A Magyar Biokémiai Egyesület internetes folyóirata XXXIV. ÉVFOLYAM 2. SZÁM 2010. június
A Magyar Biokémiai Egyesület internetes folyóirata Szerkesztőbizottság: Bősze Szilvia, Erdődi Ferenc, Ifj. Gallyas Ferenc, Keserű György, Kiricsi Mónika (titkár), Nyitray László, Sarkadi Balázs, Székács András, Szondy Zsuzsa, Váradi András Főszerkesztő: Szűcs Mária XXXIV. ÉVFOLYAM 2. SZÁM Technikai szerkesztő: Márki Árpád 2010. június TARTALOMJEGYZÉK Címlapkép: Multidomén szerinproteázok térszerkezete röntgendiffrakcióval (lásd Závodszky Péter irását). AKIKRE BÜSZKÉK VAGYUNK Kitüntetések, díjak... 3. Új akadémikusaink... 5. A Széchenyi-díjas Závodszky Péter életútja... 7. Talentum Díjat kapott Kovács Mihály... 12. Akadémiai Ifjúsági Díjas Kovács Sándor Dénes... 22. HAZAI TUDOMÁNYOS ISKOLÁK Bemutatkozik az SZBK Biokémiai Intézet Szintetikus és Rendszerbiológiai Egysége... 32. TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK Ádám József: Új alternatívák az ELISA és a Western Blot technikákra... 42. KONFERENCIA BESZÁMOLÓK A 40. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg... 46. Az MBKE Gyógyszerbiokémiai Szakosztály 2010. évi munkaértekezlete, Balatonöszöd... 48. Az MTA Kémai Osztály Peptidkémiai Munkabizottságának 2010. évi ülése, Balatonszemes... 50. HIRDETÉSEK... 52. NEKROLÓG... 54. KULTÚRA Csermely Péter: Milyen a jó tanár?... 59. Kiadja a Magyar Biokémiai Egyesület, 4012 Debrecen, Pf. 6, http://www.mbkegy.hu/ Felelős kiadó Dr. Fésűs László Az engedély száma III/SZI/397/1977, HU ISSN 2060 8152 (Online) HU ISSN 0133-8455 (Nyomtatott)
Akikre büszkék vagyunk Kitüntetések, díjak Az MBKE tagjainak elismerései A Széchenyi-díj a legrangosabb magyar állami kitüntetés, a korábbi Állami Díj helyett 1990-től szolgál a tudományos élet kiemelkedő képviselőinek elismerésére. A díjazottakat a miniszterelnök jelöli ki, a díj pénzjutalommal és egy kisplasztikával jár. Az idei 20 díjazott közül tízen tagjai az MTA-nak. Kitüntetésben részesült: Dr. ÁDÁM VERONIKA orvos, az MTA rendes tagja, a Semmelweis Egyetem Általános Orvosi Kar Orvosi Biokémiai Intézet igazgatója, egyetemi tanár nemzetközileg elismert kutatómunkájáért, több évtizedes egyetemi oktatói munkásságáért és szakmai közéleti tevékenységéért, Dr. ZÁVODSZKY PÉTER biofizikus, az MTA rendes tagja, az MTA Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézet igazgatója, kutató professzor az enzimek stabilitása, flexibilitása és működése közötti összefüggések feltárásában végzett négy évtizedes tudományos és kutatói munkásságáért, tudományos-közéleti tevékenysége elismeréseként. A Szilárd Leó Professzori Ösztöndíjak átadására 2010. február 11-én, Szilárd Leó születésnapja alkalmából került sor. A Magyary Zoltán Felsőoktatási Közalapítvány az Alcoa Köfém Kft. segítségével és támogatásával (az amerikai székhelyű Alcoa Alapítványon keresztül) 1998-ban hívta életre a Szilárd Leó Professzori Ösztöndíjat. Az ösztöndíjjal minden évben három, világszerte elismert eredményt felmutató tudóst jutalmaznak, akik szakmai munkájukon túl személyes tekintélyükkel és iskolateremtő felelősségérzettel segítik egyetemi és doktori hallgatóik sikeres pályáját. A SE felterjesztésére a kuratórium a díjazottak közé választotta Dr. Gráf Lászlót, az MTA rendes tagját, az ELTE Biokémiai Tanszékének egyetemi tanárát, az ELTE-MTA KK Biotechnológiai kutatócsoportjának vezető professzorát a természetes peptidek valamint egyes proteázok kutatási területén végzett több évtizedes munkájáért. A tudomány és művészet kapcsolódását érzékletesen bemutató Fehérjeművészet című cikkét a Biokémia folyóirat 2009. decemberi számában olvashattuk. A Közép-Európai Tehetségkutató Alapítvány és életre hívója, Kenyeres Sándor üzletember 2002-ben azt a célt tűzte ki maga