HO HO SALSOLINOL: A PROLAKTIN ELVÁLASZTÁS ÚJ CH 3 NH REGULÁTORA ÉS LEHETSÉGES HATÁSMECHANIZMUSA dr. Radnai Balázs doktori (Ph.D.) értekezése Témavezető: Prof. Dr. Nagy György Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Sejt- és Molekuláris Neuroendokrinológiai Laboratórium Semmelweis Egyetem Idegtudományok Doktori Iskola (vezető: Prof. Dr. Réthelyi Miklós) Neuroendokrinológia programja (vezető: Prof. Dr. Halász Béla) Budapest, 2004
Édesanyám emlékére. - 2 -
A DOLGOZATBAN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE: AL hypophysis mellső lebeny (anterior lobe) c koncentráció (concentration) camp ciklikus adenozin-monofoszfát CL kapilláris hurok (capillary loop) DA Dopamin DAerg Dopaminerg DAT Dopamin transzpoter DOPA 3,4- Dihidroxifenilalanin EM eminentia mediana ICV intracerebroventricularis IL hypophysis közti lebenye (intermediate lobe) IZ-AL Hypophysis mellső lebenyének belső zónája (Internal Zone of Anterior Lobe) LPV hosszú portális vénák (long portal vein) LTC Laktotrop sejtek (lactrotroph cells) NIL hypophysis közti-hátsó lebeny (neuro-intrmediate lobe) NL hypophysis hátsó lebeny (neural lobe) NSB nem specifikus kötés (non specific bound) OZ-AL Hypophysis mellső lebenyének külső zónája (Outer Zone of Anterior Lobe) PHDA periventriculo-hypophysealis dopaminerg rendszer PIF prolaktin elválasztást gátló PRF PRL faktorok (prolactin inhibiting factor) prolaktin elválasztást serkentő faktor (prolactin releasing factor) Prolaktin SB Specifikus kötés (specific SEM SPV bound) Az átlag hibája (standard error of mean) Rövid portális vénák (short portal vein) THDA Tubero-hypophysealis dopaminerg rendszer TIDA Tubero-infundibularis dopaminerg rendszer VMAT Vezikuláris monoamin transzporter - 3 -
Technikai megjegyzések: - A dolgozat megírásakor az ORVOSI HELYESÍRÁSI SZÓTÁR (Akadémia kiadó, 1992) ajánlását vettem alapul. A szabályosként elfogadott esetekben az eredeti terminológiát igyekeztem alkalmazni. - A rövidítések jegyzékében csak a gyakran előforduló, rendszeresen használt rövidítések találhatók, egyéb esetben a rövidítés jelentésének feloldására az első említéskor kerül sor, zárójelben jelölve azt. - Az irodalmi hivatkozások az első előfordulás szerinti növekvő számozással kerültek jelzésre, így az irodalomjegyzék is előfordulás szerinti, és nem alfabetikus sorrendben olvasható. - A szövegtörzs Times New Roman karakterkészlet 12 pontos méretében, míg a tartalomjegyzék 10 pontos méretben íródtak. - A számszerű eredményeket ismertető táblázatok sorszámozás nélkül kerültek ismertetésre, tekintettel arra, hogy azokra többszöri hivatkozás nem történik. - Statisztikai eredmények ismertetésekor az átlag ± átlag szórása formátumot alkalmaztam. Az ettől való eltérést külön jeleztem. - Az eredmények ismertetésekor a diszkusszió alapjául szolgáló következtetéseket a bekezdés melletti függőleges piros vonallal jelöltem. - Az értekezésben saját kísérleteimet ismertettem, így a diszkusszió alapjául is ezek szolgálnak. Munkacsoportunk salsolinollal kapcsolatos kutatási eredményeit a komplex kép kialakulása céljából célszerűnek láttam az értekezés végén, a VII. fejezetben külön alfejezetként tárgyalni. Ezen eredmények döntő része az egész munkacsoport összehangolt munkájának eredménye, a saját vizsgálatokat vastag szedéssel jelöltem. - 4 -
TARTALOMJEGYZÉK ÁBRÁK JEGYZÉKE ÉS MAGYARÁZATA 7 TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 8 ÖSSZEFOGLALÁS 9 SUMMARY 11 I. BEVEZETÉS 13 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 15 1. A prolaktin 15 1.1. A prolaktin kémiai szerkezete, szintézise 18 1.2. A PRL receptor 18 1.3. A prolaktin biológiai hatásai 21 1.3.1. Prolaktin és laktáció 21 1.3.2. A prolaktin egyéb biológiai hatásai 21 2. A prolaktin elválasztás szabályozása 23 2.1. A prolaktin elválasztást gátló tényezők, hatásmechanizmusok 24 2.1.1. Dopamin 24 2.1.1.1. A dopamin anyagcseréje és hatásmechanizmusa 24 2.1.1.1.1. A dopamin kémiai szerkezete, bioszintézise, eliminációja 24 2.1.1.1.2. dopamin receptorok 28 2.1.1.2. A dopamin szerepe a neuroendokrinológiai szabályozó mechanizmusokban 29 2.1.1.3. Neuroendokrin dopaminerg pályarendszerek és azok szerepe a prolaktin elválasztás szabályozásában 30 2.1.2. További prolaktin inhibitorok 36 2.2. A prolaktin elválasztást fokozó ismert faktorok, azok hatásmechanizmusa 37 2.3. A hypophysis közti-hátsó lebenyének szerepe a prolaktin elválasztás szabályozásában 41 2.3.1. A közti lebeny szerepe 41 2.3.2. A hátsó lebeny szerepe 42 3. A salsolinol 45 3.1. A salsolinol kémiai szerkezet, szintézisének módjai 46 3.2. A salsolinol hatása a prolaktin elválasztásra 47 3.3. A salsolinol és származékainak egyéb ismert hatásai 48 III. CÉLKITŰZÉSEK 49 IV. MÓDSZEREK 50 1. Kísérleti állatok és műtéti beavatkozások 50 2. Alkalmazott módszerek 50 2.1 Receptor binding assay 50 2.1.1. Kísérleti preparátumok 51 2.1.2. A mért adatok feldolgozása 51 2.1.2.1. Scatchard analízis 51 2.1.2.2. Hill plot módszer 54 2.1.3. Dopamin ( 3 H-spiperone) receptor binding assay 55 2.1.4. 3 H-salsolinol receptor binding assay 56 2.2. Direkt leszorításos vizsgálatok 57 2.2.1. Direkt leszorításos vizsgálatok D 2 receptor kötési helyéről 57 2.2.2. Direkt leszorításos vizsgálatok salsolinol kötési helyről 58 2.3. Intracelluláris camp szint meghatározása 58-5 -
3. Statisztikai analízis 59 V. EREDMÉNYEK 60 1. Salsolinol hatása a dopamin D 2 receptorra 60 2. Salsolinol specifikus kötőhelyeinek vizsgálata 3 H-salsolinol receptor binding assay módszerrel 63 2.1. Salsolinol kötőhelyek a hypophysisben 63 2.2. Salsolinol kötőhelyek a hypothalamo-hypophysealis rendszerben laktáló és szoptató állatokban 65 2.3 Salsolinol kötőhelyek egyéb agyi régiókban 67 3. 3 H-salsolinol leszoríthatósága kötőhelyéről homológ leszorítási vizsgálatokkal 69 4. Szoptatás hatása az intracelluláris camp szintre 72 5. Salsolinol kezelés hatása az intracelluláris camp szintre 74 VI. DISZKUSSZIÓ 76 1. A salsolinol specifikus kötőhelye(i) 79 2. A salsolinol hatása az intracelluláris camp szintre 82 3. A salsolinol szerepe a szoptatás kiváltotta PRL szint emelkedésben 83 VII. KÖVETKEZTETÉSEK 85 1. Következtetések 85 2. A salsolinol PRL elválasztást serkentő hatásának összefoglalása 87 VIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 89 IX. IRODALOMJEGYZÉK 90-6 -
ÁBRÁK JEGYZÉKE ÉS MAGYARÁZATA 1. ábra A prolaktin előfordulása a szervezetben (bal oldalon a piros színnel a szervek, zöld színnel a szekretáló sejtek, jobb oldalon az elválasztott testnedvek feltüntetésével)....17 2. ábra A prolaktin térbeli modellje (balra) valamint a prolaktin-receptor komplex térbeli elrendeződése (jobbra, a prolaktin molekula sárga színnel kiemelve). A modellek a Cn3D program 4.1-es verziójával készültek. (Forrás: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)...18 3. ábra A prolaktin receptor izoformái és jellemzőik. Módosítva, átvéve (26)...19 4. ábra A prolaktin receptorai, szignáltranszdukciós mechanizmusai. Módosítva, átvéve (25)....20 5. ábra A tuberoinfundibularis dopaminerg rendszert befolyásoló hormonok és neurotranszmitterek (bal oldalon a gátló, jobb oldalon a serkentő hatásúak). Módosítva, átvéve (1)....23 6. ábra A dopamin szintézisének mechanizmusa. A tirozin aktív transzporttal jut a neuron citoplazmájába (1). A tirozin-hidroxiláz enzim (2) L-DOPA szintézisét segíti, mely a DOPA-dekarboxiláz enzim (3) katalízise mellett dopaminná alakul. A dopamin ezután a vezikuláris monoamin transzporter (VMAT) segítségével a szekréciós granulumba kerül (4), ahol tárolódik. Membránfúziót követően (5) ürül az extracelluláris térbe (szinaptikus résbe vagy neuroszekréció esetén az érpályába). A receptorhoz (6) kötődve kifejti hatását, vagy a dopamin-transzporter segítségével (7) visszajut a neuronba. Itt visszajuthat a szinaptikus vezikulumba (8), vagy a mitochondrium külső membránjához asszociált monoamin-oxidáz (MAO) enzim hatására inaktív metabolittá alakul (9). A metabolizmus másik útja a katekolamin-o-metil-transzferáz (COMT) által katalizált reakció (10). Módosítva, átvéve (49)...26 7. ábra A dopamin eliminációja...28 8. ábra Dopamin receptorcsaládok és transzporterek szerkezeti tulajdonságai...29 9. ábra Neuroendokrin dopaminerg pályarendszerek....32 10. ábra A dopaminerg pályarendszerekre ható modulációs lehetőségek. Módosítva, átvéve (1)....35 11. ábra A salsolinol szerkezete....45 12. ábra A dopamin salsolinol szintézisével kiegészített metabolizációs lehetőségei (a salsolinol szintézise pirossal kiemelve)...46 13. ábra A Scatchard egyenes, melynek meredeksége -1/K D, (1) tengely metszete a B MAX....54 14. ábra Hill Plot transzformáció. Magyarázat a szövegben....55 15. ábra: A salsolinol D 2 -es receptorhoz kötődésének jellemzői: kötési kapacitás, affinitás és leszorítás. (A) A D 2 receptor antagonista haloperidol és 10-6 M koncentrációjú salsolinol leszorítási kísérlete D 2 dopamin receptorról. (B) 3 H-Spiperone binding assay: - 7 -
salsolinol hatása a receptorkötésre a Scatchard egyenes feltüntetésével. Magyarázat a szövegben....61 16. ábra 3 H-salsolinol szaturációs görbéje laktáló patkány hypophysisének elülső (A) és közti-hátsó lebenyben (B). A három független kísérletből álló sorozat egyik reprezentatív eredménye. Magyarázat a szövegben...64 17. ábra 3 H-salsolinol receptor binding assay hypophysis közti-hátsó lebenyén (A) valamint az eminentia mediana (B) területén laktáló és szoptató állatok esetében. Három független kísérlet egyik reprezentatív eredménye. Magyarázat a szövegben...65 18. ábra Salsolinol leszorítása kötőhelyéről...69 19. ábra Intracelluláris camp szint patkány hypophysis elülső lebenyének belső (IZ-AL) és külső (OZ-AL) zónájában kontroll állapotban, valamint 10 és 30 percig tartó szoptatást követően. Három független kísérlet eredménye....72 20. ábra Intracelluláris camp szint patkány hypophysis közti- (IL) és hátsó (NL) lebenyében kontroll állapotban, valamint 10 és 30 percig tartó szoptatást követően. Három független kísérlet eredménye...73 21. ábra Salsolinol kezelés hatása az eminentia mediana camp koncentrációjára. Magyarázat a szövegben. Három független kísérlet eredménye....74 22. ábra Salsolinol kezelés hatása hypophysis közti-hátsó, valamint elülső lebenyének camp koncentrációjára. Magyarázat a szövegben. Három független kísérlet eredménye...75 23. ábra A salsolinol lehetséges támadáspontjai és hatásmechanizmusa. A feltételezett gátló hatások piros, a serkentők kék nyíllal jelölve. Magyarázat a szövegben...78 24. ábra Hasonlósági szempontok az noradrenalin-adrenalin és a dopamin-salsolinol rendszer között. Magyarázat a szövegben....80 TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 1. táblázat A neuroendokrin szabályozásban szerepet játszó dopamintartalmú sejtcsoportok elhelyezkedése és az általuk alkotott pályarendszerek...30 2. táblázat 3 H-salsolinol receptor binding assay módszerével mért receptor-ligand kötődési paraméterek különböző agyi struktúrákban...67 3. táblázat 3 H-salsolinol leszorítása specifikus kötőhelyéről különböző anyagokkal, a leszorítás paramétereinek feltüntetésével....70 4. táblázat Eddigi leszorítási kísérleteinkben megvizsgált anyagok, és azok hatása. Bal oldalon piros mezőben a leszorító tulajdonságúak, jobb oldalon kék mezőben a leszorítást nem eredményezők....71-8 -
