á. (2008) Polyphenol composition and antioxidant capacity of Epilobium species. J Pharm Biomed Anal 49: 26-31. 3
Bevezetés A természetes molekulák a szintetikus gyógyszeripari termékek sikerének ellenére ma is értékes vezérmolekulákként szolgálnak és kivételes hatást gyakorolnak a gyógyszeripari kutatás-fejlesztés irányaira. Napjaink gyógynövényekkel kapcsolatos különösen aktív kutatásai a terápiás hatásprofil és növényi hatóanyagok szinerg kölcsönhatásainak molekuláris biológiai tesztrendszerekkel történő feltárására, illetve a gyógynövények klinikai, farmakokinetikai, biomedicinális értékesíthetőségének vizsgálatára fókuszálnak. Az EMEA és az FDA előírásai alapján a növényi hatóanyagok azonosítása és azok tartalmi szintjének meghatározása, a minőségbiztosítás és standardizálás előfeltétele és egyben követelménye a modern bizonyítékokon alapuló fitomedicnák létrehozásának. A gyógynövénykivonatok és növényi gyógyszerek mindig több, nem ritkán többszáz komponsű, kémiailag gyakran nem pontosan definiált szerkezetű ható- és ballasztanyagok keverékei. Mindez a növényi gyógyszer minőségi vizsgálatában és analitikai értékelésében komoly kihívást jelent, a kromatográfia tehát elengedhetetlen a fitoanalitikában. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) hagyományosan kapcsolt detektorok (UV, refraktív index, fluoreszcens) szeletívitása, érzékenysége és hatékonysága a mai kor követelményei nem tudnak maradéktalanul eleget tenni. A tömegspektrometria ugyankkor jó érzékenységet és szeletívitást biztosít, HPLC-vel kapcsolva (LC-MS) pedig összetett, nagyszámú, eltérő komponenst tartalmazó biológiai minták hatékony és gyors analízisét teszi lehetővé. Az illékony és jellemzően apoláris komponensek analízisére a gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria nyújt hatékony megoldást. Mivel a tipikus gyógyszermolekulák inkább polárisak és vizoldékonyak az LC-MS nagyobb jelentőséggel bír mint a GC-MS. A kapcsolt tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS) jó pontosság és ismételhetőség mellett szelektív és érzékeny kvantálást, valamint fragmentáció révén részletes szerkezetkutatást tesz lehetővé, szinte bármilyen komplex folyékony minta vizsgálatára alkalmas. Bár teljes molekulaszerkezet meghatározására csak a mágneses magrezonancia spektroszkópia (NMR) képes, az LC-MS sokkal rövidebb analízis időt tesz lehetővé, izolációt nem igénylő összetett minták analízisére is ppb szinten használható. Az LC-MS a komplex minták hatékony elemzésében napról napra válik analitikai rutinkészülékké. 4
Célkitűzések Munkánkat kettős célkitűzés vezérelte. Egyrészt célunk volt néhány eddig nem kielégítően feltárt tradícionális gyógynövény újraértékelése tartalmi és hatóanyagaik feltárásával és mennyiségi vizsgálatával. A kiválasztott, jelentős biológiai hatással rendelkező, változatos fenoloid tartalmú gógynövények vizsgálatára modern folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometriai módszereket alkalmaztunk. Másrészt célunk volt hogy konkrét növényi minták vizsgálatával korszerű fitoanalitikai LC- MS módszerek adaptálása és fejlesztése révén alternatívát kínáljunk nem kellően hatékony fitoanalitikai módszerek helyett. Célunk volt további adatok szolgáltatása az LC-MS módszerek kvalitatív és kvantitatív fitokémiai lehetőségeinek megismeréséhez, a fenoloidok MS adattárának