elé, hogy támogatást biztosítson a kimagasló tudományos tevékenységet folytató 35 év alatti magyar tudósok, kutatók, szakemberek munkájának és kreativitásának elősegítésére. A Talentum Díjat Élettudomány Kategóriában, 2009. februárban Dr. Kovács Mihály, az ELTE Biokémiai Tanszék tudományos főmunkatársa érdemelte ki Biológiai motorok működési mechanizmusai: a sejtmozgástól a genom karbantartásáig című munkájával. Az Akadémiai Ifjúsági Díjat az MTA főtitkára alapította 1972-ben, az akadémiai tudományos kutatóhelyen dolgozó 30 év alatti fiatal kutatók szakmai munkájának ösztönzésére és a kiemelkedő tudományos eredmények elismerésére. A díj elnyerésére egyéni munkával (könyv, cikk, cikksorozat, szabadalom, találmány, doktori értekezés, berendezés tervezés, építés), hazai vagy külföldi 3
Akikre büszkék vagyunk Kitüntetések, díjak szakmai visszhangot kiváltó tudományos és műszaki eredménnyel lehet pályázni. 2010-ben díjat kaptak: Dr. Erdélyi Katalin, az MTA Debreceni Egyetem Sejtbiológiai és Jelátviteli Kutatócsoport okleveles biológusa A poli(adp-ribozil)áció metabolizmus vizsgálata tüdőepitélsejtek gyulladásos kemokin- és citokinexpressziójában illetve sejthalálban című pályamunkájáért, Dr. Kovács Sándor Dénes, az MTA Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézet tudományos munkatársa, a Rendezetlen fehérjék chaperone aktivítása című pályamunkájáért. Gratulálunk a kitüntetteknek! 4
Akikre büszkék vagyunk Új akadémikusaink Új akadémikusaink Levelező tagok A tudományos elismerést olyan magyar állampolgár kaphatja, aki az MTA doktora címmel vagy azzal egyenértékűnek minősített tudományos fokozattal rendelkezik, és aki tudományát elismerten és különösen magas színvonalon, alkotó módon műveli. Hudecz Ferenc az ELTE Szerves Kémiai Tanszékén működő MTA ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport vezetője, az ELTE rektora. Az 58 éves vegyészprofesszor szűkebb szakterülete a biomolekuláris kémia, a bioorganikus kémia és az immunkémia. Kiemelkedő eredménynek számít annak a daunomicin tartalmú konjugátumnak a szintézise, amely in vivo kísérletekben leukémiás állatok teljes gyógyulását eredményezte. Hazai és nemzetközi bizottságokban, egyesületekben többszörösen díjazott tudományszervező tevékenységet végez. Hunyady László a Semmelweis Egyetem Élettani Intézetének igazgató egyetemi tanára és az Általános Orvostudományi Kar dékánhelyettese. Az 51 éves orvosprofesszor szűkebb szakterülete a molekuláris élettan és a kísérletes endokrinológia. Fő kutatási területe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok működésének vizsgálata. Azonosította az angiotenzinreceptor internalizációjának mechanizmusát, valamint a receptorok sejten belüli forgalmában szerepet játszó kompartmenteket. Molekuláris biológiai módszerekkel végzett kutatásainak jelentős szerepe volt a G-fehérjétől független jelátviteli mechanizmusok felfedezésében. Rendes tagok Az Alapszabály szerint rendes tagként az a magyar állampolgárságú levelező tag választható meg, aki levelező tagságának elnyerése óta jelentős tudományos eredményeket ért el. Erdei Anna immunológus, az ELTE Természettudományi Kar Immunológiai Tanszékének tanszékvezető egyetemi tanára. Az 59 éves tudós 2004 óta az MTA levelező tagja. Bizonyította, hogy az allergiás reakciókban kulcsszerepet játszó hízósejtek aktivációját gátló peptidek az IgE-kötő receptorkomplex bétaláncához kötődve, a jelátviteli folyamatokat befolyásolva fejtik ki hatásukat. Kimutatta, hogy a C1q komplementfehérje indukálja a dendritikus sejtek érését, és fokozza azok T-sejt-aktiváló képességét, így fontos szerepet játszik az adaptív immunválasz elindításában. A sclerosis multiplex állatmodelljét vizsgálva kimutatta, hogy a komplementrendszer alacsony aktivitása a betegség kezdetének időpontjában csökkenti a tüneteket és a T-sejt-választ. Gergely Pál biokémikus, a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Orvosi Vegytani Intézetének egyetemi tanára, igazgatója. A 63 éves tudós 2004 óta az MTA levelező tagja. Szűkebb szakterülete a molekuláris biológia. Az elmúlt hat évben munkatársaival megfigyeléseket tettek proteinfoszfatázok 5