ÖSSZEFOGLALÁS A prolaktin egy polipeptid szerkezetű hormon, mely a hypophysis mellső lebenyének mammotrop sejtjeiben képződik. Legismertebb, reprodukcióban betöltött szerepén túl a szervezet általános homeosztázisának fenntartásában is szerepet játszik. Szabályozásában eddigi ismereteink szerint- döntően a medialis-bazális hypothalamus területéről származó, tónusos gátló befolyás érvényesül. Az eddig publikált kísérletes eredmények alátámasztani látszottak azt a nézetet, mely szerint a DA tekinthető a prolaktin elválasztás domináns, gátló szabályozójának. A DA a mellső lebenyt a portális keringési rendszeren keresztül elérve tónusos gátló hatást gyakorol a laktotrop sejtek prolaktin elválasztására. Emlősökben bizonyos külső ingerek hatására (például laktáló állatokban az emlőbimbó ingerlésekor) a plazma prolaktin koncentrációja megemelkedik. Ez a változás bekövetkezhet a hypothalamikus DAerg gátló tónus csökkenésén keresztül és/vagy egy eddig ismeretlen hypothalamikus prolaktin releasing hormon (PRF) hatására. Az egyes fiziológiás állapotokban megfigyelhető gyors és átmeneti plazma prolaktin szintemelkedés nem magyarázható kizárólagosan a hypothalamicus DAerg gátlás csökkenésével, annál is inkább, mivel a legtöbb esetben a prolaktin szint növekedését csak kis mértékben és csupán egy nagyon rövid idejű (5-10 perc) hypothalamicus DA szint csökkenés kísér. Mindezek alapján már rég felmerült, hogy létezhet egy a prolaktin ürítést serkentő hypophyseotrop faktor, ami esetleg egy, a DA elülső lebenyi receptorain ható modulátor anyag is lehet. Ezek a feltételezett, de az eddig nem azonosított faktor(ok) megváltoztathatják a DA receptoriális kötését és/vagy a receptorok intracelluláris szignáltranszdukciós rendszerének működését. A közti-hátsó lebeny sebészeti eltávolítása illetve denervációja hatására a különböző ingerek, így a szoptatás hatására bekövetkező prolaktin szint emelkedés jelentősen csökken vagy elmarad. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a prolaktin elválasztását serkentő anyag a hypophysis közti-hátsó lebenyében található. Ezt az elképzelést támasztja alá, hogy a közti-hátsó lebeny perklórsavas kivonata in vitro és in vivo körülmények között is serkenteni képes a prolaktin szekréciót. A próbálkozások ellenére a kivonatból eddig ezt az anyagot nem sikerült izolálni. - 9 -
A hypophysis közti-hátsó lebenyének perklórsavas kivonatában talált prolaktinreleasing aktivitással (PRL-RA) rendelkező anyag feltételezésünk szerint a fenti mechanizmusok egyikével képes fokozni a laktotrop sejtek prolaktin ürítését. Munkacsoportunknak a fent említett perklórsavas kivonatban HPLC módszer segítségével azonosított egy in vitro és in vivo is PRL-RA-al bíró anyagot, amely meglepő módon a DA-nak egyik katabolikus köztiterméke, az (R)-salsolinol. Az értekezés alapjául szolgáló kísérletekkel igazoltuk, hogy a salsolinol hatása nem a DA D 2 receptorának ligand kötő helyén létrejövő kompetició következménye. Bizonyítottuk, hogy in vivo salsolinol kezelés hatására az intracelluláris camp szint szignifikánsan változik, valamint azt, hogy ez egy salsolinol-membránreceptor kötődés következménye lehet. E receptort eddig nem sikerült azonosítani, de kísérleteink során, közvetett módon az általunk kidolgozott 3 H-salsolinol binding assay módszerével igazoltuk létezését. További specifikus és telíthető salsolinol kötőhelyeket találtunk a striatum, a cortex, az eminentia mediana és a hypothalamus területén. A K D értéke nanomoláris tartományban volt mérhető. Vizsgáltuk a 3 H-salsolinol leszoríthatóságát kötőhelyéről dopaminnal és származékaival, valamint más ligandumokkal is. Eredményeink alapján valószínűnek tűnik, hogy a salsolinol befolyásolhatja a neuroendokrin DAerg rendszert, megváltoztatva annak intracelluláris képződését illetve ürítését. Eredményeink bizonyítják, hogy a salsolinol intravénás alkalmazását követő 10 perccel, a plazma prolaktin szint emelkedésével párhuzamosan, szignifikánsan emelkedik a mellső lebenyi intracelluláris camp szint. - 10 -
SUMMARY Prolactin is a polypeptide hormone that is synthesized in and secreted from mammotropes of the anterior lobe of the pituitary gland. This hormone not only sub serves multiple roles during reproduction but it also plays an essential role in the general homeostasis of the organism. The secretion of prolactin from mammotropes is under a dominant inhibitory control that originates in the medial-basal hypothalamus. The bulk of previous and recent evidence support the view that dopamine is the neurohormone which is the physiological prolactin-inhibiting hormone. Dopamine is delivered to the anterior lobe through the vascular connection between the hypothalamus and the pituitary gland and maintains mammotropes in their tonically suppressed secretory state. In mammals, however, several exteroceptive stimuli such as suckling of the nipples of lactating mothers by their litters sharply elevate plasma prolactin. These stimuli may act by decreasing the inhibitory influence of hypothalamic dopamine and/or enhancing the activity of unknown hypothalamic neurons that secrete a prolactin-releasing hormone (PRF). Surgical removal or denervation of the neurointermediate lobe of the pituitary gland blocks or attenuates the secretory bursts of prolactin induced by different physiological stimuli including suckling. These observations have suggested strongly that a PRF may exist in the neuro-intermediate lobe. Indeed, it has been also shown that perchloric acid extracts of the neurointermediate lobe can stimulate the release of prolactin both in vitro and in vivo. In spite of relentless efforts to isolate and identify this PRF from neurointermediate lobe, the identity of this substance has remained elusive. Analyzed the perchloric acid extract of the neuro-intermediate lobe and of the median eminence, a dopamine-derived compound, R-salsolinol (SAL), has been detected in high concentration that has a selective and dose-dependent prolactinreleasing activity both in vivo and in vitro. Moreover, the concentration of SAL in neuro-intermediate lobe extracts varies in parallel with the suckling-induced prolactin secretion and is markedly reduced following disruption of dopaminergic innervation of the neuro-intermediate lobe. Lack of interference of SAL with 3 H-spiperone binding to AP homogenates indicates that SAL does not act at the dopamine D 2 receptor. Moreover, 3 H-SAL binds - 11 -
specifically to homogenate of AL as well as neuro-intermediate lobe obtained from lactating rats. These data clearly indicate that SAL does not act at the dopamine (DA) D 2 receptors, and suggest that SAL supposedly has a binding site through which the secretion of PRL may be affected. Therefore, binding of 3 H-SAL to different regions of the central nervous system (CNS) has been investigated. Specific and saturable binding have been detected in the striatum, cortex, median eminence and in the hypothalamus as well as in the AL and the neuro-intermediate lobe (NIL) of the pituitary gland. K D values of the bindings were in the nanomolar range in all tissue tested. 3 H-SAL displacing activity of several agonists and antagonists of known DA receptors have also been tested. Salsolinol may regulate DAergic neurotransmission of hypothalamic neuroendocrine dopaminergic (NEDA) system by an altered intracellular or intraterminal synthesis and/or distribution of hypophysiotropic DA. Our findings show that 10 minutes after SAL injection, parallel to the rapid and marked elevation in plasma PRL, there is a significant increase in camp concentration of the AL. However, we assume that this rapid increase at the level of camp of the AL is related to the initiation of the secretory burst of pituitary mammotropes caused by SAL. - 12 -
I. BEVEZETÉS Eltérően a többi hypophysealis hormontól eddigi ismereteink szerint a prolaktin szekréció szabályozásában egy tónusos gátló hatás játssza a meghatározó szerepet. Ezért a tónusos hypothalamikus gátlásért a tubero-infundibuláris DAerg (TIDA) neuroncsoportból az eminentia mediana területén a hosszú portális erekbe ürülő dopamin (DA) tehető felelőssé. A TIDA rendszer mellett a hypothalamikus DAerg (DAerg) neuronoknak további két csoportja ismert. Az egyik rendszer idegsejtjei a nucleus arcuatusban a TIDA neuronoktól rosztrálisan helyezkednek el, axonjai a hypophysis közti és hátsó lebenyében végződnek. E DAerg neuronok képezik a hypothalamus ozmoszenzitív, úgynevezett tuberohypophysealis DAerg rendszerét (THDA). A nucleus arcuatus legrosztrálisabb része a periventriculárisan elhelyezkedő neuronokkal együtt pedig kizárólag a közti lebenyben végződő, az úgynevezett periventriculo-hypophysealis (PHDA) neuronális rendszert alkotja. Az eddig ismert irodalmi adatok alapján, a prolaktin elválasztás hypothalamikus szabályozása szempontjából a prolaktin szint emelkedését alapvetően egyrészt a tónusos gátló hatás csökkenése, másfelől egy esetleges prolaktin releasing hormon serkentő hatása okozhatja. Az egyes fiziológiás állapotokban megfigyelhető gyors és átmeneti plazma prolaktin szint emelkedése nem magyarázható kizárólagosan a hypothalamikus DAerg gátlás csökkenésével, annál is inkább, mivel a legtöbb esetben a prolaktin szint növekedését csak kis mértékben, és csupán egy nagyon rövid ideig (5-10 perc) tartó hypothalamikus DA szint csökkenés kísér. Mindezek alapján már régóta felmerült, hogy létezhet egy a prolaktin ürítést serkentő hypophyseotrop faktor, ami esetleg egy, a DA elülső lebenyi receptorain ható modulátor anyag is lehet. Ezek a feltételezett de az eddig nem azonosított faktor(ok) megváltoztathatják a DA receptoriális kötését és/vagy a receptorok intracelluláris szignáltranszdukciós rendszerének működését, esetlegesen a sejten belüli másodlagos hírvivő milieu -t, akár saját receptoriális hatásukon keresztül. A hypophysis közti-hátsó lebenyének perklórsavas kivonatában talált prolaktinreleasing aktivitással (PRL-RA) rendelkező anyag feltételezésünk szerint a fenti mechanizmusok egyikével képes fokozni a laktotrop sejtek prolaktin ürítését. Munkacsoportunk a fent említett perklórsavas kivonatban HPLC módszer segítségével - 13 -
azonosított egy PRL-RA-al bíró anyagot, amely meglepő módon a DA metabolizmus egyik terméke, a salsolinol. Munkánkban a salsolinol hatásának tanulmányozása során választ kerestünk arra, hogy a salsolinol in vivo is szerepet játszik-e a PRL elválasztás szabályozásában, illetve ezt a hatást milyen mechanizmussal fejti ki. Fontos megválaszolandó kérdés volt annak tisztázása, hogy a salsolinol a már ismert DAerg aktivitás modulációjával éri-e el hatását (például a D 2 receptoriális kompeticióval), vagy esetleg létezik salsolinol kötőhely, mely kulcsszerepet játszhat a PRL elválasztás regulációjában. Dolgozatomban az e célból eddig végzett kísérletek eredményeit ismertetem. - 14 -
II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. A prolaktin A prolaktin (PRL) a tejelválasztásban betöltött szerepén túl a szervezet homeosztázisában is fontos szabályozó szerepet tölt be (1). Ez az összetett funkció, valamint a hormon elválasztásának szabályozásában rejlő, eddig megválaszolatlan kérdések napjainkban is számos munkacsoport kutatásai középpontjában állnak. A PRL legismertebb származási helye az agyalapi mirigy, ahol annak meghatározott sejttípusában, a laktotrop sejtekben termelődik. E hypophysealis PRL elválasztó neuronok egy része azonban olyan átmeneti sejtpopulációból is származhat, amelyik mind PRL-t mind növekedési hormont képes termelni (2). Ezek az úgynevezett somatomammotrop sejtek, melyek tehát kettős funkciójúak. További jellemzőjük, hogy az újszülött patkányok agyalapi mirigyében túlsúlyban vannak és ösztrogén hatására képesek laktotrop fenotípusú sejtekké differenciálódni (3). PRL immunreaktivitás a központi idegrendszer számos területén, sőt egyéb szövetekben is kimutatható (ld. 1. ábra), így a nagyagyban (agykéreg, hippocampus, amygdala, septum területein), az agytörzsben, a kisagyban, a gerincvelőben illetve a circumventricularis szervek területén (4, 5). Patkányban a hypothalamuson belül a dorsomedialis, a ventromedialis, supraoptikus és paraventricularis magokban is megtalálható a PRL (6). Hím állatokban a hypothalamikus PRL immunreaktivitás mennyisége a hypophysis műtéti eltávolítása után sem változik, míg nőstényekben csökken, jóllehet teljesen nem tűnik el. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a hypothalamusban a PRL lokálisan, a hypophysistől függetlenül szintetizálódik (7), sőt az utóbbi idők vizsgálatai kimutatták, hogy a hypothalamikus és hypophysealis PRL elsődleges kémiai szerkezete megegyezik (8). A központi idegrendszerben termelődő PRL hatásának pontos mechanizmusa napjainkban még nem teljes mértékben ismert. A patkány placentában is termelődik számos PRL-szerű molekula, amelyek szerkezeti hasonlóságot mutatnak a hypophysealis PRL-nal. Ezek az úgynevezett placentális laktogének vagy PRL-szerű fehérjék. A decidua sejtekben is termelődik PRL, amely patkányban szerkezetileg egy kissé különbözik a hypophysisben termelődő - 15 -