bővítése, lehetőségekre és korlátokra kitérő következtetések megfogalmazása. Vizsgálati modellnövényeinket úgy választottuk meg, hogy azok reprezentatív módon mutassák a jelentős biológiai és farmakológiai hatással rendelkező fenoloidok változatosságát az egyszerű fenolsavaktól a bonyolultabb flavonoid glikozidokon át a makrociklusos polifenolokig. A farmakológiai jelentősség mellett azért is esett a fenoloid tartalmú példanövényekre a választás, mert a fenoloidok hatóanyagokként, gyakran ballasztanyagokként szinte minden növénymintában, készítményben jelen vannak, analítikájuk ezért különösen fontos. A fenti kettős célkitűzés értelmében mennyiségileg és minőségileg kívántuk tanulmányozni a szemészeti megbetegedésekben tradícionálisan használt Euphrasia rostkoviana HAYNE (szemvidítófű) fenoloid hatóanyagait, melyek azonosításához in vitro antioxidáns assay-ket alkalmaztunk. Célunk volt a szemvidítófű főkomponensének, az akteozid tartalmi szintjének meghatározása. Célul tűztük ki a Satureja hortensis (borsikafű) antioxidáns főkomponensének, a rozmaringsavnak részletes kvantitatív analízisét. Kvalitatív és kvantitatív céllal vizsgáltuk a Filipendula ulmaria L. (réti legyezőfű) kevéssé ismert lázcsillapító és gyulladáscsökkentő hatással rendelkező fenoloid vegyületeit. A flavonoid és egyéb szerkezetű fenoloidok azonosítása mellet célunk volt a hatáshordozó szalicilát típusú vegyületek meghatározása. Mivel a glikozilációs status jelentősen befolyásolhatja a biohasznosíthatóságot, glikozid szinten kívántuk feltárni a Sempervivum tectorum L. (kövirózsa) flavonoid komponenseit. 5
Célunk volt a Sempervivum flavonoidok glikozilációs profiljának feltárása, a cukrok minőségének, kapcsolódási pontjainak és sorrendjének meghatározása. A Epilobium parviflorum Schreb. (kisvirágú füzike) minőségbiztosításában használható, részletes tömegspektrometriai adatokat kívántuk szolgáltatni az makrociklusos szerkezetű farmakológiailag aktív főkomponense, az oentohein B szerkezetét és fragmentációját illetően. Anyagok és módszerek Vizsgált növényi minták Vizsgálatainkhoz saját termesztésű, gyűjtött és kereskedelmi forgalomból származó növénymintákat használtunk: Euphrasia rostkoviana Hayne (herba, gyűjtés helye: Mures megye, Románia, 2006. július), Filipendula ulmaria L. Maxim (herba és flos, gyűjtés helye: Bükkszentkereszt, Magyarország, 2007. június), Sempervivum tectorum L. (flos, termesztés helye: Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar tankert, Soroksár, 2008.), Satureja hortensis L. (herba, kereskedelmi minta), Epilobium parviflorum Schreb. (herba, gyűjtés helye: Budai-hegység, Magyarország, 2006.). A növényi minták makroszkópos és mikroszkópos azonosítását a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézetében végeztük, ahol a herbáriumi ellenminták is elhelyezésre kerültek. Extrakció és mintaelőkészítés Az Epilobium minta kivételével a vizsgálati drogból metanollal Soxhlet extraktor alkalmazásával készítettünk kivonatot a Ph. Hg. VIII. irányelvei alapján. Az Epilobii herba-t 80% (v/v%) acetonnal extraháltuk ultrahangos vízfürdőben. A kivonatok főbb anyagcsoportjainak elválasztására valamint azok tisztítására (kivéve a Filipendula és Satureja minták) SPE módszereket alkalmaztunk. A cartridge-ok (Supelclean LC-18 500 mg/3ml) kondícionálását metanollal, majd 2,5% (v/v%) ecetsavas vízzel végeztük. A minta komponenseket három lépcsőben, 25%, 70% és 100% (v/v%) metanollal eluáltuk. A Sempervivum és Epilobium minták esetéebn az elúció csak két lépsében zajlott (70 és 100%). Az Euphrasiae herba összkivonatot az in vitro antioxidáns hatás vizsgálatokhoz poliamid oszlopkromatográfiával frakcionáltuk, szukcesszív módon vízes, vízes-metanolos és metanolos elúcióval. Az Euphrasia extraktum antioxidáns főkomponensét szintén poliamid oszlopkromatográfia segítségével izoláltuk. 6