Akikre büszkék vagyunk Új akadémikusaink szerepéről a sejtek közötti jelátviteli folyamatokban. Molekuláris biológiai, immunológiai és géntechnológiai módszerekkel tanulmányozták a miozinfoszfatáz szabályozó alegységének szerepét a kemorezisztenciában. Kimutatták, hogy az in vitro porcdifferenciáció szabályozásában több, az intracelluláris kalciumkoncentráció változására érzékeny enzim vesz részt. Az oxidatív stressz és a fehérjefoszforiláció kapcsolatának tanulmányozásával újabb jelátviteli mechanizmusok megismerését kezdték el. Mandl József orvos, a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézetének tanszékvezető egyetemi tanára. Szűkebb szakterülete a biokémia. A 63 éves tudós 2004 óta az MTA levelező tagja. Az elmúlt hat évben folytatta az endoplazmás retikulum (ER) élettani és patológiai szerepére vonatkozó kutatásokat. Megfigyelései elsősorban a különböző módszerekkel előidézett redox homeosztázisváltozások ER-stresszor hatásaira, a C-vitamin, az ER glukóz-6-foszfát készletének meghatározó szerepére, valamint a piridinnukleotidok redukáltsági állapotának funkciójára vonatkoztak. Munkacsoportja részt vett egy sikeres, klinikai fázis II vizsgálatok után lévő, cukorbetegség-ellenes szer kutatásaiban, felismerte annak májvédő hatását, valamint más gyógyszerfejlesztésekbe is bekapcsolódott. Sarkadi Balázs orvos, az Országos Vérellátó Szolgálat osztályvezető főorvosa, az MTA SE Membránbiológiai Kutatócsoport vezetője. A 62 éves tudós 2004 óta az MTA levelező tagja. Fő kutatási területe a biológiai membránok szerkezete és működése, a szervezet toxikus anyagokkal szembeni védelmében fontos szerepet játszó ún. ABC-transzporterek vizsgálata. Az ABC-transzporterek molekuláris szintű elemzéséről több közleménye jelent meg, amelyek ezen fehérjék működését, gyógyszerekkel és toxinokkal kapcsolatos hatásait vizsgálták daganatos, illetve normál sejtekben. Az elmúlt években elsősorban az emberi őssejtek membránfehérjéivel, az őssejtek gyógyító felhasználásának kutatásával foglalkozik. Vigh László biokémikus, az MTA Szegedi Biológiai Központjának stratégiai főigazgató-helyettese, kutatócsoport vezető, a Szegedi Tudományegyetem címzetes egyetemi tanára. A 60 éves tudós 2004 óta az MTA levelező tagja. Szűkebb szakterülete a stresszbiológia, a membránbiológia és a lipidomika. A stresszérzékelés centrális dogmája szerint a konformációjukat vesztett fehérjék szolgáltatják az elsődleges jelet a stresszfehérje-szintézis indukciójához. Levelező taggá választása óta munkatársaival együtt számos kísérlettel támasztották alá és egységes rendszerré alakították azt a celluláris hőérzékelési modellt, amely a membránban lokalizált szenzorok jelenlétét javasolja. Bizonyították, hogy a membrán fizikai állapotának és/vagy lipidösszetevőinek változásával járó mikrodomén destabiliziáció/átrendeződés hőmérő szereppel bír. Forrás: www.mta.hu 6