hormontól. Ez utóbbinak elválasztása érthető módon független a hypothalamikus PRL serkentő ill. gátló faktoroktól. A termelődő PRL az amnion folyadékba diffundálhat, és szerepet játszhat az embrionális ozmoregulációs és immunfolyamatokban. A méh szövetében, mégpedig a nem terhes patkányok myometriumában is kimutatható a PRL. Fiziológiás jelentősége ma még nem ismert (1). Laktáló emlősökben a PRL megtalálható az emlőmirigy epitheliális sejtjeiben, illetve az anyatejben is. A tejben található PRL egy része az agyalapi mirigyben termelődik és a vérkeringés útján az emlőmirigybe jut, ahol az epitheliális sejtek felveszik majd exocitózissal a mirigyvégkamrákba ürítik (9). Ugyanakkor az epithel sejtek önmagukban is képesek a PRL szintézisére (10). Az immunrendszerben a limfociták illetve a csecsemőmirigy valamint a lép immunkompetens sejtjei is képesek a hypophysealis PRL-hoz hasonló szerkezetű PRL szintézisére, melynek funkciója napjainkban is folyó, igen intenzív kutatás tárgya (1). - 16 -
1. ábra A prolaktin előfordulása a szervezetben (bal oldalon a piros színnel a szervek, zöld színnel a szekretáló sejtek, jobb oldalon az elválasztott testnedvek feltüntetésével). - 17 -
1.1. A prolaktin kémiai szerkezete, szintézise A PRL (ld. 2. ábra) egyetlen, 199 aminosavat valamint három diszulfid-hidat tartalmazó láncból álló, 23,5 kda molekulasúlyú fehérje. Poszttranszlációs módosulások következtében különböző molekulasúlyú izoformák alakulnak ki, melyek receptor affinitása, biológiai hatása eltérő, az egyes izoformák aránya más lehet normális és patológiás körülmények között (11). Különbség mutatkozik az egyes sejttípusok által termelt PRL izoformák között is (12). A PRL a prolaktin/növekedési hormon/placentális laktogén családba tartozik, szerkezetét tekintve a citokin/hemopoetikus család tagjaival mutat rokonságot (13). 2. ábra A prolaktin térbeli modellje (balra) valamint a prolaktin-receptor komplex térbeli elrendeződése (jobbra, a prolaktin molekula sárga színnel kiemelve). A modellek a Cn3D program 4.1-es verziójával készültek. (Forrás: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 1.2. A PRL receptor A PRL receptora (PRL-R) a citokin/hemopoetikus receptor család tagja, mely családba többek között az interferon receptorok, az interleukin (IL) 2, IL-3, IL-4, IL-6, - 18 -
granulocyta-makrofág kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF), granulocyta kolóniastimuláló faktor (G-CSF), gp-130 (14, 15) sorolhatók. A PRL-R-nak többféle izoformája ismert, melyek alternatív hasítás útján jönnek létre (ld. 3. ábra). A hosszú, közepes és rövid forma közül az utóbbi nem képes a jelátvitelre az intracellulárs domén hiánya miatt (16). 3. ábra A prolaktin receptor izoformái és jellemzőik. Módosítva, átvéve (26) A jelátvitel A PRL receptorhoz történő kapcsolódása a receptor homodimerizációja után a Jak/STAT rendszer aktiválódását idézi elő (ld. 4. ábra), mely a sejt transzkripciós aktivitásának fokozódását eredményezi (17, 18). Az egyes sejteken a PRL más-más Stat fehérje aktiválódását indukálja. Nb2 sejteken a Stat1, Stat3 és Stat5-öt aktiválja (18). A jelátvitel a Ras, Raf/MAPK útvonalon is történhet (19). A PRL target génjei közül az interferon-regulatory factor-1 (IRF-1) az egyik legjelentősebb (20, 21). Aktiválódása T- - 19 -
lymphocytákon például nélkülözhetetlen a sejtfejlődés, proliferáció, apoptózis szempontjából. A PRL által indukált Stat1 az IRF-1 gén promoterének pozitív, a Stat5 negatív mediátora: a két Stat faktor arányától függ tehát az IRF-gén aktivációjának fokozódása, vagy csökkenése (20, 22). A receptor stimuláció másik fontos eredménye a sejtnövekedés és differenciálódás szempontjából az ornitin dekarboxiláz jelentősen fokozott termelődése (23). A PRL nemcsak a sejtfelszíni receptorhoz történő kapcsolódás és jelátviteli mechanizmusok beindítása révén képes hatását kifejteni, hanem ismert az a tény is, hogy egyes sejtek internalizálni képesek a PRL-t. Az ilyen módon a sejtbe bejutott PRL a magba transzlokálódik (24). 4. ábra A prolaktin receptorai, szignáltranszdukciós mechanizmusai. Módosítva, átvéve (25). - 20 -
1.3. A prolaktin biológiai hatásai 1.3.1. Prolaktin és laktáció A PRL már az emlőmirigy növekedésében és fejlődésében, a tejtermelés megindításában és fenntartásában is alapvető szerepet játszik. Ezt bizonyítja, hogy PRL illetve PRL receptor génhiányos egerekben az emlőmirigy fejlődése abnormális, ezek az állatok tejtermelésre sem képesek (27). A terhesség alatti hypophysis eltávolítás után, mesterségesen előidézett PRL hiányos állapotban a tejtermelés nem indul meg, PRL kezelés azonban képes teljesen helyreállítani azt, bizonyítva ezzel a PRL szerepét. A tejtermelés során a PRL serkenti egyes aminosavak, valamint a glükóz táplálékként történő felvételét, a tejfehérjék (kazein és α-laktalbumin), a tejcukor és a tejben lévő zsírsavak termelését (28). 1.3.2. A prolaktin egyéb biológiai hatásai A legtöbb rágcsálóban a PRL luteotrop hatása révén a párzás után hat napig fenntartja a sárgatest szerkezeti és funkcionális integritását (29). Patkány sárgatestében fokozza a progeszteron termelést és gátolja az enzimatikus inaktiválását (30). PRL-receptor hiányos egerek a sérült sárgatest funkciók és elégtelen petesejtek érési folyamatok miatt sterilek (25). A PRL-nak luteotrop funkciója mellett azonban luteolítikus hatása is van, amelynek mechanizmusa még nem pontosan ismert (31). Számos adat utal arra, hogy a PRL hozzájárul a szaporodási magatartásformák kialakulásához, amelyek azonban az alkalmazott modellek sokfélesége miatt még nem kellőképpen tisztázottak. DA antagonistával előidézett PRL szint emelkedésnek nincs hatása a párzási viselkedésre, ugyanakkor a szopás által indukált PRL elválasztás csökkenti a szexuális magatartást. Ezzel ellentétben a proösztrusz délutánján spontán - 21 -
módon megemelkedő PRL koncentráció gátlása (DA agonistával) nagymértékben csökkenti a szexuális fogékonyságot (32). A PRL a szülés után meggyorsítja az anyai viselkedésformák megjelenését, bár önmagában nem vált ki anyai viselkedést. Ezt a hatását a hypothalamikus medialis preoptikus területen belül lévő idegi struktúrákra hatva fejtheti ki. A PRL a reprodukcióban betöltött funkciói mellett, szerepet játszik számos más, ugyancsak a szervezet belső egyensúlyának fenntartását szolgáló folyamatokban is. Részt vesz például a csontnövekedés, az immunrendszer, a só-vízháztartás és az érképződés szabályozásában (1). - 22 -
2. A prolaktin elválasztás szabályozása A PRL szekrécióját a külső és belső környezet változásai folyamatosan befolyásolják, szabályozzák. A PRL szekréciót kiváltó fiziológiás ingerek közül a legfontosabbak és a legtöbbet tanulmányozottak a szopási inger, a stressz és a megemelkedett ovariális szteroidszint (főleg az ösztrogén) okozta PRL elválasztás fokozódás (33, 34, 35). Ezen ingerek hatásában (nagyság, időtartam) számos különbség mutatkozik, és jelentősen eltérnek a szervezet homeosztázisában játszott szerepük, illetve jelentőségük tekintetében is. Mai ismereteink szerint, ennek megfelelően a szabályozó mechanizmusok is több ponton különböznek. Közös bennük viszont az, hogy e stimulusok nagy része a hypothalamuson keresztül fejti ki hatását, ahol PRF-ek és PIFek felszabadulását befolyásolják. Emlősökben a hypophysis PRL szekréciójának hypothalamikus szabályozása dominánsan gátló jellegű (36). Ugyanakkor a hypothalamus részt vesz a PRL elválasztás serkentésének szabályozásában is, amely a gátló hatások kikapcsolásával és/vagy a beérkező stimuláló hatások felerősítésével érhető el (ld. 5. ábra) 5. ábra A tuberoinfundibularis DAerg rendszert befolyásoló hormonok és neurotranszmitterek (bal oldalon a gátló, jobb oldalon a serkentő hatásúak). Módosítva, átvéve (1). - 23 -
2.1. A prolaktin elválasztást gátló tényezők, hatásmechanizmusok A ma általánosan elfogadott nézet szerint a laktotrop sejtek spontán és magas szekréciós aktivitással rendelkeznek, így a PRL elválasztás hypothalamikus tónusos gátló hatása elengedhetetlen feltétele az úgynevezett bazális PRL ürítésnek. Ezt a megállapítást több megfigyelés is alátámasztja. A hypophysis és a mediobasalis hypothalamus közötti kapcsolat sebészi megszüntetése után (nyélátvágással vagy az eminentia mediana sértésével) a plazma PRL koncentráció folyamatosan növekedve egy hét után maximális szintet ér el (37, 38). A PRL szekréció magas szintre áll be akkor is, ha a hypophysis elülső lebenyét olyan helyre transzplantáljuk, ahol nincs érrendszeri, illetve idegi összeköttetése a hypothalamusszal (pl. vesetok alá) (39). In vitro sejtkultúrában is igen magas az agyalapi mirigy sejtjeinek PRL elválasztása (34). 2.1.1. Dopamin A DA-nak a PRL termelésre és elválasztásra kifejtett gátló hatását bizonyítja, hogy a katekolamin metabolizmust befolyásoló szerek a PRL szekréciót is jelentősen megváltoztatják (40) valamint, a DA magas koncentrációban való jelenléte az eminentia mediana területén, valamint a hosszú portális erekben (36, 41). Számos in vivo és in vitro kísérlet bizonyítja a DA-nak a PRL elválasztásra kifejtett gátló hatását (42, 43). 2.1.1.1. A dopamin anyagcseréje és hatásmechanizmusa 2.1.1.1.1. A dopamin kémiai szerkezete, bioszintézise, eliminációja A DA kémiai szerkezetét tekintve β-3,4-dihidroxifenil-etil-amin. Az 1950-es évekig a katekolamin szintézis egyik közti termékének tartották, később igazolták neurotranszmitter voltát. A DA bioszintézisének helyszíneit és folyamatát a 6. ábra mutatja. A szintézis sebességét meghatározó lépés az L-3,4-dihidroxifenilalanin (L- DOPA) képződése a neuronok által felvett tirozinból. Ezt a lépést a tirozin-hidroxiláz - 24 -
(TH) enzim katalizálja (6. ábra 2-el jelölt enzim). Az enzim aktivitása többek közöttvégtermékei által szabályozott, így megvalósítva a feed-back mechanizmust. A keletkezett L-DOPA-t ezután az aromás aminosav dekarboxiláz enzim (6. ábra 3- al jelölt enzim) közreműködésével alakul DA-ná. A szintézis folyamatának részletei a 6. ábra magyarázatában olvasható. A TH immuncitokémiai vizsgálatokkal megállapították, hogy a TH immunpozitív neuronok valamivel nagyobb területen helyezkednek el, mint az a katekolamin fluoreszcencia alapján várható volt (44, 45). Az enzimreakciók során képződő aminok elleni antitestek használatával egyértelművé vált, hogy a DA és az L-DOPA immunreaktivitás eltérő eloszlást mutat, amelynek alapján feltételezhető egy olyan neuronális rendszer megléte, amely csak TH-t tartalmaz, de aromás aminosav dekarboxilázt nem. Ezek a neuronok így DA helyett csak L-DOPA termelésére képesek (46, 47, 48). - 25 -
Tirozin L-DOPA Dopamin Dopaminerg idegvégződés Postszinaptikus neuron Intracelluláris jelátvitel D 2 R VMAT DAT Szekréciós granulum 6. ábra A dopamin szintézisének mechanizmusa. A tirozin aktív transzporttal jut a neuron citoplazmájába (1). A tirozin-hidroxiláz enzim (2) L-DOPA szintézisét segíti, mely a DOPA-dekarboxiláz enzim (3) katalízise mellett dopaminná alakul. A dopamin ezután a vezikuláris monoamin transzporter (VMAT) segítségével a szekréciós granulumba kerül (4), ahol tárolódik. Membránfúziót követően (5) ürül az extracelluláris térbe (szinaptikus résbe vagy neuroszekréció esetén az érpályába). A receptorhoz (6) kötődve kifejti hatását, vagy a dopamintranszporter segítségével (7) visszajut a neuronba. Itt visszajuthat a szinaptikus vezikulumba (8), vagy a mitochondrium külső membránjához asszociált monoamin-oxidáz (MAO) enzim hatására inaktív metabolittá alakul (9). A metabolizmus másik útja a katekolamin-o-metil-transzferáz (COMT) által katalizált reakció (10). Módosítva, átvéve (49). - 26 -
Az axon-terminálisokból a szinaptikus résbe ürülő DA a jól karakterizált DA receptorokon fejtik ki hatását. A hatástartam regulációjában kulcsfontosságú a szinaptikus résben lévő transzmitter-koncentráció, illetve annak csökkentése. Ebben fontos szerepet játszanak a visszavételi, vagyis reuptake mechanizmusok, mely DA esetében leginkább a DA transzporteren (DAT, ld. 6. ábra 7-es számú képlete) keresztül valósul meg. Számos psychostimuláns drog, így a kokain és az amfetamin is ezt a transzportert képes gátolni, így megnövelve a DA mennyiségét a szinaptikus résben, ezáltal elnyújtott hatást kiváltva. A preszinaptikus neuronba visszajutva a DA a monoamin-oxidáz (MAO), az aldehid-dehidrogenáz (AD), valamint a katekol-o-metil-transzferáz (COMT) enzimek hatására alakul fő metabolitjaivá, vagyis dihidroxi-fenil-acetáttá (DOPAC), valamint homovanillinsavvá (HVA). A részletes folyamatot a 7. ábra mutatja. Az elimináció alternatív útját jelenti a salsolinol-szintetáz enzim, mely a salsolinol szintézisét katalizálja dopaminból és acetaldehidből (ld. 12. ábra, 46.oldal). A fentiek szerint MAO gátlás esetén a DA eliminációja döntően a salsolinol szintézis irányába folyik tovább, így a klasszikus metabolitok képződése helyett az (R)- salsolinol koncentrációjának emelkedését detektálhatjuk. - 27 -