Antioxidáns hatás vizsgálat Az Euphrasiae herba összkivonat és frakciók szabadgyökfogó képességét in vitro dekolorizációs spektrofotometriás módszerrel vizsgáltuk ABTS + és DPPH mesterséges szabadgyökök felhasználásával. A minták antioxidáns hatását IC 50 értékekkel jellemeztük és vetettük össze. Mágneses magrezonancia spektroszkópia Az Euphrasia izolált főkomponensének MS eredményeket megerősítő szerkezetazonosítását egy 600 MHz Varian VNMRS NMR spektrométer alkalmazásával végeztük el. Az NMR spektrométer egy 5 mm-es duál inverz-detektoros grádiens (IDPFG) mintafejjel volt szerelve. A mintáról 1 H, 13 C, COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC spektrumokat vettünk fel. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria (HPLC-MS) A minták vizsgálatához egy Agilent 1100 HPLC rendszerrel kapcsolt elektroporlasztásos ionforrással (ESI) szerelt Agilent 6410 hármas kvadrupól (QQQ) tandem tömegspektrométert használtunk negatív ionizációs üzemmódban. A pontos tömeg és az elemösszetétel meghatározását egy duál-esi forással ellátott Agilent 6210 repülési időanalizátoros (TOF) tömegspektrométerrel végeztük. A mintakomponensek elválasztására fordított fázisú C18 HPLC oszlopokat használtunk. Az eltérő öszzetételű minták analízisére számos grádiens HPLC módszert fejlesztettünk ki és/vagy adaptáltunk ecetsavas vagy hangyasavas víz és acetonitril vagy metanol eluensek alkalmazásával. Az UV detektort és a tömegspektrométert minden esetben párhuzamosan használtuk az adatfelvételre. Az ESI bellításokat és az ütközési cellfeszültséget minden kvantitatív meghatározás előtt optimalizáltuk. A minta molekulák azonosítását azok UV, MS scan és ütközés indukált tandem tömegspektrumaik kiértékelése, hiteles standard anyagok azonos adatiaval és szakirodalmi adatokkal való összvetése alapján végeztük. A kvantitatív módszereket validáltuk (línearitás, napok közti és napon belüli ismételhetőség, pontosság, kimutatási és maghatározási határok, visszanyerés), korlátozó tényezők esetén a módszer főbb teljesítményjellemzőit tanulmányoztuk. 7
Eredmények és megbeszélés A célkitűzéseinkben szereplő analitikai feladatokat nagy érzékenységgel és jó szelektívitással sikerült elvégeznünk, az LC-MS/MS széleskörűen használható rendkívül hatékony analitikai eszköznek bizonyult. Számos, tradícionálisan régóta ismert gyógynövény újraértékeléséhez szolgáltattunk értékes kvalitatív és kvantitatív adatokat. Fitokémia Euphrasia rostkoviana Hayne Vizsgálataink alapján a szemvidítófű jelentős mennyiségben tartalmaz flavonoidokat és egyéb fenoloidokat, a tartalmi meghatározások eredményei a következők: összes flavonoid: 0,38 ± 0,03 g/100g (hiperozid), összes polifenol: 1,47 ± 0,09 g/100g (pirogallol), cserzőanyag: 0,56g ± 0,04 /100g (pirogallol) és összhidroxifahájsav származék: 1,97 ± 0,09 g/100g (rozmaringsav). Elsők között szolgáltattunk részletes adtaokat az