Akikre büszkék vagyunk Závodszky Péter életútja Závodszky Péter életútja Ha az ember egy rangos díjban vagy kitüntetésben részesül, annak az egyik következménye, hogy figyelmet kap a tevékenység, amelyet végez, s ezt a részét a dolognak valóban fontosnak tartom. Ezért is vállaltam, hogy röviden és közérthetően írok a munkámról a Biokémia felkérésére. Több évtizedes szakmai múlttal a hátam mögött talán érdemes a dolgot visszatekintéssel kezdeni, hátha akad benne tanulság mások számára is. Nálam a tudomány iránti érdeklődés korán, a debreceni Füvészkert Utcai Általános Iskolában kezdődött tanáraim hatására, akkor döntöttem el, hogy fizikus leszek, s ezt a szándékomat a debreceni Fazekas és a győri Révai gimnáziumban töltött évek megerősítették. Szerencsém volt a tanáraimmal és mestereimmel. Debrecenben az egyetemen fizikusként Szalay Sándor tanítványa voltam, kezdő kutatatóként Budapesten, a Karolina úton Straub Brunó környezetébe kerültem. Az akkori lehetőségek keretében hosszabb időt töltöttem Leningrádban, ahol Breszler (a hidrofób hatás felismerője), Volkenstein és Frenkel körébe kerültem olyan fiatalok közé, mint pl. Oleg Ptytsin. Moszkvában Engelhardt és Varshavsky fogadott a környezetébe. Én Straub F. Brunó éleslátása és kapcsolatai révén a Szovjetunióból is a legjobbat kaptam, s közben megtanultam oroszul hozzáférve ezáltal az igazi orosz kultúrához, ami a mai napig sok örömöt okoz. Azután a Caltech következett Pasadenaban, ahol a fehérje röntgen krisztallográfia egyik úttörője, Richard Dickerson mellett dolgoztam, s volt szerencsém Oxfordban a Nobel díjas Rodney Porter intézetében is eltölteni hosszabb időt, itt alakult ki máig tartó kapcsolatom a molekuláris immunológiával. Közben eltelt 15 év, amelynek nagy részét itthon töltöttem, a Karolina úton építettem saját kutatócsoportomat és szakmai hátországomat, első fizikusként az intézetben. Ennek fontos része volt a biofizika tárgy bevezetése és oktatása az ELTE-n. A felsorolásból kitűnik, hogy volt kitől tanulnom és volt módom látni: miként kell művelni a tudományos kutatást. A mesterek módszert, etikát, vezetési technikát taníthatnak az embernek, de nyilván észt, tehetséget nem adhatnak. Így e téren azzal gazdálkodtam, ami megadatott, de azt próbáltam mindig jól kamatoztatni. Adva volt a minta és a követelmény, s ez mindig mozgásban tartott. Pályám első szakaszában, a hatvanas években és a hetvenes évek elején elsősorban az enzimek működésének szerkezeti háttere foglalkoztatott. Ez volt a fehérje röntgen krisztallográfia hőskora, és mindenki a merev, elektron sűrűség térképeken nyugvó fehérje modellek újdonságának bűvöletében élt. A fizikusnak nyilvánvaló volt, hogy a mikrovilágban, a molekulák szintjén az energia és szerkezeti fluktuációk léteznek és jelentősek, s nem hagyhatóak figyelmen kívül. Ez időben sokat beszélgettem Straub F. Brunóval, intézetünk akkori igazgatójával, aki fogékonynak mutatkozott e gondolatok iránt, s arra buzdított, hogy keressem a kísérleti megközelítést a konformációs dinamika funkcionális szerepének tisztázására. Ebben az időben a fehérjék méretük és a technika fejletlensége miatt nem jöttek számításba az NMR vizsgálatok célpontjaként. 7
Akikre büszkék vagyunk Závodszky Péter életútja A hidrogén-deutérium kicserélődés kinetikájának követésében találtam meg a módszert, s enzimek sorozatán mutattuk meg, hogy a szubsztrátumok lokális kötődése az egész makromolekula konformációs fluktuációinak eloszlását képes megváltoztatni, s ennek a megjelenési formája az indukált szerkezetváltozás és a megváltozott affinitás a további ligandumok irányába. Kísérleteink alátámasztották a Straub által 1964-ben megfogalmazott fluktuációs fit koncepciót, ami ma konformációs szelekció néven nyert teret a molekuláris szintű információ átadás mechanizmusának értelmezésében. A fehérjék térszerkezeti fluktuációinak és konformációs dinamikájának leírása megkívánja a termodinamikai megközelítést, a hőmérsékletfüggés vizsgálatát. A fehérjék viszont - éppen gyenge kölcsönhatások által stabilizált, flexibilis térszerkezetük miatt - csak behatárolt hőmérséklet tartományban stabilisak. A vizsgálatok tartományának kiterjesztésére való törekvés vezetett a hőstabilis