3,4-dihidroxi-acetaldehid Dopamin 3,4-dihidroxifenilacetát (DOPAC) homovanillinsav 3-metoxi-tiramin 3-metoxi-4-hidroxi-fenilacetaldehid 7. ábra A dopamin eliminációja 2.1.1.1.2. dopamin receptorok A szinaptikus résbe (illetve a neuroendokrin DAerg pályarendszerek esetében a portális erekbe illetve az intersticiális térbe) ürülő DA molekuláris biológiai módszerekkel jól identifikálható receptorokhoz kapcsolódik. A szerkezetük és az általuk aktivált másodlagos hírvivő mechanizmus alapján két fő csoportba (D 1 és D 2 - szerű DA receptorok), valamint több alcsoportba (D 1-5 ) sorolható receptorok (ld. 8. ábra) mindegyike a G fehérjéhez kapcsolt receptorcsaládba (GPCR) tartozik. Míg a D 1 receptorcsalád tagjai (D 1 és D 5 ) az intracelluláris camp szintet emelik, addig a D 2 receptorcsalád tagja (D 2, D 3, D 4 ) gátolják a camp képződését, vagyis az adenilát-cikláz enzim működését. A DA által kiváltott PRL szekréció gátlás a D 2 -es DAerg receptoron keresztül valósul meg. - 28 -
8. ábra Dopamin receptorcsaládok és transzporterek szerkezeti tulajdonságai 2.1.1.2. A dopamin szerepe a neuroendokrinológiai szabályozó mechanizmusokban A központi idegrendszerben számos DA neurotranszmisszióval működő pályarendszer ismert. Ezek között említést érdemel a substantia nigra és a striatum közötti nigrostiatalis pálya, a mezolimbikus és a mezokortikális pályarendszerek. Ezek jórészt az extrapiramidális mozgató pályarendszerben (nigrostriatalis rendszer), másrészt az emocionális, kognitív magatartásformák kialakításában vesznek részt, nem rendelkeznek közvetlen hatással a neuroendokrin rendszerre. A neuroendokrin szabályozásban szerepet játszó DA tartalmú neuronok az alábbi magcsoportokban helyezkednek el (Dahlstorm és Fuxe-féle alfa-numerikus jelölés feltüntetésével, 50): - 29 -
Magcsoport (alfanumerikus) Magcsoport (nomina anatomica) Célterület Pályarendszer A11 Posterior hypothalamus Gerincvelő Diencephalo-spinalis rendszer A12 Nucleus arcuatus Hypophysis közti és hátsó lebenye, Eminentia mediana Tubero-hypophysealis és tubero-infundibularis rendszer A13 Zona incerta Hypothalamus Incerto-hypothalamikus rendszer A14 Nucleus periventricularis Hypophysis közti lebeny Periventriculohypophysealis rendszer A15 Lateralis és ventralis hypothalamus?? 1. táblázat A neuroendokrin szabályozásban szerepet játszó dopamin tartalmú sejtcsoportok elhelyezkedése és az általuk alkotott pályarendszerek. Az A11-es és A15-ös rendszer funkciója nem tisztázott. Az A13-as DAerg pályarendszer a gonadotrop-serkentő hormon (GnRH) regulációjában játszik szerepet. A tubero-hypophysealis (THDA, A12), a tubero-infundibularis (TIDA, A12) valamint a periventriculo-hypophysealis (PHDA, A14) DAerg rendszer fontos szerepet játszik a PRL elválasztás szabályozásában, így a továbbiakban döntően ezekről esik szó. 2.1.1.3. Neuroendokrin dopaminerg pályarendszerek és azok szerepe a prolaktin elválasztás szabályozásában A DA receptorcsalád D 2 alosztályába tartozó receptorok megtalálhatóak az agyalapi mirigy sejtjeinek felszínén. (51, 52). Az agyalapi mirigy működését befolyásoló DAerg neuronok (1. táblázat) a hypothalamikus nucleus periventricularis (A14 katekolaminerg - 30 -
sejtcsoport) és a nucleus arcuatus (A12 katekolaminerg sejtcsoport) területén helyezkednek el (53, 54, 55, 56). Ez a két neuronális sejtcsoport három, egymástól mind morfológiailag mind funkcionálisan elkülönülő rendszerre osztható (ld. 9. ábra). A periventriculo-hypophysealis DAerg (PHDA) neuronok a hypothalamus elülső periventricularis részében helyezkednek el és az agyalapi mirigy IL-ében végződnek. Ezek a neuronok a IL-ben termelődő α-melanocita-stimuláló hormon (α MSH) szabályozásában vesznek részt (53, 54). A második csoportba tartozó neuronok a nucleus arcuatus rostralis részében találhatóak, a PHDA rendszer hátsó részének szomszédságában, és mind a közti mind a hátsó lebenybe vetülnek (36). Ezek az idegsejtek alkotják az úgynevezett ozmoszenzitív tubero-hypophysealis DAerg rendszert (THDA) (57, 55, 58), amely szintén részt vesz a PRL elválasztás szabályozásában (59, 60, 61). Az A12 tubero-infundibularis DAerg (TIDA) rendszert alkotó neuronok a nucleus arcuatus középső és hátsó részében helyezkednek el, és az EM külső zónájába vetülnek. Innen a DA, bekerülve a hosszú portális erekbe, eléri az agyalapi mirigy sejtjeit. Az e sejtek által termelt DA a PRL általánosan elfogadott hypothalamikus szabályozója (36). - 31 -
9. ábra Neuroendokrin dopaminerg pályarendszerek. - 32 -
Az immunhisztokémiai vizsgálatok egyértelműen bizonyították a TH és az aromás aminosav dekarboxiláz (AADC) enzim, valamint a DA jelenlétét is a PHDA, THDA és a TIDA neuronokban, de ez utóbbinak csupán a dorsomedialis részében (DM-TIDA). A DA transzporter mrns-t is csupán ezen a területen azonosították (62). Ezek az idegsejtek tehát az enzimtartalmuk alapján végtermékként dopamint képesek termelni. Ugyanakkor a TIDA neuron rendszer ventrolateralis részében (VL-TIDA) csak TH immunreaktivitás találtak, aromás aminosav dekarboxiláz aktivitást nem (184, 48, 63), L-DOPA azonban detektálható ezen a területen (48, 63). Ezek a VL-TIDA rendszerben elhelyezkedő sejtek tehát csak L-DOPA szintézisére képesek, amely az aromás aminosav dekarboxiláz hiányában nem alakulhat tovább dopaminná. Ezen megfigyelések alapján feltételezhető, hogy az L-DOPA, mint transzmitter végtermékként képződik, az eminentia medianaba ürül és a hosszú portális erekbe kerül, esetleg más idegsejtek felveszik, és további enzimatikus folyamatok szubsztrátjaként dopaminná (64), vagy más anyaggá alakul. Az arcuatus mag két részének eltérő funkcionális jelentőségére utal az a megfigyelés, hogy a DM-TIDA részt vesz álterhes nőstény patkányokban a PRL napi ritmusának szabályozásában, ugyanis az itt elhelyezkedő neuronok aktivitása csökkenést mutat a napi PRL csúcs kezdetekor, míg a VL-TIDA területén elhelyezkedő neuronokban hasonló változás nem figyelhető meg (65). A TIDA rendszer DAerg neuronjainak aktivitáscsökkenését eredményezi a laktáció (mely 24 órás elválasztás után visszaáll a korábbi mértékre), továbbá a szopási stimulus (66, 67, 68). A fenti, fiziológiai állapotokkal összefüggő különbségeken túl, nemi eltérések is tapasztalhatók a TIDA neuronok működésében. Nőstényekben a neuronok válaszkészsége a PRL feed-back iránt kifejezettebb (69, 70). A neuronok aktivitása kasztrációt követően nőstényekben csökken, míg hímekben növekszik (71). Hormonpótlással az előbb említett hatások kivédhetők (72). Hím és nőstény állatok stresszre adott eltérő válasza szintén szembetűnő: nőstényekben a TIDA aktivitás csökken, míg hímekben változatlan marad (73). - 33 -
A TIDA rendszertől eltérően a THDA és a PHDA neuronok aktivitása független a keringő gonadalis szteroidoktól, illetve THDA neuronok aktivitásában nem tapasztalhatók nemi különbségek sem (74). A hypophysis NIL-ének műtéti eltávolítása illetve nyélnyomorítás után, amikor az AL vérellátása és így a TIDA rendszerből érkező DA mennyisége sem változik, a plazma PRL szint mégis 3-4 szeresére emelkedik mind hím, mind ciklusos és laktáló nőstény patkányokban, valamint ezzel párhuzamosan lecsökken a hypophysis AL DA tartalma. Ez a hatás tehát pusztán a THDA és PHDA rendszerek funkciócsökkenésével függ össze (75, 59, 76). A korábban vázolt DAerg sejtcsoportok és pályarendszerek közvetlen PRL szekréciót gátló hatásukon túl fontos csomópont szerepet töltenek be, amennyiben azok különböző környezeti tényezők és kémiai ágensek hatására bekövetkező aktivitásváltozása a PRL elválasztás befolyásolását eredményezik. Az említett hormonok hatásait foglalja össze a 10. ábra. A legfontosabb gátló tényező maga a PRL, míg a serkentő hatások közül ösztradiol emelendő ki. - 34 -
10. ábra A dopaminerg pályarendszerekre ható modulációs lehetőségek. Módosítva, átvéve (1). A PRL, a hypothalamus szintjén feed-back mechanizmussal képes saját elválasztását befolyásolni. A plazma PRL szintjének emelkedése fokozza a hypothalamusban a DA szintézist (70), így a portális erekben megemelkedő DA koncentráció a PRL elválasztásának gátlását eredményezi (77). Újabb vizsgálatok PRL receptorokat mutattak ki a TIDA, PHDA és a THDA neuronok felszínén (78), amely a feed-back mechanizmus molekuláris biológiai alapjának bizonyítéka. A PRL mindhárom DAerg rendszerre serkentőleg hat (60). A laktáció középső szakaszában azonban nem működik a visszaható mechanizmus, a TIDA neuronok érzéketlenné válnak a megemelkedett mennyiségű PRL-ra. Ez a jelenség a korai laktációban nem tapasztalható, később pedig hosszú ideig tartó - 35 -
elválasztás után megszűnik (79, 80). Érdekes megfigyelés, hogy a feed-back mechanizmus teljes hiánya esetén (például a PRL hiányos egerekben), a TIDA neuronok száma csökken, míg más hypothalamikus noradrenerg sejtcsoportban (A13, A14) nem tapasztalható sejtszám-csökkenés. Ezt a jelenséget így nem a mutáció elsődleges hatása magyarázza, hanem a PRL hiányra adott válasz, amely az egyedfejlődés korai szakaszában alkalmazott PRL kezeléssel megakadályozható (81, 82). 2.1.2. További prolaktin inhibitorok Habár a DA PRL elválasztást gátló hatása teljes mértékben bizonyított, számos kísérletes megfigyelés támasztja alá azt, hogy önmagában nem elegendő a PRL szekréció teljes gátlásához, vagyis további PIF-ek létezése valószínűsíthető. Így például, míg hímekben a portális erekben 5-7-szer alacsonyabb a DA koncentráció, mint nőstényekben, a PRL szintekben nem tapasztalható ekkora különbség (36, 83). Laktáció során sem találtak teljesen ellentétes változásokat az EM illetve a portális erek DA tartalma és a plazma PRL koncentrációja között (84, 85). A klasszikus neurotranszmitterek közül az egyik lehetséges PIF az acetil-kolin. Szisztémás kolinerg aktiválás illetve acetil-kolin agonista icv adása után csökken a plazma PRL szintje. Kolinerg agonista adásával meggátolható a szopás illetve ösztradiol által indukált PRL elválasztás is (1). Az ugyancsak klasszikus neurotranszmitternek tekinthető noradrenalin is szóbajön, mint a PRL elválasztás egyik gátlója. A központi noradrenerg rendszer ugyanis valószínűleg α1 adrenerg receptorokon keresztül (86) tónusos gátló hatást fejt ki a bazális és ösztrogén indukált PRL elválasztásra (87). Másrészről viszont a proösztrusz délutánján megjelenő PRL csúcs illetve a stressz indukált PRL elválasztás gátolt a centrális noradrenerg pályák mechanikai vagy kémiai roncsolása után (88). További lehetséges PIF a γ-amino-vajsav (GABA), mely a mediobasalis hypothalamusban elhelyezkedő GABAerg neuronokból felszabadulva, az EM külső zónájában a hosszú portális erekbe ürülve eljut az hypophysis AL sejtjeihez (89, 90), ahol receptorain keresztül, direkten a laktotrop sejteken hatva gátolja a PRL elválasztást - 36 -