Euphrasia rostkoviana Hayne fenoloidjainak szabafgyökfogó képességéről, és megállapítottuk, hogy az összkivonat metanolos frakciói jelentős, koncentrációfüggő szabadgyökfogó képességet mutattak mindkét in vitro vizsgálati tesztrendszerben. Legerősebb antioxidánsnak az I. frakció bizonyult (DPPH IC 50 : 11,88 ± 0,39 µg/ml, ABTS IC 50 : 4,24 ± 0,18 µg/ml), mely egyedüli komponensként egy fenil-propán származékot tartalmazott nagy tisztaságban. Általánosságban elmondható, hogy a fenil-propán származékokban és rutinban együttesen gazdag frakciók voltak a legpotensebb antioxidánsok. A szemvidítófű komplex kivonatainak tradícionálisan ismert gyulladáscsökkentő hatása feltételezhetően részben fenoloid komponenseinek számottevő antioxidáns hatásával magyarázható. Bár az alkalmazott két antioxidáns assay eredményei alapján aligha egyszerű és releváns messzemenő következtetéseket levonni, a vizsgált komponesek szabadgyökfogó képességének körvonalazására a rendszerek alkalmasak és további vizsgálatokhoz szolgáltathatnak alapot. Az antioxidáns hatás és szerkezet közötti összefüggések felderítése céljából az Euphrasia frakciókat LC-DAD-MS/MS, LC-TOF és NMR módszerekkel vizsgáltuk. Összesen hét egyszerű fenolsavat, tíz luteolin, kaempferid, kvercetin, apigenin és izorhamnetin aglikonnal rendelkező glikozidot és számos aglikont azonosítottunk vagy jellemeztünk. Az összkivonat főkomponesét, melyet az I frakció nagy tisztaságban tartalmazott, az MS/MS és TOF eredmények alapján akteozidként jellemeztük. Az azonosságot NMR módszerekkel igazoltuk. 8
Az akteozid számos biológiai hatása mellett jelentős antioxidáns is, ezért meghatároztuk a drog összkivonatának akteozid tartalmát. Az akteozid magas izolációs tisztasága ( 97.1%) és kitermelése (51 mg) lehetővé tette, hogy külső standard-ként használjuk a kalibráció során. A szemvidítófű számottevő akteozid tartalommal rendelkezik (2,56 ± 0,19 g / 100 g drog, n = 3), mely részben magyarázhatja a drog kivonatának gyulladásos szembetegségek esetén tapasztalt gyógyító hatását. A módszervalidálás során minden vizsgált paraméter a szokásosan elfogadott határokon belül volt. Irodalomkutatásunk alapján az akteozidot, mely az Euphrasia potenciális hatóanyaga, még senki nem azonosította és nem kvantálta az Euphrasia rostkoviana-ban. Satureja hortensis L. A borsikafű antioxidáns főkomponensét LC-DAD-MS/MS módszerekkel rozmaringsavként azonosítottuk. Az 50%, 70%, 96% és 100% etanollal készített Satureja extraktumokban UV detektálással meghatároztuk a drog rozmaringsav tartalmát. Legjelentősebb hatóanyagtartalommal a 70%-os extraktum rendelkezett (6.69 ± 0.05 (átlag ± SD) extraktum%). A rozmaringsav tartalom meghatározása egy vélhetően az ionforrásban végbemenő nem kvantitatív dimerképződés miatt sem SIM sem SRM üzemmódban nem volt kivitelezhető. Filipendula ulmaria L. A herba és virág minták metanolos kivonataiban összesen hat szalicilátot, tizennégy fenoloidot, köztük kvercetin- és kaempferol- aglikonokat és glikozidokat azonosítottunk vagy jellemeztünk. Az ecetsav-víz eluens kromatográfiás alkalmazását intenzív adduktképződés tette lehetetlenné. A hangyasav használata csak részben oldotta meg a problémát, formiát adduktok, ugyan csak elhanyagolható mennyiségben, de szintén megjelentek a tömegspektrumokban. A szalicilát típusú komponesek között szabad és glükokonjugált