és hidegtűrő fehérjék bevonásához kísérleti objektumaink sorába. Ebben az időszakban homológ hőkedvelő, mezofil és hidegtűrő organizmusokból származó enzim sorozatokkal végeztünk komplex szerkezeti, funkcionális és stabilitási kísérleteket, amelyek egyik fontos konklúziója volt, hogy a fehérjék többségének esetében megfigyelt marginális stabilitás a működés optimális feltételei között annak tulajdonítható, hogy a funkcióhoz szükséges optimális konformációs dinamika, a szerkezetet stabilizáló kötések természetéből fakadóan csak szűk hőmérséklet tartományban biztosítható. Rendszerező munkát is publikáltunk arról, hogy milyen változatos stratégiával igazítja a természet az enzimek konformációs flexibilitását a működés hőmérsékletéhez. Ezen munkáink egyik mellék vonulata néhány gyakorlati eljárás kidolgozása az enzimek hőstabilitásának megnövelésére. 1972-ben Oxfordban, a Nobel díjas Rodney Porter laboratóriumában töltöttem egy évet. Azért mentem oda, mert az immunglobulinok, mint több doménből felépülő, multifunkcionális fehérjék felkeltették az érdeklődésemet. Arra kerestem a választ, hogy mi a mechanizmusa a domének közötti jelátvitelnek. Itt próbálkoztam először a fehérjék konformációs dinamikájának NMR-rel történő vizsgálatával (270 MHz), de a technika akkori lehetőségei nem voltak alkalmasak az általam felvetett kérdések megválaszolására. Így inkább a komplement rendszer aktiválásának mechanizmusával kezdtem foglalkozni, e területen lehetett Oxfordban akkor a legtöbbet tanulni. Azóta Gál Péter bekapcsolódásával sikerült itthon egy általánosan elismert komplement kutató műhelyt kialakítani. A komplement rendszer fehérjéi folyamatosan jelen vannak a vérben, de csak ott és akkor aktiválódnak, ahol és amikor erre szükség van a patogének elpusztításához. A nem célzott aktiválás nagy bajokhoz vezethet. Egy 30 különböző fehérjét magába foglaló rendszerről van szó, amelynek működése nagyon finom külső és belső molekuláris szintű szabályozást igényel. A komplement aktiválás három párhuzamos úton mehet végbe: a klasszikus, lektin vagy alternatív útvonalakon. Mi ezek közül az első kettővel foglalkozunk. Az a célunk, hogy a közreműködő fehérjék szerkezetéből levezetve határozzuk meg az aktiválás és szabályozás molekuláris mechanizmusát. Az elmúlt néhány év során klónoztuk, expreszáltuk és jellemeztük a klasszikus és lektin út kezdeti lépéseiben részt 8
Akikre büszkék vagyunk Závodszky Péter életútja vevő multidomén szerinproteázokat (C1r, C1s, MaSP1, MASP2), s ezek természetes és módosított domén kombinációit, valamint a C1-inhibitort. Kristályosítás után röntgendiffrakcióval meghatároztuk a térszerkezetüket, zimogén és aktivált formában. Különös technikai siker volt a C1-inhibitor szerkezetének meghatározása, mivel e gyógyászati szempontból fontos, de erősen glikozilált és flexibilis molekulával már sokan kudarcot vallottak. Némi protein engineering, a kitartás és a szerencse (egy új szerkezeti forma felfedezése) elvezetett a sikerhez. A szerkezetek alapján modelleket dolgoztunk ki a kölcsönhatások módjára (ezek a proteázok makromolekuláris komplexekben fejtik ki hatásukat) és az aktiválás mechanizmusára. Feltérképeztük a nem katalitikus modulok szerepét a kölcsönhatásokban és az aktiválásban, az intra- és inter-moduláris flexibilitás jelentőségét az egyes aktiválási lépésekhez szükséges átrendeződésekben. Feltártuk a szerkezeti- és töltés-komplementaritás szerepét a komplement proteázok és a C1-inhibitor kölcsönhatásainak szabályozásában, valamint a heparin szerepét a gátló hatás erősítésében. A C1r szerkezetének alapján új, a részleteket jobban megmutató C1 aktiválási modellt dolgoztunk ki. 1. ábra. A MASP-1 széles szubsztrátspecificitásának szerkezeti háttere. Laboratoriumi