(91, 92). További bizonyíték, hogy a PRF-ek által kifejtett hatások közvetítésében (43) szerepet játszó paraventricularis és supraopticus magvak gazdag GABAerg innervációban részesülnek. A hypothalamikus preoptikus és elülső periventricularis areában illetve a paraventricularis magban termelődő szomatosztatin in vitro körülmények között gátolja a bazális illetve a TRH vagy VIP által kiváltott PRL elválasztást (93). Az endothel sejtek által termelt vazoaktív peptidek közül az endothelin-1 és az endothelin-3 is képes in vitro a PRL szekréció dózisfüggő gátlására, amely hatás a D 2 receptor aktiválása mellett is fennmarad (43). A pankreász polipeptidek közé tartozó neuropeptid Y in vitro gátolja laktáló vagy ciklusos nőstény állatból származó hypophysis mellső lebeny sejtjeiből a PRL elválasztást, valamint az egyidejűleg adott DA gátló hatását is fokozza (94). 2.2. A prolaktin elválasztást fokozó ismert faktorok, azok hatásmechanizmusa A rendelkezésre álló kísérletes adatok alapján általánosan elfogadott nézet, hogy a PRL elválasztás főképp a DA gátló hatása alatt áll, ugyanakkor ezzel párhuzamosan számos kutatás folyik a PRL elválasztást serkentő anyagok iránt. A PRF-ek létezésének feltételezése előtt a PRL szekréció fokozódására a hypothalamus tónusos gátló hatás megszűntét követő, spontán módon bekövetkező PRL szint emelkedést tartották domináns hatásnak (34). Ezt az elképzelést támasztotta alá, hogy a TH gátlásával felfüggesztett DA szekréció önmagában a PRL elválasztás fokozódásához vezetett. Ennek mértéke hasonló a szopási inger, illetve stressz esetén tapasztalthoz (41). In vitro kísérletben a DA infúzió felfüggesztése gyors PRL szekréciónövekedést eredményez. Az emlőideg elektromos ingerlése azonban csak egy néhány percig tartó DA ürítés csökkenést okoz, amit azután gyors pulzusokban történő DA elválasztás követ a szoptatás egész időtartama alatt. A szopási inger után a többszörös plazma PRL szint emelkedés mellett a portális vér DA tartalma csak kismértékben csökken (43, 34). - 37 -
A fenti megfigyelések arra utalnak, hogy a DA szekréció csökkenése önmagában nem elégséges a szopásra adott PRL válasz létrejöttéhez. A jelenlegi eredmények alapján úgy tűnik, hogy ellentétben a többi adenohypophysealis hormonnal, nincs egy kitüntetett fő PRL serkentő hormon, hanem számos anyag rendelkezik PRL elválasztást fokozó hatással. A nucleus paraventricularis parvocelluláris neuronjaiban képződő, majd az EM területén a hosszú portális erekbe ürülő thyreotroph releasing hormont (TRH) eredetileg, az hypophysis AL sejtjeiben termelődő, thyroid serkentő hormon (TSH) elválasztását serkentő hypophyseotrop faktorként írták le (95, 96). A TRH in vitro és in vivo körülmények között is képes a PRL elválasztás dózisfüggő serkentésére (77, 97). PRF aktivitással rendelkezik a vazoaktív intesztinális peptid (VIP) is, amelynek a jelenléte a nucleus paraventricularisban és az eminentia medianaban is bizonyított (98, 99). A portális vérben megtalálható peptid a laktotrop sejteken található VIP receptorokon keresztül hatva képes a PRL elválasztás serkentésére (98, 99, 100). A VIP-pel homológiát mutató peptid hisztidin-izoleucin ugyancsak kimutatható a portális vérben (100), és szintén képes a PRL szekréciót serkentésére (101, 102). A több, mint egy évtizede juh hypothalamusból azonosított és izolált hypophysealis adenilát ciklázt aktiváló polipeptid (PACAP) a VIP neuropeptid család egyik tagja (103, 104). Két biológiailag aktív formája ismert: a 27 aminosavból álló PACAP-27, illetve a hosszabb PACAP-38. Mindkét peptid szoros homológiát mutat a VIP N- terminális aminosavszekvenciájával. Hatásukat tekintve nagymértékű ciklikus AMP (camp) felhalmozódást okoz tenyésztett ALi sejtekben, feltehetően a nagy affinitású receptorokon keresztül hatva (105). A hypophysealis portális érrendszerben a PACAP-38 koncentrációja magasabb, mint a szisztémás keringésben. Szisztémás PACAP-38 injekció szignifikánsan és dózisfüggően emeli a plazma PRL és növekedési hormon szinteket hím és elválasztott laktáló nőstényekben is, ugyanakkor folyamatosan szoptató anyákban nincs hatása a plazma PRL koncentrációjára (106, 107, 108). Laktálókban a PACAP-38 a szopás indukált PRL válaszhoz hasonló mértékű PRL elválasztást okoz. Hímekben a PACAP a hypothalamus léziója után is serkentette a PRL és a növekedési hormon elválasztását, - 38 -
ami közvetlen hypophysealis hatásmechanizmust sejtet (109). Ezzel ellentétben, sejtkultúrában és reverz hemolítikus plakk assay-ben a PACAP-38 dózisfüggően gátolta a PRL leadást, míg a növekedési hormon elválasztást serkentette (109, 107, 108). Ez utóbbi megfigyelések arra utalnak, hogy a PACAP-38 nem közvetlenül a laktotrop sejteken hatva fejti ki a PRL serkentő hatását, hanem esetleg indirekten, egy más típusú hypophysealis sejten keresztül, parakrin módon. Ezek lehetnek a follikulus stimuláló hormont termelő (FSH) sejtek, amelyek szintén rendelkeznek PACAP kötőhellyel (110) illetve a melanotrop sejtek, amelyekben PACAP hatására megnő a camp koncentráció és az αmsh elválasztás (111). PACAP-38 kezeléskor megnőtt az interleukin-6 (IL-6) szekréció az FSH sejtekből, amely peptid képes in vitro a PRL elválasztás serkentésére. Így az IL-6 lehet egy, a PACAP serkentő hatását közvetítő, parakrin faktor (112, 113). A szerotonin (5HT) PRL elválasztás szabályozásában való részvételét is számos eredmény látszik alátámasztani. Centrálisan vagy perifériásan adott szerotonin illetve szerotonin prekurzor (5-hidroxi-triptofán, 5HTP) hatására emelkedik ugyanis a plazma PRL koncentrációja (114, 115, 116). Ez a hatás azonban csak intakt NIL és hypothalamus esetén figyelhető meg (117, 118, 119). Az 5HT receptor 1 agonisták in vivo is képesek a PRL szint emelésére (40, 120). A szerotonin szintézis gátlása intakt állatokban nem befolyásolta a PRL elválasztást, ugyanakkor laktáló nőstényekben teljesen megakadályozta a szopási inger által kiváltott PRL elválasztást, mely hatás kivédhető volt szopási stimulus előtt adott 5HTP-al (121). Bár szerotonin receptorokat kimutattak a hypophysis elülső lebenyében is, de a szerotonin in vitro nem serkenti a PRL szekréciót a laktotrop sejtekből (122, 123, 114, 124). Mindezen adatok arra utalnak, hogy a szerotoninerg pályáknak fontos szerepet játszanak a szopási stimulus közvetítésében, és így a szopás kiváltotta PRL válaszban, azonban a szerotonin nem neurohormonként közvetlenül, hanem indirekten, hypothalamikus szinten hatva befolyásolja a PRL szekréciót. Az angiotenzin II részt vehet a PRL fiziológiás szabályozásában, mind a hypothalamus (125, 126) mind a hypophysis szintjén (127). Centrális hatással a hisztamin is serkenti a PRL elválasztást (főképpen a stresszre adott PRL választ hím patkányokban) döntően H 2 receptorokon hatva (128, 129). - 39 -
A P-anyag, a tachykinin peptidcsalád tagja, serkenti a PRL elválasztást központi és perifériás kezeléskor, illetve hypophysis sejtkultúrában is (130). Az endogén opioidok három, különböző gének által kódolt, peptidcsaládba tartoznak, ezek az endorfinok, dinorfinok és enkefalinok (131). Az enkefalin immunpozitív neuronok megtalálhatóak a hypothalamikus paraventricularis valamint supraopticus magban, ahonnan az eminentia medianaba és a hypophysis hátsó lebenyébe vetítenek. Laktáció alatt a TIDA neuronok is szintetizálnak enkefalint, így ciklusos nőstényhez képest az EM és a portális vér nagy mennyiségű enkefalint tartalmaz (132, 133). Az endogén opioidok, feltehetőleg µ és/vagy κ opiát receptoron keresztül (134), gátolják a TIDA neuronokat, így serkentik a PRL elválasztást (135, 136, 137). Hypophysis sejtkultúrában alkalmazva a galanin is képes a PRL elválasztást serkenteni (138). A galanint tartalmazó idegsejtek megtalálhatóak a mediobasalis hypothalamus területén, az EM külső rétegében pedig immunpozitív rostokat is találtak (139). A 13 aminosavból álló neurotenzin főleg a nucleus arcuatus neuronjaiban termelődik, ahonnan az eminentia medianaban ürülve eléri az AL sejtjeit. Sejtkultúrában illetve in vivo perifériásan alkalmazva serkenti, míg centrálisan csökkenti PRL ürítést és gátolja a stressz, illetve szerotonin kezelés okozta PRL elválasztást. (1, 140). A központi idegrendszeren belül megtalálható serkentő aminosavaknak is szerepet tulajdonítanak a PRL elválasztás szabályozásában. Ezek közül a nucleus arcuatus neuronjai felé szinte kizárólag a glutamát közvetíti a gyors serkentő impulzusokat. A nucleus paraventricularisban is gazdag glutamáterg rostvégződés található (141, 142). A glutamáterg receptorok megtalálhatóak a nucleus paraventricularis neuronjain, sőt az AL laktotrop sejtjein is kimutatták jelenlétét (143, 144). Érdemes megemlíteni, hogy a DA is képes a PRL szekréció növelésére, nagyon alacsony, pikomoláris koncentrációban, in vitro sejtkultúrában alkalmazva (145, 146, 147). Az állatok in vivo fiziológiás állapota meghatározhatja a laktotrop sejtek in vitro válaszkézségét a DA iránt. Így például egy rövid szopási ingert követően laktálókból - 40 -
kivett (148) illetve ösztrogén és progeszteron-kezelt, ovariektomizált nőstény állatokból származó sejteken (149) a DA alacsony koncentrációban serkentőleg hat. Az elválasztott állatokból származó sejteknél a dopaminnak viszont csak a gátló hatása érvényesül (148, 150). 2.3. A hypophysis közti-hátsó lebenyének szerepe a prolaktin elválasztás szabályozásában Számos eredmény támasztja alá, hogy a hypophysis közti és hátsó lebenye részt vesz laktotrop sejtek szabályozásában (45). Morfológiai sajátosságok alapján az itt termelődő anyagok, így az α-msh, oxitocin, vazopresszin, DA illetve eddig nem identifikált molekulák a rövid portális ereken keresztül elérhetik az AL sejtjeit, így részt vehetnek a PRL elválasztás szabályozásában. A hypophysis NIL-ének műtéti eltávolítása illetve denervációja megemelte a bazális PRL szintet nőstény és laktáló patkányban egyaránt (75, 76). Mivel a THDA és PHDA neuronok a NIL-ben végződnek, ezért kézenfekvőnek tűnt az innen felszabaduló DA valamint az oxitocin és vazopresszin hiányával magyarázni a fenti észleletet. Későbbi kísérletek azonban kimutatták, hogy ekkor a szopási stimulus által kiváltott PRL szekréció oxitocin és a vazopresszin egyidejű pótlása esetén is gátolt. A NIL perklórsavas kivonata mind in vivo mind in vitro serkentette a PRL elválasztást, amely hatás egy héttel a hypophysisnyél átmetszése után, a NIL és a hypothalamus közötti neurális kapcsolat megszűntével párhuzamosan (151, 152, 153, 154) megszűnt. Specifikus oxitocin receptor antagonista kezelés nem befolyásolta a NIL-i kivonat PRF aktivitását (153). Mindezekből arra következtettek, hogy a NIL tartalmaz eddig ismeretlen hypothalamikus PRF-et, és ez biztosan nem az oxitocin. 2.3.1. A közti lebeny szerepe - 41 -
A IL melanotrop sejtjei által termelt α-msh szerepet játszik a laktotrop sejtek funkciójának szabályozásában. A IL-ből a rövid portális ereken keresztül az AL sejtjeihez jutva receptoraihoz kötődni képes. Ezek legnagyobb számban a laktotropokon találhatók (155). Valószínűleg azonban az α-msh nem rendelkezik direkt PRL serkentő hatással, hanem a responsiveness faktorok közé tartozik. In vitro csökkenti a laktotrop sejtek nagy dózisban adott DA gátló hatása iránti válaszkészséget, illetve növelni képes a TRH-ra, ANG-I-re és a serkentő hatású, alacsony dózisban adott dopaminra (148, 150) adott PRL-release választ. α-msh immunneutralizáció nagymértékben csökkentette a szoptatás alatti PRL elválasztás (156, 42, 148). Ezzel ellentétben szopási inger hatására nem változott sem a plazma, sem a hypophysis elülső lebenyének α-msh koncentrációja (157, 158). Ez utóbbi megfigyelés alapján nem valószínű, hogy az α-msh részt vesz a szopási ingert követő PRL szekrécióban. 2.3.2. A hátsó lebeny szerepe A NIL kivonat korábban említett PRL serkentő hatásáért a hypothalamikus oxitocin is felelős lehet (159). Az oxitocin koncentrációja a portális vérben ugyanis 10-15-ször magasabb, mint a szisztémás keringésben, a nagy affinitású oxitocin receptorok pedig megtalálhatóak az elülső lebenyben (160, 161). A hypothalamus paraventricularis és a supraopticus magjainak magnocelluláris neuronjai által termelt oxitocin axontranszport révén a raktározás helyére, a hypophysis hátsó lebenyébe kerül. Az eminentia mediana-n keresztülhaladó axonok, szinaptikus buttonok kialakítása révén, kapcsolatba kerülnek a kapilláris hurkokkal, sőt az oxitocin a hosszú portális erekbe is ürülhet (160) Az oxitocin a hátsó lebenyből a rövid portális ereken keresztül is elérheti az AL sejtjeit. A szopásra adott PRL válaszban betöltött hypophysealis szerepét vizsgálva, munkacsoportunk megállapította hogy a szopási stimulus után nagymértékben megnőtt a IL-ben az oxitocin koncentráció, viszont az elülső lebenyben nem változott a - 42 -