szalicilsavat, monotropitint és szalicint azonosítottunk, valamint az UV és tandem tömegspektrumok alapján két összetevőt szalicilalkohol származékként írtunk le. Mivel a szalicilátok számos és jelentős farmakológiai hatással rendelkeznek, meghatároztuk a herba és virág minták szalicilsav és szalicin tartalmát SIM üzemmódban, külső standard kalibrációs módszerrel a megfelelő standard-ok felhasználásával. A további négy szalicilát menniységét -melyek standard-ként nem beszerezhetők- szintén a szalicin és szalicilsav kalibrációjával határoztuk meg feltételezve, hogy azok ESI érzékenysége és ionizációja a két standard-ével összevethető. A standard-al nem rendelkező négy szalicilát tartalmi eredménye 9
ezért csak közelítő becslésként értelmezhető, noha ennél pontosabb eredményeket szolgáltató módszer nem elérhető. Az egyes szalicilátok tartalma a herba és flos mintákban 0,0002 ± 0,0001 és 8,36 ± 0,20 mg/1 g drog (átlag ± S.D.) között ingadozott. A kvantitatív módszer ismételhetősége, pontossága és minden, a validálás során vizsgált teljesítményjellemzője az általánosan elfogadott értékhatárokon belül volt, kivéve a szalicin visszanyerését (54.1 %, RSD % = 9.43, n=3). Ez részben a szalicin formiát addukt képződésével, részben a molekula hidrolízisével magyarázható. Mind a hat szalicilát, eltérő menniységben, kimutatható volt a herba és a virág mintában. A Filipendula ulmaria korábban még sosem került ilyen részletes kvalitatív és kvantitatív vizsgálatra. Jelen munka az első mely részletes kvantitatív adatokat közöl a Filipendula szalicilátokról, jelentősen kiegészítve ezzel a növényi szalicilátokismeretét is. Sempervivum tectorum L. Összesen hét kaempferol és kvercetin aglikonnal rendelkező di-, tri, és tetra glikozidot azonosítottunk a Sempervivum levél metanolos extraktumában. Feltételeztük, hogy a leírt magas polaritású flavonoid glikozidok fontos szerepet játszhatnak a kövirózsa tradícionálisan ismert gyulladáscsökkentő hatásában. Munkánk elsőként jellemezte a Sempervivum flavonoidokat glikozid szinten. Epilobium parviflorum Schreb. Sikerrel jellemeztük és fejtettük meg az Epilobium fajok jellemző makrociklusos polifenol hatóanyaga, az oentothein B tandem tömegspektrometriás fragmentációját. A célmolekulát egyszeres ([M-H] - ) és kétszeres ([M-2H] 2- ) töltésű molekulaionként egyszerre detektáltuk. A két molekulaion együttes jelenléte, azok eltérő fragmentációs mintázata jól kiegészítette egymást és hatékonyan segítette a szerkezet azonosítást. Számos vizsgálat igazolta az oenothein B pozitív hatását benignus prosztata hiperpláziában. Konklúzió A szemvidítófű kivonatokban összesen tizenhét egyszerű fenoloidot és flavonoid glikozidot azonosítottunk és/vagy jellemeztünk LC-MS/MS módszerekkel, melyek közül egy fenolsavat, egy fenilpropán glikozidot, egy flavonoid aglikont és hat flavonoid glikozidot elsőként írtunk le a fajban. 10