kísérletek során kimutattuk, hogy a MASP-1, szemben a többi komplement proteázzal, viszonylag széles szubsztrát specifitással rendelkezik. Szerepet játszik a komplement kaszkád beindításában, de képes trombin szubsztrátokat (pl. fibrinogén, XIII-as faktor, PAR4) is hasítani hozzájárulva ezzel a még hatékonyabb immunválasz kialakításához. Röntgendiffrakció segítségével megoldottuk a MASP-1 térszerkezetét és összehasonlítottuk más rokon szerin proteázok térszerkezetével. Az ábrán jól látszik, hogy a MASP-1 szubsztrát kötő árka jóval szélesebb, mint a MASP-2, C1r, C1s vagy D faktor komplement proteázoké. Azok a komplement proteázok, ahol a szubsztrátkötő régiót felszíni hurkok árnyékolják le, rendszerint csak egy, vagy két szubsztráttal képesek kölcsönhatást kialakítani. Ezzel szemben a MASP-1 szélesebb szubsztrát kötő árka, ami inkább a tripszinéhez hasonlít, teszi lehetővé, hogy a MASP-1 többféle szubsztrátot is képes hasítani. 9
Akikre büszkék vagyunk Závodszky Péter életútja A lektin út a komplementrendszer aktiválásának nemrégen felfedezett útvonala. A két indító szerinproteáz, a MASP-1 és MASP-2 rekombináns formában történő előállításával új lehetőséget nyitottunk meg a működés és szabályozás szerkezeti alapú megértéséhez. Tisztáztuk ezen proteázok szubsztrátspecificitását és a nem katalittikus modulok szerepét az aktív komplexek topológiájának kialakításában. Fontos megállapításunk, hogy a szinte azonos szubsztrátspecificitással rendelkező MASP-2 és C1s különböző kölcsönhatásokat alakít ki ugyanazon szubsztrátummal. Felfedeztük, hogy a MASP-2 zimogén formája jelentős enzimatikus aktivitással rendelkezik bizonyos fehérje természetű célpontokon, s megállapítottuk, hogy a szubsztrátum indukálta konformációváltozás ezen aktivitás alapja. Ez a felismerés magyarázatot ad az autoaktiválódás mechanizmusára. Az utóbbi időben kiterjesztettük vizsgálatainkat a komplementrendszer és más élettani folyamatok kapcsolatára. Kimutattuk a MASP-2 protrombin hasító képességét, kapcsolatot tárva fel a komplement és a véralvadási rendszerek között.sikerült fényt derítenünk az ellentmondásos funkciójú MASP-1 proteáz azon képességére, miszerint PAR-4, sejtfelszíni, proteáz-aktivált, G-fehérjéhez csatolt receptort hasít endotél sejtek felszínén, hozzájárulva ezzel gyulladásos folyamatok elindításához, a komplement aktiválással összefüggésben. Mivel a komplement rendszer hibás aktiválódása számos gyulladásos és autoimmun betegségben szerepet játszik, ezért gyógyászati szempontból nagy jelentősége lenne az aktiválási útvonalak szelektív gátlásának. Ezért tekinthető áttörésnek az általunk fág-bemutatás útján előállított, szelektív MASP-1 és MASP-2 inhibitorok előállítása, mivel sem kis, sem nagy molekulasúlyú szelektív inhibitornak nem voltunk eddig birtokában. Amikor az ember egy-egy tudományos részproblémával foglalkozik, nem midig látja, miként illeszkednek majd eredményei a világról alkotott egyetemes képünkbe. Ha valakinek megadatik, hogy néhány évtizeden át nagyjából koherens kutató tevékenységet folytasson, akkor felmérheti, mi ebből az időtálló. Visszapillantva azt gondolom, hogy fehérjekutatói munkámban akadnak ilyen elemek. A fluktuációs fit hatvanas évekbeli hipotézise, majd kísérleti alátámasztása, mint koncepció a fehérjék kölcsönhatásainak és szabályozásának mechanizmusára, kiállta az idő próbáját. A kísérleti technikák fejlődése hozott finomításokat és kísérleti adalékokat, de a koncepció alapjaiban igazolódott és helytállónak bizonyult. Más természetű a komplement rendszer kutatásával kapcsolatos munkánk. Ez esetben a gondosan tervezett, felépített és kivitelezett adatgyűjtő szerkezeti és funkcionális irányultságú tevékenység jelentősen hozzájárult ahhoz, hogy ma már a mozaikokból egy többé-kevésbé egységes kép alakult ki a komplement rendszer működéséről, ez a kép a mi munkánk és ötleteink nélkül nem lenne felvázolható. A kutató életének még akkor is, ha mindvégig akadémiai intézetben dolgozik része az oktatás. A hatvanas években Láng Ferenc bíztatására kezdtem szervezni a biofizika oktatását az Eötvös Loránd Tudományegyetemen. Ma már van Biológiai-fizika tanszék, és a Szerkezeti Biokémiai Doktori programnak is részt- 10