kiinduláskor is nagyon alacsony oxitocin szint (158). Az oxitocin fiziológiás szerepe a IL-ben még nem ismert, oxitocin receptor itt nem található (162). A nagy dózisban adott oxitocin fokozza a PRL szekréciót hím és ovariektomizált nőstény állatokban, de laktáló patkányokban csökkenti a szopásra adott PRL választ (163, 164). Az oxitocin antiszérummal végzett passzív immunizáció csökkenti a szopási inger vagy az ösztrogén által kiváltott PRL emelkedést (159). Ugyanakkor specifikus oxitocin antagonista beadásakor, mely gátolja a szopás által indukált tejbelövellést, nem változik a szopási ingert követő PRL emelkedés (165). Úgy tűnik tehát, hogy bizonyos fiziológiás állapotokban PRF szerep tulajdonítható az oxitocinnak, de valószínűleg nem vesz részt a szopásra adott PRL válaszban. Az arginin-vazopresszin a hypothalamikus nucleus paraventricularis és supraopticus mag hátulsó magnocelluláris sejtjeiben termelődik. A vazopresszin immunreaktivitás emellett megtalálható a nucleus paraventricularis mediális kissejtes részében is. A magnocelluláris neuronok axonjai a hypophysis hátsó lebenyében, a parvocelluláris neuronokból kiinduló axonok pedig az EM külső rétegében végződnek, így a vazopresszin elérheti az AL sejtjeit a hosszú és a rövid portális ereken keresztül is (166). Korábbi kísérletek megmutatták, hogy a só- és vízháztartás felborítása a hypophysis hátsó lebeny szintjén jelentős változásokat okoz a PRL elválasztásban. A chiasma opticum mögötti kétoldali elülső deafferentáció, a nucleus paraventricularis teljes roncsolása illetve a hátsó lebeny denerválása után diabetes insipidus alakul ki és gátolt a szopásra adott PRL válasz (167, 168, 157, 158). Homozigóta Brattleboro patkányoknál, amelyekben genetikai hiba miatt nem termelődik vazopresszin és így szintén diabetes insipidusban szenvednek, nincs PRL szint emelkedés a szopás inger hatására (169, 170). A vazopresszin. in vivo serkenti a PRL elválasztást (171), in vitro azonban nincs PRL ürítést fokozó hatása (172). A neurofizin II képes emelni a PRL szintet, de valószínűleg nem direkt hypophysealis hatással (173). A 39 aminosavból álló glikopeptid, a vazopresszinneurofizin glikopeptid prekurzor karboxi terminális darabja, a PRL elválasztásban játszott szerepe még bizonytalan, in vitro körülmények között a PRL elválasztást serkentő, gátló illetve nem befolyásoló hatását is leírták már. Mindezen adatok arra - 43 -
utalnak, hogy az vazopresszin és neurofizin II valószínűleg szerepet játszik a PRL elválasztás szabályozásában. A PRL elválasztás szabályozása során ismertetett tényezők, azok sokszínűsége alapján elmondható tehát, hogy a szervezet homeosztázisát szabályozó PRL nem pusztán gátló illetve serkentő hormon által szabályozott, hanem regulációjában a neuroendokrin milieu játszik döntő szerepet. - 44 -
3. A salsolinol Az emberi agyban a salsolinolt (11. ábra) először Sjöquist és munkatársai mutattak ki (174). Míg az agyban, és a cerebrospinalis folyadékban csak az (R) enantiomer található meg, addig a perifériás vérben mind az (S) mind az (R) enantiomer kimutatható (174). A salsolinol vér-agy gáton való áthaladásáról eltérőek a vélemények. Korábbi kísérletekben intravénásan beadott salsolinolról kimutatták, hogy nem jutott át a vér-agy gáton. Sjöquist és Magnusson által végzett újabb vizsgálatokban azt találták, hogy az intraperitonealisan adott salsolinol hatására csökkent a nigrostriatalis rendszer DA szintje patkányban. Ez viszont azt sugallja, hogy a salsolinol átjut a vér-agy gáton. Az emberi agyban a salsolinol legnagyobb mennyiségben a striatumban, a hypothalamusban található. HO HO NH CH 3 Salsolinol (SAL) 1-metil-6,7-dihidroxi- 1,2,3,4-tetrahidroizokinolin 11. ábra A salsolinol szerkezete. - 45 -
3.1. A salsolinol kémiai szerkezet, szintézisének módjai A salsolinol szerkezetét tekintve a tetrahydroisoquinolinok közé sorolható: 1-metil- 6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin (lásd 11. ábra). Az emberi szervezetbe a táplálékfelvételen túl (például kakaó, banán, szója egyes vörösborok és sajtok nagy mennyiségben tartalmazzák) dopaminból és acetaldehidből a salsolinol szintetáz enzim katalizálása mellett szintetizálódni is képes (lásd 12. ábra). Ez a 34 kda molekulatömegű enzim kétféle reakció katalízisére képes: egyrészt a fent említett salsolinol szintézisét segíti elő dopaminból és acetaldehidből, másrészt dopaminból és piruvátból salsolinol-1-karboxilsav képződését gyorsítja. Ez utóbbit azonban eddigi ismereteink szerint nem alakítja tovább salsolinollá (176,177,178). 12. ábra A dopamin salsolinol szintézisével kiegészített metabolizációs lehetőségei (a salsolinol szintézise pirossal kiemelve). - 46 -
3.2. A salsolinol hatása a prolaktin elválasztásra Munkacsoportunk a közelmúltban hím, intakt és ovariectomizált nőstény állatokból származó NIL-ből és eminentia medianaból PRF-ként viselkedő anyagként (R)- salsolinolt izolált. A salsolinol (S) enantiomerje számos növényben megtalálható, így táplálékként bekerülhet az állati szervezetbe, míg az (R)-salsolinol enzimatikus úton állatok és az ember központi idegrendszerében is szintetizálódik, dopaminból és acetaldehidből (ld. 3.1. fejezet). A striatum és a hypothalamus DAerg sejtjei tartalmaznak egy úgynevezett salsolinol-szintetáz enzimet, amely képes szelektíven (R)-salsolinolt szintetizálni (75). A NIL denervációja után, a TH immunreaktivitás eltűnésével párhuzamosan nagymértékben lecsökkent a salsolinol mennyisége a NIL-i kivonatban, feltételezhető tehát, hogy a salsolinol a hypothalamikus DAerg neuronokban szintetizálódik, majd a NIL-be jut. A legnagyobb koncentrációban laktáló állatokból származó NIL-ben detektálták az elválasztási periódus előtt. Elválasztás után szintje nagymértékben csökkent, majd szopás hatására szignifikánsan nőtt, párhuzamosan a plazma PRL szintben megfigyelhető változásokkal. Szisztémás salsolinol kezelés gyors, szelektív és dózisfüggő módon serkentette a PRL elválasztást mind hím mind laktáló állatokban, míg a többi elülső lebenyi hormon ürítésére nem volt hatással. Mivel a salsolinol a véragy gáton nem jut át (179), így hypopysealis vagy egyéb vér-agy gáton kívüli hatóhely feltételezhető. A salsolinol in vitro is serkenti a PRL szekréciót, de az in vivo hatásnál kisebb mértékben. Mindezen adatok egyértelműen arra utalnak, hogy a salsolinol szerepet játszhat a PRL elválasztás szabályozásában, azonban ennek helye és mechanizmusa még nem ismert. A salsolinol az eddigi kutatások alapján a DAerg terminálisokon is hathat, mivel az itt fiziológiás körülmények között megtalálható és szekretálható DA mennyiségének jelentős csökkentésével a salsolinol PRL elválasztást serkentő hatása gátlódik (180). - 47 -
A jelen munkában ismertetett kísérleteink célja a salsolinol hatásmechanizmusának tisztázása. 3.3. A salsolinol és származékainak egyéb ismert hatásai A salsolinol metilált származékáról, az N-methyl-salsolinolról korábban kimutatták, hogy neurotoxikus hatással bír, mely kifejezett a nigrostriatalis DAerg sejteken. Az N- metil-salsolinol gátolni képes a tirozin-hidroxiláz aktivitását, mely a DA szintézis sebesség-meghatározó enzime. Emellett gátolja a mitokondriális komplex I és az alfaketoglutarát dehidrogenáz aktivitását is, mely hatásokon keresztül a sejtek energiatermelésére is hatással van (181). Fentieken kívül az N-metil-salsolinol direkt DNS károsító hatással is rendelkezik, valamint káros hatással lehet a szerotonin anyagcserére is. A fent említett mechanizmusokon keresztül főleg a nekrózist és apoptózist indukáló hatásán keresztül a DAerg sejteket elhalásához vezethet. E hatása miatt számos kutatás tárgya az N-metilsalsolinol lehetséges kóroki szerepe a Parkinson-kór kialakulásában (182). Lényeges megemlíteni, hogy az (R)- és (S)-salsolinol jelenlegi ismereteink szerint nem rendelkezik toxikus hatással. - 48 -
III. CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. A salsolinol a PRL elválasztást befolyásoló hatásáról ismert D 2 DA receptoron fejti-e ki hatását, esetleges antagonizmuson keresztül? a., Képes-e specifikus ligandját leszorítani a D 2 -es DA receptorról? b., Képes-e a D 2 receptor kötési paramétereit (K D, B MAX ) befolyásolni? 2. Létezik-e telíthető, specifikus salsolinol kötőhely különböző agyi régiókban illetve a hypophysisben? a., Salsolinol receptor binding assay kifejlesztése a specifikus kötőhelyek vizsgálatához. b., Különböző ligandumok hatásának vizsgálata az esetlegesen létező salsolinol kötőhelyre (leszorításos vizsgálatok). 3. Amennyiben létezik, milyen hatásmechanizmussal képes az in vitro és in vivo észlelt hatását kifejteni? Intracellularis camp szint meghatározása kontroll és salsolinol kezelés esetén. 4. Lehet-e a szoptatással összefüggő PRL elválasztás fokozódását előidéző neurotranszmitter vagy neuromodulátor? Laktáló állatban szoptatás hatására fellépő cmap szint mérése, a salsolinol kezelés alkalmával észlelhető változás összevetése céljából. - 49 -
IV. MÓDSZEREK 1. Kísérleti állatok és műtéti beavatkozások Kísérleteink során 200-250 g testtömegű felnőtt hím, valamint elsőszülő laktáló nőstény Sprague-Dawley patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat standard laboratóriumi körülmények között tartottuk 22 C-os szobahőmérsékleten 14:10 valamint 12:12 órás nappal-éjszakai ciklussal. A kísérleteket 10:00 és 14:00 óra között végeztük. A táplálékot és a vizet az állatok szabadon felvehették. Az anyákat egyedi ketrecekben tartottuk a kölykeikkel, a kölykök számát a szülést követő második napon nyolcra csökkentettük. Az állatokat dekapitációval pusztítottuk el. Az agyat gyors eltávolítását követően folyamatosan hűtöttük, majd Glowinski és Iversen módszere szerint (183) preparáltuk. Kísérleteink tervezése és kivitelezése, valamint a kísérleti állatok tartása során a National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals és a Semmelweis Egyetem Etikai Kódex szerint jártunk el. 2. Alkalmazott módszerek A következőkben ismertetett módszerekkel legkevesebb három, független kísérletet végeztünk. 2.1 Receptor binding assay Kísérleteink során egy viszonylag új - az intézetben eddig még nem alkalmazott - módszert használtunk. A receptor binding assay során a receptorok ligandkötésének paraméterei határozhatóak meg. Mérhető a receptor-ligand kötés erőssége (K A vagy K D ) valamint a kötési kapacitás (B MAX ). A ligand koncentrációjának növelésekor emelkedik a kötődő mennyiség addig, míg szabad ligandkötő hely rendelkezésre áll. Miután telítődtek a receptorok a kötött ligandum mennyisége nem növekszik tovább. A telítési koncentráció ismeretében - 50 -
meghatározható a receptorok mennyisége (B MAX ), valamint az 50 %-os telitettséghez tartozó ligandkoncentráció (K D ). A természetes kötőhelyek mellett a ligand egyéb helyekhez is kapcsolódni képes, de míg a receptorhoz specifikusan kapcsolódik ezek nem specifikus kötések. Szemben a specifikus kötőhelyekkel, a nem specifikusakról a ligand nem szorítható le, így meghatározásukhoz (vagyis a specifikus kötőhelyekről történő leszorítás céljából) feleslegben adott receptor agonistát vagy antagonistát használtunk. A specifikus kötés meghatározásához az így kapott, nem specifikus kötést jellemző értéket az összes kötésből le kell vonni. 2.1.1. Kísérleti preparátumok 6-8 patkány adenohypophysisét, eltávolításuk után 2 ml jéghideg 0.05 M koncentrációjú nátrium-foszfát pufferrel (ph=7.4) üveg-teflon szöveti homogenizátorban homogenizáltuk, majd a fehérjebontó enzimek aktivitásának csökkentése céljából 2 ml PMSF, DTT, Szójabab Tripszin Inhibitor, Gordox tartalmú proteáz inhibitor koktélba szuszpendáltunk (a proteáz aktivitást gátló koktél pontos összetételét a 2.1.4-es fejezetben ismertetem). 2.1.2. A mért adatok feldolgozása 2.1.2.1. Scatchard analízis A kapott adatok feldolgozásakor a telítési görbe matematikai átalakítások segítségével egyenessé alakítható, amiről a K D értéke könnyen meghatározható (Scatchard analízis) (317, 329). Az átalakítás lényege, hogy a kötött/szabad radioaktív ligand mennyiségét a kötött függvényében ábrázoljuk. Így egyenest kapunk, melynek meredeksége az -1/K D (-K A ) értékét adja meg, (1) tengely metszete pedig a kötési kapacitást (B MAX ) mutatja. - 51 -
Az egyensúlyra vezető biokémiai folyamatok mindegyikére felírható az alábbi egyenlet: A + B AB (1. egyenlet) Ahol A és B... reagáló anyagok AB... keletkezett vegyület Mivel a receptor-ligandum kötése is egy egyensúlyi folyamat, ezért erre az esetre adaptált egyenlet a következő: K 1 R + S < > RS K -1 A fenti folyamatra az egyensúlyi egyenlet: (2. egyenlet) Ahol: R... Receptor S... Szubsztrát RS... Kötött szubsztrát K 1 [RS] 1 = = = K A K -1 [R] [S] K D (3. egyenlet) Mivel a teljes receptorszám a szabad receptorok (R) és a kötött receptorok (RS) számának összege, ezért: [R t ] = [R] + [RS] A (3)-as és a (4)-es egyenletekből adódik: (4. egyenlet) [RS]=K A [S] [R t ] - K A [S] [RS] (5. egyenlet) - 52 -