A növényvilágban széleskörűen előforduló akteozid fenilpropán származékot izoláltuk, szerkezetét UV, NMR és MS módszerekkel azonosítottuk és elsőként írtuk le az Euphrasia rostkoviana-ban. Validált, jó precízitású és pontosságú SRM módszert dolgoztunk ki, mellyel ppb szinten elsőként határoztuk meg a szemvidítófű akteozid tartalmát. In vitro antioxidáns hatásvizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy a jelentős koncentrációban feldúsuló akteozid az Euphrasia rostkoviana hatóanyagának tekinthető. Satureja kivonatok példáján kísérletesen igazoltuk, hogy, vélhetően a ionforrásban végbemenő, nem-kvantitatív dimérképződés miatt az antioxidáns rozmaringsav kvantálása tömegspektrometriás detektálással sem SIM, sem SRM üzemmódban nem végezhető el. Tapasztalataink alapján a rendelkezésre álló műszerrel ismertetett vizsgálati körülmények mellett a rozmaringsav mennyiségi meghatározásához az UV detektálás a választandó módszer. Az összesen vizsgált tíz flavonoid, négy fenilpropán származék és hat szalicilát közül öt flavonoidot, három fenilpropán származékot és három szalicilátot elsőként írtunk le a Filipendula ulmaria-ban. Elsőként határoztuk meg hat szalicilát mennyiségét SIM üzemmódban szalicin és szalicilsav standardok segítségével a herba és flos mintákban. Hozzájárultunk a növényi szalicilátok terápiás jelentőségéhez képest alig feltárt fitokémiájának megismeréséhez. Az eltérő mechanizmussal keletkező (Y 0-2H) -, (Y 0 -H) - és (Y 0 ) - fragmens ionok relatív intenzitásai alapján elsőként térképeztük fel számos Sempervivum flavonoid di-, tri- és tetar glikozid biohasznosulás szempontjából fontos, feltételezett glikozilációs profilját, a cukrok kapcsolódási helyét és sorrendjét. Az egyszeres [M-H] - és kétszeres [M-2H] 2- töltésű molekulaionok szimultán vizsgálata alapján elsőként írtuk le az oenothein B makrociklusos fenoloid tömegspektrometriás fragmentációját az Epilobium parviflorumban. A kapcsolt tandem tömegspektrometria számos előnyei közül elsőként érdemel kiemelést az eredmények információsűrűsége; egy scan spektrum felvételével egyszerre nyertünk információt a vizsgált molekula tömegéről, esetleges izotopjairól, N atomtartalmáról valamint a szén atomszámáról. Az ütközés indukált hasadás (CID) gazdag szerkezeti információkat 11
szolgáltatott, a SIM és SRM üzemmódok szelektív és érzékeny kvantálást tettek lehetővé. A tömegspektrometriás detektálás jóval hatékonyabb csúcstisztaságvizsgálatot tett lehetővé, mint az UV detektor. A konkrét vizsgálati minták során nyert tapasztalatok alapján rámutattunk a módszer előnyeihez képest elhanyagolható jelentőségű hátrányaira is. A tömegspektrometria nem szolgáltatott információt a molkeulák izomériájával kapcsolatosan (pl. orto, meta vagy para kumársav, cukorkomponensek sztereokémiája). Az nagy tömegszámú (7-800 Da) rokon szerkezetű izobár flavonoid glikozidok aglikonjainak megkülönböztetése nehézségekbe ütközött (luteolin, kaempferol). A Filipendula minták esetében zavaró, a spektrumok értelmezését nehezítő acetát és formiát adduktképződést tapasztaltunk. Jelentős, mennyiségi és minőségi adattal járultunk hozzá a példaként szerepeltetett tradícionális gyógynövények tudományos újraértékeléséhez. 12
A disszertáció témájához közvetlenül kapcsolódó publikációk Közlemény folyóiratban B. Blazics, Á. Kéry Antioxidant activity of compounds in Euphrasia officinalis L. - revaluation of a traditional medicinal plant Planta Medica (2007) 73: P_266 DOI: 10.1055/s-2007-987047 B. Blazics, K. Ludanyi, Sz. Szarka, A. Kery Investigation of Euphrasia rostkoviana Hayne using GC-MS and LC-MS Chromatographia (2008) 68: S119-S124 A. Alberti, B. Blazics, A. Kery Evaluation of Sempervivum tectorum L. Flavonoids by HPLC and LC-MS Methods Chromatographia (2008) 68: S107-S111 B. Hevesi Tóth, B. Blazics, Á. Kéry Polyphenol composition and antioxidant