Akikre büszkék vagyunk Závodszky Péter életútja vevője vagyok. Közben létrejött a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információtechnológiai Kara, ahol Roska Tamás hívására a kezdetektől részese lehettem az élettudományok, a műszaki tudományok és az informatika összekapcsolására irányuló ígéretes kísérletnek. 1986 óta fizikai-biokémiát tanítok évente egy évnegyedben, Los Angelesben a UCLA-n (Kaliforniai Egyetemen), ami jó arra, hogy egy másféle kultúrában és környezetben csiszoljam magamat. A kutatómunkának van egy másik vonulata, a kutatási eredmények hasznosítása. Mint a Magyar innovációs Szövetség egyik alapítója és tisztségviselője, mindig törekedtem nem csak mások, de saját kutatási eredményeim és tapasztalataim gyakorlati hasznosítására. Ezek mindig az alapkutatás melléktermékeként jelentek meg. Így lehettem részese a MOM által gyártott analitikai ultracentrifuga tervezésének és megvalósításának, akkor, amikor a fehérjék alegységeinek kölcsönhatásaival foglalkoztam. Amikor nekiláttunk Rohonczi Ferenc mérnök barátommal, nem sejtettük, hogy minden idők legsikeresebben exportált magyar nagyműszerét hozzuk létre. Génsebészeti munkáink melléktermékeként jött létre két sikeres biotechnológiai kisvállalkozás. Némi részünk abban is van, hogy a Richter Gedeon Rt. rekombináns fehérje alapú biotechnológiai üzemet épít Debrecenben. Meggyőződésem, hogy a tudomány embereinek nem alkalmazott kutatást kell művelnie, hanem segíteni kell az alkalmazható kutatási eredményeik hasznosításában azokat, akik ebben érdekeltek, s ehhez értenek. Az, hogy kutatócsoportunk rajta van a tudomány nemzetközi térképén, azt elsősorban annak tulajdonítom, hogy mindig sikerült elkötelezett, tehetséges partnereket találnom a munkához. Kezdetben Simon István és Lakatos Zsuzsa, később Vonderviszt Ferenc és Kilár Ferenc voltak a környezetemben, majd utóbb Gál Péter, Kardos József, Szilágyi András, Dobó József, Hajdú István, Vas Mária, Cseh Sándor, Lőrincz Zsolt, Svingor Ádám, Kamondi Szilárd, Ambrus Géza, Beinrohr László, Végh Barbara voltak azok, akik meghatározó módon hozzájárultak eredményeinkhez. A természettudományos kutatómunka társas tevékenység, eredményesen kutatócsoportokban művelhető. Szerencsés esetben - és az én esetem ilyen az elméleti érdeklődésű és kísérleti irányultságú kutatók, a friss elméjű fiatalok és a tapasztalt idősebbek együttműködésére épül. A kutatás és az oktatás sem választható el egymástól, a kutatói élmény fontos forrása az oktatói hitelességnek és a diákokkal való kölcsönhatás tartja fenn a kételkedés és megújulás képességét. A tudományos felismerés intellektuális öröm, az eredmények alkalmazása, a praktikum pedig a hasznosság érzésének forrása. Azért tartom szerencsének, hogy tudományos életpályát választottam, mert életemben sohasem robotoltam, mindig a kedvtelésemnek élhettem, s ennek kapcsán még közvetlen hasznot is hajthattam, az oktatás és az innováció útján annak a közösségnek, amelybe beleszülettem. 11