Az (5)-ös egyenlet átrendezve: [RS] K A [S] = [R t ] 1+K A [S] Ahol [RS]/[R t ] a kötött receptorok frakciója (továbbiakban r ) (6. egyenlet) A (6)-os egyenlet grafikonja a r ([S]) koordináta rendszerben hiperbolát eredményez, melyet telítési görbeként ábrázolunk. Az (3)-as egyenletet átalakítva a (4)-es segítségével a következőt kapjuk: [RS] K A [R t ] - K A [RS] = [S] (7. egyenlet) Ábrázolva [RS]-t [RS]/[S] függvényében egy egyenest kapunk, melynek paraméterei: Az (1)-es tengely metszete a kötési kapacitást adja meg: K [R A t ] - K [RS] = 0 A K [R A t ] = K [RS] A [R t ] = [RS] Ez szemlélteti tehát azt a helyzetet, melyben az összes receptor kötve van. A meredekség (tgα ) pedig a -K A -t adja meg. Az ilyen módon ábrázolt egyenest nevezzük Scatchard egyenesnek (13. ábra). A transzformációhoz alkalmazott módszer a Scatchard Plot. - 53 -
13. ábra A Scatchard egyenes, melynek meredeksége -1/K D, (1) tengely metszete a B MAX. 2.1.2.2. Hill Plot módszer Amennyiben egy enzim vagy receptor több kötőhelyet tartalmaz (allosztérikus reakció) azok egymással kooperálhatnak, mely lehet pozitív és negatív egymásrahatás is. Matematikai transzformációk sorozatával (melyek ismertetésétől eltekintünk) elvégezhető a Hill Plot transzformáció. Ennek eredményét grafikusan ábrázolva egyenest kapunk (ld. 14. ábra), melynek meredeksége a Hill koefficienst (n H ) jelenti. Amennyiben az n H értéke eggyel egyenlő, akkor nem létezik allosztérikus kötőhely, illetve nincs kooperatív hatás (vagyis kísérleteinkben valóban egyetlen receptorligandkötőhely reakcióról beszélhetünk). Amennyiben n H <1 negatív kooperáció áll fent, n H >1 esetében a kötőhelyek közötti kooperáció pozitív hatású. - 54 -
14. ábra Hill Plot transzformáció. Magyarázat a szövegben. 2.1.3. Dopamin ( 3 H-spiperone) receptor binding assay Az adenohypophysealis D 2 DA receptorok affinitásának és kötési kapacitásának meghatározásához a 3 H-spiperone receptor binding assay módszert alkalmaztuk (184, 185, 186, 187, 188,189). A 200 µl végtérfogatú elegyeket (2.0-2.5 mg/ml fehérjekoncentráció) 7-12 különböző koncentrációjú 3 H-spiperone (c=0.5-25.6 nm, SA= 20 Ci/mmol, Amersham International) izotóppal inkubáltuk. A minták feléhez a nem specifikus kötés (NSB) meghatározása céljából haloperidol-t (c=10-4 M) mértünk. Az inkubációt a homogenátum hozzáadásával indítottuk 37 o C-os vízfürdőben a stady state állapot elérése céljából 30 percig. A membránreceptorokhoz kötött izotóp szeparációját Skatron Cell Harvester segítségével Whatman GF/B filteren keresztül jéghideg 0.05 M koncentrációjú nátrium-foszfát pufferrel (ph=7.4) végeztük. A radioaktivitás detektálása céljából a filterhez 2 ml Ultima Gold TM (Packard) szcintillációs folyadékot mértünk, majd 24 óra múlva a szcintillációs beütésszámot β-counter készülékkel - 55 -
detektáltuk. A mért adatokból a Scatchard analízist Prism 2.0-4.0 software segítségével végeztük (GraphPad Software Inc.). 2.1.4. 3 H-salsolinol receptor binding assay Az általunk kidolgozott módszerrel (első publikáció: B. E. Tóth, K. Homicskó, B. Radnai, W. Maruyama, J. E. DeMaria, M. Vecsernyés, M. I. K. Fekete, F. Fülöp, M. Naoi, M. E. Freeman, G. M. Nagy: Salsolinol is a Putative Endogenous Neurointermediate Lobe Prolactin-Releasing Factor. Journal of Neuroendocrinology 13: 1042-1050, 2001) a salsolinol kötőhely kötési tulajdonságai (affinitás, receptorszám) vizsgálható. Dekapitált patkány agyszövetének különböző területeit homogenizáltunk folyamatos hűtés mellett üveg-teflon homogenizátorban, 5 mm MgCl 2 -ot, 1 mm dithiotreitolt (DTT), 100 µm fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF), 50 µg/ml szójabab tripszin inhibitort, 40 KIU/ml aprotinint tartalmazó 50 mm-os TRIS pufferben (ph=7,4, 1:40 arányban). 20000g-n 20 percig, 4 ºC-on folytatott centrifugálást követően az üledéket pufferben (50 mm-os ph=7,4 NaCl-ot nem tartalmazó TRIS pufferben 1:75 arányban) reszuszpendáltuk, majd ismételt centrifugálást követően ugyanabban a pufferben 1:75 arányban szuszpendáltuk. A kötésvizsgálathoz az így nyert preparátum 100 µl-ét használtuk 250 µl-es végtérfogatban, három párhuzamos méréssel. A mérőelegy tartalmazott még 50 µl eltérő koncentrációjú 3 H-salsolinol (SA=997,8 GBq/mmol) izotópot (Fülöp Ferenc Szegedi Tudományegyetem, Gyógyszerkémiai Intézet; Kertész István, Tóth Géza MTA Szegedi Biológiai Központ, 190), valamint 100 µl puffert. A nem specifikus kötés vizsgálata 10 µm-os jelöletlen ligand jelenlétében történt. Az inkubáció 90 percig 4 ºC-on történt. A szűrést gyors vákuum filtrációs módszerrel Skatron Cell Harvesterrel Whatman GF/B filteren keresztül, 3x5 ml jéghideg 50 mm-os TRIS-HCl pufferrel (ph=7,4) történő mosás mellett végeztük. Szcintilláció eléréséhez Ultima Gold elegyet (Packard) alkalmaztunk. A mérést 12 óra - 56 -
equilibrium-idő után β-counter-ben végeztük. Az eredményeket Graphpad Prism (Version 2.0-4.0) program segítségével értékeltük. A fehérjekoncentráció mérését Lowry módszerével végeztük. 2.2. Direkt leszorításos vizsgálatok Direkt leszorítási vizsgálatok alkalmával a receptorokat azokra specifikus, radioaktívan jelölt ligandummal telítjük, majd növekvő koncentrációban, jelöletlen, az általunk vizsgált anyaggal próbáljuk meg leszorítani kötési helyéről. A különböző jelöletlen ligandum-koncentráció mellett mért beütésszámok alapján felvett görbéből következtethetünk a leszorítás tényére, annak biokémiai paramétereire (pl. IC 50 ). 2.2.1. Direkt leszorításos vizsgálatok D 2 receptor kötési helyéről A 200 µl végtérfogatú elegyben (2.0-2.5 mg/ml fehérjekoncentráció) található receptorkötő helyeket 10-8 M-os végkoncentrációjú 3 H-spiperone izotóppal telítettük (SA=20 Ci/mmol, Amersham International). A minták feléhez kontroll leszorítási görbe elérése céljából 7 féle koncentrációban (10-9 -10-3 M) D 2 receptor antagonista Haloperidol-t (C=2 mg/ml, Richter) adtunk. A párhuzamos csövekhez a vizsgálati anyagot mértünk, változó koncentrációban. Az inkubációt a homogenátum hozzáadásával indítottuk 37 o C-os vízfürdőben a egyensúlyi állapot elérése céljából 30 percig. A membránreceptorokhoz kötött izotóp szeparációját Skatron Cell Harvester segítségével Whatman GF/B filteren keresztül jéghideg 0.05 M koncentrációjú nátrium-foszfát pufferrel (ph=7.4) végeztük. A radioaktivitás detektálása céljából a filterhez 2 ml Ultima Gold TM (Packard) szcintillációs folyadékot mértünk, majd 24 óra múlva a szcintillációs beütésszámot β- counter készülékkel detektáltuk. A mért adatokból a Scatchard analízist Prism 2.0-4.0 software segítségével végeztük (GraphPad Software Inc.). - 57 -
2.2.2. Direkt leszorításos vizsgálatok salsolinol kötési helyről A 200 µl végtérfogatú elegyben (2.0-2.5 mg/ml fehérjekoncentráció) található receptorkötő helyeket 5*10-8 M-os végkoncentrációjú 3 H-salsolinol izotóppal telítettük (SA=997,8 GBq/mmol). A minták feléhez standard leszorítási görbe elérése céljából 12 eltérő koncentrációban (2,5*10-4 2,5*10-15 M) jelöletlen salsolinol-t adunk, tekintettel arra, hogy egyéb bizonyítottan elfogadható agonista vagy antagonista egyelőre nem áll rendelkezésre. A párhuzamos csövekhez a vizsgálati anyagot mértünk, változó koncentrációban. Az inkubációt a homogenátum hozzáadásával indítottuk 37 o C-os vízfürdőben a stady state állapot elérése céljából 30 percig. A membránreceptorohoz kötött izotópot szeparációját Skatron Cell Harvester segítségével Whatman GF/B filteren keresztül jéghideg 0.05 M koncentrációjú nátrium-foszfát pufferrel (ph=7.4) végeztük. A radioaktivitás detektálása céljából a filterhez 2 ml Ultima Gold TM (Packard) szcintillációs folyadékot mértünk, majd 24 óra múlva a szcintillációs beütésszámot β- counter készülékkel detektáltuk. A mért adatokból a Scatchard analízist Prism 2.0-4.0 software segítségével végeztük (GraphPad Software Inc.). 2.3. Intracelluláris camp szint meghatározása A sejten belüli camp koncentrációjának meghatározásához Gottshall és munkatársai (192) RIA elvére alapuló módszerét alkalmaztuk. A radioimmunassay vizsgálathoz laktoperoxidáz reakcióval előállított 125 I-Tirozil-cAMP-t használtunk, melyet szintézise után reverz fázisú HPLC módszerrel tisztítottunk Vydac C 18 oszlopon. A mintákat 0,5 ml 5%-os trifluor-acetilsavban homogenizáltuk üveg-teflon homogenizátorban, majd 12000 g-vel szobahőmérsékleten 30 percig centrifugáltuk. A felülúszót kétszer liofilizáltuk. A száraz üledéket RIA pufferben feloldva alkalmaztuk a camp meghatározáshoz. A camp antiszérum guanozin-5 -monofoszfáttal, adenozin-trifoszfáttal, valamint 8- bromo-camp-vel végbemenő keresztreakciója kevesebb, mint 0,1%-ban fordul elő. - 58 -
3. Statisztikai analízis A statisztikai feldolgozást ANOVA alkalmazásával végeztük, amit Student- Newman-Keuls teszt követett. Két csoport összehasonlítása esetén kétmintás t-próbát használtunk. Szignifikancia megállapításához 95 %-os konfidencia intervallumot (p 0,05) alkalmaztunk. - 59 -
V. EREDMÉNYEK 1. Salsolinol hatása a dopamin D 2 receptorra Első vizsgálataink alkalmával arra kerestük a választ, hogy a salsolinol a már ismert DAerg gátló hatás gátlásán keresztül fejti-e ki in vivo észlelhető PRL elválasztást serkentő hatását. Ezek alapján először a D 2 -es DAerg receptorra kifejtett hatást vizsgáltuk 3 H-spiperone receptor binding assay (2.1.3. módszer), valamint homológ leszorításos vizsgálatok (2.2.1. módszer) segítségével. A 15. ábra segítségével a háromszor ismételt egybevágó hatást mutatókísérletsorozat egyik reprezentatív eredményét ábrázoltuk. A kísérleteket laktáló állat adenohypophysisének membránpreparátumán végeztük. A salsolinol preinkubáció a radioaktív ligand hozzáadását megelőzően 5 percig tartott. Az (A) ábrán látható kísérlet alkalmával a 3 H-spiperon D 2 -es DA receptorról történő leszorítását vizsgáltuk. Kontrollként az ismert D 2 receptor antagonista Haloperidolt vizsgáltuk, mely látható módon koncentrációfüggő leszorítást eredményez. Ezzel szemben a salsolinol nem képes a radioaktívan jelölt ligandum leszorítására, így joggal felmerül annak lehetősége, hogy a salsolinol kötőhelye a D 2 DA receptortól eltérő. Az előzőekben ismertetett kísérletsorozat eredménye alapján a továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy különböző koncentrációban alkalmazott salsolinol képes-e -és amennyiben képes, hogyan és milyen koncentrációban- megváltoztatni a D 2 -es DA receptor 3 H-spiperone kötését, vagyis affinitási konstansát (K A ). A (B) ábrán a 10-6 M koncentráció mellett mért telítési görbét, és származtatott Scatchard-egyenest ábrázoltuk. Ekkor -mint ahogy más, az ábrán nem jelölt koncentráció (10-10 M<C salsolinol <10-4 M) mellett sem- nem látható különbség a kontroll és a salsolinolt tartalmazó minták mellett felvett egyenesek meredeksége között, azaz a receptor affinitásában sem mutatkozik különbség. - 60 -
(A) (B) 15. ábra: A salsolinol D 2 -es receptorhoz kötődésének jellemzői: kötési kapacitás, affinitás és leszorítás. (A) A D 2 receptor antagonista haloperidol és 10-6 M koncentrációjú salsolinol leszorítási kísérlete D 2 dopamin receptorról. (B) 3 H- spiperone binding assay: salsolinol hatása a receptorkötésre a Scatchard egyenes feltüntetésével. Magyarázat a szövegben. - 61 -
A 15. ábra (B) grafikonján ábrázolt Scatchard egyenes paraméterei a következők: Kísérleti állat Egyenes meredeksége Receptorkötési jellemzők K D B MAX KONTROLL -2906 ± 475.1 0,0003441 0,01793 SALSOLINOL -2861 ± 399.6 0,0003495 0,02189 A fenti kísérletekkel igazoltuk tehát, hogy a salsolinol nem a D 2 -es receptorhoz kötődve fejti ki hatását, mivel annak ligandját nem képes leszorítani a receptorról, és affinitási konstansát sem változtatja meg. - 62 -