capacity of Epilobium species Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2009) 49: 26-31 Blazics B., Alberti Á., Kéry Á. Az Euphrasia rostkoviana Hayne fenoloid tartalmú frakcióinak antioxidáns értékelése Acta Pharmaceutica Hungarica (2009) 79: 11-16. B. Blazics, Á. Alberti, Sz. Béni, L. Kursinszki, L. Tölgyesi, Á. Kéry Identification and LC-MS/MS determination of acteoside, the main antioxidant compound of Euphrasia rostkoviana, using the isolated target analyte as external standard Journal of Chromatographic Science (2010) - közlésre elfogadva, nyomdában B. Blazics, I. Papp, Á. Kéry Qualitative Analysis and Simultaneous Determination of Six Filipendula Salicylates with Two Standards by LC-MS Chromatographia (2010) - közlésre elfogadva, nyomdában Előadás Blazics B., Kéry Á. Az Euphrasia officinalis L. (szemvidítófű) fenoloidjainak LC-MS/MS vizsgálata - Magyar Kémikusok Egyesülete, Fiatal Analitikusok Előadóülése, Budapest 2007. 11. 20. Blazics B., Kéry Á. Egy tradicionálisan gyulladáscsökkentő gyógynövény, a szemvidítófű vizsgálata Lippay- Vass-Ormos Tudományos Ülésszak, Corvinus Egyetem, Budapest, 2007. 11. 7-8. 13
Blazics B., Kéry Á. Az Euphrasia rostkoviana Hayne fitokémiai vizsgálata Mozsonyi Sándor Alapítvány 20. Jubileumi Tudományos Ülés, Budapest, 2008. 04. 18. Blazics B., Alberti Á., Hevesi T. B., Szőke É., Kéry Á. Tandem tömegspektrometriás tapasztalataink a fenoloidok/flavonoidok vizsgálatában X. Gyógynövény Szimpózium, Pécs 2008. 10. 16-18. Blazics B., Kursinszki L. Tandem tömegspektrometriás tapasztalatok a gyógynövényanalitikában - lehetőségeken innen, korlátokon túl Agilent LC-MS szeminárium, Budapest, 2008 10. 22. Alberti Á., Blazics B., Kéry Á. A Sepmervivum tectorum L. flavonoid-glikozidjainka vizsgálata MTA Flavonoidkémiai munkabizottság tudományos előadóülése, Debrecen, 2008. 10. 20. Blazics B., Kursinszki L., Albert Á., Kéry Á., Szőke É. Tandem tömegspektrometria a fenoloidok fitokémiájában gyakorlati tapasztalatok MGYT Gyógyszeranalitikai Szakosztály tisztújító ülés és előadói nap, Budapest, 2009. 01. 14. Hevesi Tóth B., Blazics B., Szarka Sz., Houghton P., Kéry Á. Az Epilobii Herba fitoterápiás értékelése Semmelweis Phd Tudmányos Napok - Budapest, 2009. 03. 30-31. Alberti Á., Blazics B., Béni Sz., Paput L., Kéry Á. A Sempervivum tectorum fenoloidjainak fitokémiai és in vitro vizsgálata XIV. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus, Budapest, 2009. 11. 13-15. Poszterbemutató Blazics B., Hevesi T. B., Kéry Á. Tradicionális gyógynövények újraértékelése: a szemvidítófű (Euphrasia officinalis L.) vizsgálata - XI. Magyar Gyógynövény Konferencia, Dobogókő 2005. 10. 13-15. Blazics B., Kéry Á. Antioxidant activity of compounds in Euphrasia officinalis L. revaluaation of a tradicional medicinal plant - GA 2007, Graz, Ausztria 2007. 09. 02-06. Blazics B., Ludányi K., Szarka Sz., Kéry Á. Reinvestigation of Euphrasia officinalis L. using various chromatographic techniques from TLC to LC-MS/MS - 7. Balaton Symposiumm, Siófok 2007. 09. 05-07. Alberti Á., Blazics B., Szőke É., Kéry Á. Evaluation of Sempervivum tectorum L. flavonoids with HPLC and LC-MS methods, 7. Balaton Symposium, Siófok 2007. 09. 05-07. 14