2. Salsolinol specifikus kötőhelyeinek vizsgálata 3 H-salsolinol receptor binding assay módszerrel Folytatásként specifikus salsolinol kötőhelyek létezését próbáltuk igazolni, melyhez 3 H-salsolinol receptor binding assay módszert (2.1.4. módszer) dolgoztunk ki. Ezt a módszert a világon elsőként publikáltuk. 2.1. Salsolinol kötőhelyek a hypophysisben Ezen kísérleteket laktáló állatokból, dekapitációt követően eltávolított hypophysisekből előállított membránpreparátumokon végeztük. Makroszkóposan szeparálva az elülső- és a NIL-t, külön vizsgáltuk a két terület izotópkötő képességét. A 16. ábra hat független kísérlet eredményeit tartalmazza az átlag szórásának feltüntetésével. A Hill koefficiens értéke egyhez közelít (n H =0,95), mely valódi és nem allosztérikus receptor-kötőhely kapcsolódásra utal. Jól látható, hogy a salsolinol a laktáló állatok hypophysisének elülső, valamint NILének membránjához telíthető módon, specifikusan kötődik. A statisztikai adatokat a következő táblázat foglalja magában: Kötési kapacitás B MAX (pmol/mg fehérje) p Disszociációs konstans K D (nm) Elülső lebeny 5,99±0,62 0,013 78,0±7,8 Közti-hátsó lebeny 7,5±0,3 0,0011 155,8±27,9-63 -
16. ábra 3 H-salsolinol szaturációs görbéje laktáló patkány hypophysisének elülső (A) és közti-hátsó lebenyben (B). A három független kísérletből álló sorozat egyik reprezentatív eredménye. Magyarázat a szövegben. - 64 -
2.2. Salsolinol kötőhelyek a hypothalamo-hypophysealis rendszerben laktáló és szoptató állatokban Ebben a kísérletsorozatban arra kerestük a választ, hogy laktáló állatokban szoptatás hatására változik-e a 3 H-salsolinol-specifikus kötőhely kötődési paraméterei. Vizsgálatainkban laktáló, illetve 10 percig szoptató patkányok hypophysisének NILét, valamint az EM régióját használtuk membránpreparációhoz, ezeken a 2.1.4-es módszerrel vizsgálva az izotópkötő képesség változását szoptatás hatására. 17. ábra 3 H-salsolinol receptor binding assay hypophysis közti-hátsó lebenyén (A) valamint az eminentia mediana (B) területén laktáló és szoptató állatok esetében. Három független kísérlet egyik reprezentatív eredménye. Magyarázat a szövegben. - 65 -
Ahogy azt a 17. ábra mutatja, 10 perces szoptatási stimulus hatására a NIL-ben (A) a kötőhelyek affinitásában (K D ) és kötési kapacitásában (B MAX ) egyaránt változás mutatkozik, míg az eminentia mediana területén (B) pusztán a kötési kapacitásban (vagyis a kötőhelyek számában) tapasztaltunk szignifikáns változást. A hypophysis elülső lebenyében valamint a striatumban egyik paraméter esetében sem találtunk szignifikáns változást (az ábrán nincs feltüntetve). - 66 -
2.3 Salsolinol kötőhelyek egyéb agyi régiókban A különböző fiziológiás állapotokban (pl. szoptatás) tapasztalható eltérés mellet érdemes megvizsgálni különböző agyi régió 3 H-salsolinol kötési képességét. Ennek érdekében végeztük az alább ismertetett kísérletsorozatot. Minden szövet esetében három független kísérletet végeztünk. Ebben különböző agyi régiókból készítettünk membránpreparátumot, melyeket a 2.1.4-es módszer szerint kötési vizsgálatokat végeztünk. A vizsgált szövetek esetében kapott eredményeket ismerteti az alábbi táblázat: Szövet K D (nm) ± SEM B MAX (pmol/mg fehérje) Hypophysis Elülső lebeny 155,80 ± 27,94 40,30 ± 4,14 Közti-hátsó lebeny 78,00 ± 7,82 34,60 ± 1,40 Eminentia mediana 107,60 ± 34,57 61,30 ± 12,20 Hypothalamus 368,00 ± 91,18 100,50 ± 18,10 Striatum 209,00 ± 37,79 27,10 ± 3,08 Frontalis cortex 91,00 ± 34,97 24,40 ± 2,78 2. táblázat 3 H-salsolinol receptor binding assay módszerével mért receptor-ligand kötődési paraméterek különböző agyi struktúrákban Látható, hogy specifikus, telíthető 3 H-salsolinol kötődés észlelhető a hypophysis mellett az eminetia mediana, a hypothalamus, striatum, valamint a frontalis cortex területén is. - 67 -
A legalacsonyabb affinitású kötőhelyek a a hypothalamusban találhatók, míg a legmagasabb K D értéket a hypophysis NIL-ében mértünk. A legmagasabb kötési kapacitással (vagyis a legtöbb receptorral) a hypothalamus rendelkezik. - 68 -
3. 3 H-salsolinol leszoríthatósága kötőhelyéről homológ leszorítási vizsgálatokkal Leszorítási vizsgálatok alkalmával különböző kémiai ágensek specifikus kötőhelyért zajló kompeticiója vizsgálható. Ezekből a vizsgálatokból következtethetünk arra, hogy milyen más vegyületek képesek a korábban talált specifikus 3 H-salsolinol kötőhelyhez kötődni. A mérések során a 2.2.2-es módszert alkalmaztuk három független kísérletben. A leszorításhoz használt anyagokat a 18. ábra, valamint az 4. táblázat tartalmazza. 18. ábra Salsolinol leszorítása kötőhelyéről - 69 -
A 18. ábra az ott feltüntetett anyagok leszorítóképességét mutatja grafikusan ábrázolva. A leszorítás paramétereit (K i, IC 50 ) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Leszorító anyag IC 50 (M) ± SEM K i (nm) Salsolinol 1,10 ± 0,19 x 10-6 588 Dopamin 2,00 ± 0,20 x 10-7 106 Apomorphine 5,92 ± 0,68 x 10-7 317 L-DOPA 1,72 ± 0,15 x 10-7 91 α-methyl-dopa 7,20 ± 0,09 x 10-6 385 Carbidopa 2,38 ± 0,16 x 10-6 1273 Benserazide 2 x 10-7 Noradrenalin 2,31 ± 0,19 x 10-5 12350 3. táblázat 3 H-salsolinol leszorítása specifikus kötőhelyéről különböző anyagokkal, a leszorítás paramétereinek feltüntetésével. A 3. táblázatból leolvasható, hogy a 3 H-salsolinolt kötőhelyéről leginkább az α- methyl-dopa, apomorphin, DA, L-DOPA valamint a benserazide, kisebb inhibíciós hatással ugyan, de a noradrenalin, a carbidopa képes leszorítani. A DA transzporter ismert inhibitora, a mazindol nem képes a leszorításra, akárcsak az α 2 receptor agonista clonidine, valamint a további biogén aminok (szerotonin, hisztamin), melyek szintén nem rendelkeznek leszorítóképességgel (a táblázatban nincsenek feltüntetve). A 4. táblázat a leszorítási kísérletekben vizsgált ágenseket mutatja. Piros mezőben a leszorításra képes, kék mezőben a hatással nem bíró vegyületeket foglaltuk össze. Ezen kísérletek egy részét dr. Homicskó Krisztián PhD hallgató végezte az ismertetett módszer felhasználásával. - 70 -
L-Dopa + Haloperidol - SAL + Domperidone - Dopamin + Butachlamol - Apomorphine + Sulpiride - Carbidopa + Quinelorane - Benserazide + RGH-1756 - α-methyl-dopa + 7-OH-DPAT - Clonidine - Mazindol - Papaverin - 5HTP - Tyrosine - Phenylalanine - Tryptophane - NSD-1015-4. táblázat Eddigi leszorítási kísérleteinkben megvizsgált anyagok, és azok hatása. Bal oldalon piros mezőben a leszorító tulajdonságúak, jobb oldalon kék mezőben a leszorítást nem eredményezők. - 71 -
4. Szoptatás hatása az intracelluláris camp szintre Kísérleteink során a 4 órás elválasztást követő, 10 percig, valamint további 20 percig tartó szopási stimulus hatására bekövetkező intracelluláris camp szint változást vizsgáltuk (2.3. módszer) laktáló patkány hypophysis elülső lebenyének két, laktotrop sejteket tartalmazó területén, a belső és külső zónájában (IZ-AL és OZ-AL) valamint a közti- és hátsó lebenyében. A hypophysisben mért adatokat szemlélteti a 19. ábra. 19. ábra Intracelluláris camp szint patkány hypophysis elülső lebenyének belső (IZ- AL) és külső (OZ-AL) zónájában kontroll állapotban, valamint 10 és 30 percig tartó szoptatást követően. Három független kísérlet eredménye. A 10 percig tartó szopási stimulus hatására szignifikáns és szelektív camp koncentráció-emelkedést észleltünk a belső zónában (IZ-AL), melyet a 30 percig tartó stimulust követően vizsgált hatás nem követett, az akkor mért camp szint visszaállt a nem szoptatott állatban tapasztalt szintre. - 72 -
A külső zónában (OZ-AL) statisztikailag szignifikánsnak minősíthető különbséget nem találtunk. A hypophysis közti- és hátsó lebenyében mért értéket a 20. ábra mutatja. 20. ábra Intracelluláris camp szint patkány hypophysis közti- (IL) és hátsó (NL) lebenyében kontroll állapotban, valamint 10 és 30 percig tartó szoptatást követően. Három független kísérlet eredménye. Ellentétben az adenohypophysisben tapasztalttal, a hátsó lebenyben szignifikáns camp koncentráció csökkenést találtunk mind a 10, mind a 30 percig tartó szoptatási periódust követően. A bazálisan magasabb camp szint ellenére, a IL-ben szignifikáns camp szint változás nem észlelhető. Adataink a minták teljes camp szintet mutatják, így nincs direkt bizonyítékunk arra vonatkozóan, hogy ez a szopás stimulált változás előfordul-e valamennyi agyalapi mirigy sejtpopulációban, vagy csak a laktotropokra korlátozódik. - 73 -
5. Salsolinol kezelés hatása az intracelluláris camp szintre Kísérleteinkben kölykeiktől 4 órára elválasztott patkányoknak 10 mg/ttkg dózisban intravénásan adott salsolinol camp szintet befolyásoló hatását vizsgáltuk (2.3 módszer) a kontrollcsoporttal (i.v. fiziológiás sóoldatot kapott) szemben. A kísérleti állatokat a vizsgálat napján reggel 9:00-kor anyjuktól elválasztottuk. 4 órával később az anyák 10mg/ttkg dózisban intravénásan salsolinolt kaptak egyszeri, bólus adagolásban. 15 perc elteltével az állatokat dekapitáltuk, az eminentia mediana-t valamint a hypophysist gyorsan eltávolítottuk, majd az elülső lebenyt és a NIL-t szem ellenőrzése mellett szeparáltuk. A kezelést követő tizenötödik percben dekapitált állatok eminentia mediana területéről származó szövetében mért camp értékeit a 21. ábra, míg a közti-hátsó és elülső lebenyben kapott mérési eredményeket a 22. ábra foglalja össze. 21. ábra Salsolinol kezelés hatása az eminentia mediana camp koncentrációjára. Magyarázat a szövegben. Három független kísérlet eredménye. - 74 -
22. ábra Salsolinol kezelés hatása hypophysis közti-hátsó, valamint elülső lebenyének camp koncentrációjára. Magyarázat a szövegben. Három független kísérlet eredménye. Az eminentia mediana területén szignifikáns camp szint csökkenést tapasztaltunk, míg az elülső lebenyben szignifikáns camp szint emelkedést lehetett kimutatni. A NILben nem találtunk szignifikáns eltérést. - 75 -
VI. DISZKUSSZIÓ A klasszikus neuroendokrinológiai nézet szerint a hypothalamus arcuatus magjában képződő és az eminentia mediana területén a hosszú portális erekbe szekretálódó DA tónusos gátló hatást fejt ki az agyalapi mirigy laktotrop sejtjeire. Eszerint a PRL elválasztás serkentése a gátló hatású DAerg pályarendszerek gátlásának útján alakul ki. Jimmy D. Neill és munkacsoportja az emlő érző idegeinek ingerlésével szopási stimulust szimulált, eközben vizsgálva a hypophysis-nyél és az eminentia mediana DA tartalmát (193, 194, 85). Vizsgálataikkal igazolták, hogy a szopási stimulusra létrejövő PRL-szint emelkedést csak annak első 3-5 percében kíséri a neuroendokrin DAerg rendszer aktivitásának 60-70%-os csökkenése, ezután gyors, sorozatos DA pulzációt figyeltek meg, mely az ingerlés végéig fennmaradt. Ezen kísérletek alapján megállapítható, hogy a PRL elválasztás fokozódását a DA aktivitás csökkenése legfeljebb beindítja, de annak fenntartásában más, PRF-nak is szerepet kell játszania. Habár számos, PRL elválasztást fokozó (úgynevezett PRL release aktivitással rendelkező) anyagot sikerült azonosítani (ld. Irodalmi áttekintés 2.2.), de ezek mindegyike más funkciójáról ismert, így ez a hatás legfeljebb járulékos jelentősséggel bír. Számos munkacsoport kutatásainak célja ezért a PRL releasing faktor(ok) (PRF) azonosítása. A jelen értekezés alapjául szolgáló kísérletekben az előkísérleteink során a NIL perklórsavas kivonatából (mely a PRL elválasztást serkenteni képes) azonosított, és in vivo PRL elválasztást fokozó hatással rendelkező salsolinol hatásának mechanizmusára kerestünk magyarázatot. A salsolinol a TIDA vagy a PHDA pályarendszereken keresztül ürülhet (akár a DA-al kotranszmitterként) a NIL területén, ahonnan a rövid portális erek útján elérheti az adenohypophysis laktotrop sejtjeit. A DA-nal ellentétes salsolinol hatás kifejeződése több szinten, többféle mechanizmussal képzelhető el (a lehetséges mechanizmusokat a 23. ábra foglalja össze): 1. Az intracellulárisan DA-ból képződött salsolinol gátolni képes a DA szintézisét, ezzel csökkentve a DA leadást. Ezt a mechanizmust támasztja alá - 76 -
Minami és munkatársai (195) megfigyelése, mely szerint a salsolinol képes gátolni a TH enzimaktivitást. 2. A salsolinol a VMAT gátlása révén csökkenti a szinaptikus vezikulum DA tartalmát. 3. A DA-nal kotranszmitterként ürülve, vagy önmagában felszabadulva a. képes a DA hatásért felelős D 2 DAerg receptorhoz DA antagonistaként kötődni. b. saját receptorához kötődve a DA által kiáltott másodlagos hírvivő mechanizmusokat ellentétes hatással módosítani. 4. A salsolinol képes a DA neuronalis visszavételét a DAT-en keresztül fokozni, ezáltal annak extraneuronális térből történő eliminációját elősegíteni. - 77 -
23. ábra A salsolinol lehetséges támadáspontjai és hatásmechanizmusa. A feltételezett gátló hatások piros, a serkentők kék nyíllal jelölve. Magyarázat a szövegben. - 78 -