Blazics B., Ludányi K., Szarka Sz., Kéry Á. Reinvestigation of Euphrasia officinalis L. using various chromatographic techniques from TLC to LC-MS/MS - Gyógynövény Szimpózium, Szeged 2007. 10. 18-19. Hevesi T.B., Blazics B., Kéry Á. Polyphenol Composition and Antioxidant Capacity of Some Epilobium Species - 19th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Gdansk, Lengyelország 2008. 06. 08-12. Blazics B., Béni Sz., Szőke É., Kéry Á. Az Euphrasia rostkoviana antioxidáns fenoloid főkomponensének meghatározása LC- MS/MS módszerrel Magyar Elválasztástudományi Társaság vándorgyülése, Sárvár 2008. 11. 5-7. Blazics B., Béni Sz., Szőke É., Kéry Á. Az Euphrasia rostkoviana antioxidáns fenoloid főkomponensének meghatározása LC- MS/MS módszerrel Semmelweis Phd Tudományos Napok, Budapest, 2009. 03. 30-31. Alberti Ágnes, Blazics Balázs, Szőke Éva, Kéry Ágnes Kövirózsa (Sempervivum tectorum L.) flavonoidjainak LC-DAD-MS/MS vizsgálata Semmelweis Phd Tudományos Napok, Budapest 2009. 03. 30-31. Á. Alberti, B. Blazics, L. Paput, Á. Kéry Phenolic composition and in vitro antioxidant activity correlation in Sempervivum tectorum extracts 5th congress of the Hungarian Society for free radical research, Szeged 2009. 08. 27-29. Blazics B., Papp I., Kéry Á. Qualitative Analysis and Simultaneous determination of Filipendula Salicylates by LC-MS - 8. Balaton Symposium, Siófok 2009. 09. 02-04. Blazics B., Papp I., Kéry Á. Filipendula szalicilátok kvalitatív és kvantitatív analízise - XIV. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus, Budapest 2009. 11. 13-15. 15
Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki Dr. Szőke Évának, a Farmakognózia Intézet korábbi igazgatójának, aki biztosította Ph.D. kutatómunkám kereteit, és aki a Farmakognózia Intézet kutatói tevékenységeinek jelentős és felelősségteljes részesévé tett. Külön köszönöm nagylelkű, mindenre kiterjedő támogatását mellyel nemcsak szakmai, hanem emberi fejlődésemet is segítette. Köszönöm Dr. Blázovics Annának, a Farmakognózia Intézet jelenlegi igazgatójának a támogatást és, hogy szakmai érdeklődésemet új kutatási tervei révén sosem hagyta lankadni. Hálásan köszönöm Dr. Kéry Ágnes témavezetőm türelmes kutató-oktató munkáját, amivel TDK munkámat egyengette, és optimista, ambícionáló témavezetését Ph.D. éveim alatt. Külön köszönöm, hogy témavezetése során mindig egyenrangú partnerként és nem beosztottként tekintett rám. Köszönöm Dr. Kursinszki László docens úrnak hogy a kromatográfiás kérdésekben bármikor kész volt a konzultációra. Kifejezett köszönettel tartozom Dr. Ludányi Krisztinának, a Gyógyszerészeti Intézet docensének, aki kiváló és türelmes tanárom volt a tömegspektrometriában. Köszönöm Alberti Ágnes, Hevesi Tóth Barbara, Szarka Szabolcs, Bányai Péter és az összes Ph.D. hallgató-/rezidenstársam napi munkám során nyújtott segítségét, a közösen töltött vidám órákat laborban és laboron kívül. Köszönöm Szabolcsnak a gázkromatográfiás vizsgálatban nyújtott segítségét. Köszönöm Kriston Annának a laboratóriumi mintaelőkészítésben nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Béni Szabolcsnak, a Gyógyszerészi Kémiai Intézet tanársegédjének NMR analízisben nyújtott lelkiismeretes munkáját. Köszönöm Tölgyesi Lászlónak, az ELTE Elválasztástudományi és Kromatográfiás Oktatólaboratórium munkatársának a TOF analízisben nyújtott segítségét, és, hogy a tömegspektrometriát érintő problémákban mindig rendelkezésemre állt. Végül megköszönöm családom és Évám őszinte bátorítását, hitét és türelmét. 16