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály Motorenzimek működési alapelvei és egyedi finomhangolása Nagy Nikolett, Takács Balázs, Kovács Mihály ELTE Biokémiai Tanszék A nukleotidok és fehérjék közötti kölcsönhatás az élet kémiájának alapvető, ősi jelensége. A nukleotid-hidrolízis enzimatikus katalízise az anyagcsere és energiaforgalom nélkülözhetetlen folyamatain túlmenően rendkívül sokféle motor- és jelátvivő enzim működésének hajtóerejéül is szolgál. E magas fokon specializált aktivitások teszik lehetővé a magasabbrendű szervezetek komplexitását és alkalmazkodó-képességét. Kutatócsoportunk (www.mk-lab.org) a sejtosztódást és a sejten belüli transzportot hajtó aktomiozin, valamint a DNS-hibajavításban és rekombinációban kulcsszerepet játszó DNS-helikáz motorenzimek működésének mikéntjét és szerepét vizsgálja. Jelen cikkünkben az aktomiozin rendszer biokémiai folyamatai és a rendszer mechanikai (erőgeneráló, illetve erőtartó) működése közötti összefüggéseket megvilágító, közelmúltban elért eredményeinket foglaljuk össze. Hidrolitikus hajtóerő befogása munkavégzésre Enzimek széles skálája hasznosítja a nukleozid-trifoszfátok (NTP) hidrolízise során felszabaduló szabadenergiát olyan intramolekuláris átalakulások hajtóerejeként, amelyek a partnerekkel (fehérjékkel, nukleinsavakkal, lipidekkel) történő kölcsönhatások révén hatékony jeltovábbító vagy erőgeneráló működést eredményeznek. Ezek az univerzális az NTP-molekula hidrolízisén, illetve a hidrolízis-termékek új NTP-szubsztrátra történő kicserélésén alapuló mechanizmusok olyan szerkezeti (allosztérikus) kommunikációs útvonalakat hasznosítanak, amelyek evolúciós konzerváltsága még egészen különböző élettani folyamatokban szereplő enzimek esetében is nyilvánvaló [1-3]. A G-fehérjék, miozinok és kinezinek nukleotidkötő helyének három legfontosabb konzervált szerkezeti eleme a switch-1 és switch-2, illetve a P-hurok (1A. ábra). Ezek az elemek a katalízis mellett az enzimek és a partnerek közötti allosztérikus kapcsolásban is bizonyítottan kulcsszerepet játszanak [4]. Az ezen elemekben mutatkozó némely esetben csupán egyetlen aminosavat érintő természetes változatosság ugyanakkor teret enged az enzimműködés specializációjának, egyfajta finomhangolási mechanizmust biztosítva az enzimek számára. Az erőgeneráló, jelátviteli, illetve anyagcsere-folyamatokban betöltött enzimfunkciók kölcsönható partnerekkel együttműködésben valósulnak meg, ami az enzim hatásának további hangolását teszi lehetővé. G-fehérjék esetében az allosztérikus aktivátorok (GAP: GTPase activating protein), illetve nukleotid-cserefaktorok (GEF: guanine nucleotide exchange factor); kinezinek illetve miozinok esetében pedig a sínként szolgáló mikrotubulus, illetve aktin filamentum elengedhetetlen kelléke a hatékony enzimműködésnek. A miozin motorok az ATP-ben tárolt kémiai energiát szerkezeti átalakulásokon keresztül mechanikai energiává alakítva az aktin sínen történő egyirá- 12
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály nyú elmozduláshoz hasznosítják. Ezek a minden eukarióta sejtben előforduló fehérjék teszik lehetővé számos sejtalkotó, sejt, szerv és szervezet mozgatását. A miozinok kulcsenzimei a vázizom-, szívizom- és simaizom-kontrakció folyamatának, illetve szerepet játszanak vezikulumok és molekula-komplexek 1. ábra. A miozin szerkezete és működési ciklusa. A) A motordomén funkcionális régiói és az ATPáz aktívhely konzervált szerkezeti elemei. B) Az aktomiozin működési ciklusának egyszerűsített sémája. C) A miozin 2 és miozin 5 holoenzimek alegység- és doménszerkezete. intracelluláris transzportjában, a sejtmigráció és -differenciáció, citokinézis, endo- és exocitózis folyamataiban [5]. Mind az egyedi molekulaként működő processzív transzporterek (amelyek számos enzimciklus és azzal járó mechanikai lépés elvégzésére képesek a sínről történő leválás előtt), mind a kötegelt (ensemble) formában (filamentumokban, illetve membránfelszíneken csoportosan) működő miozinok azonos elemi lépésekből álló enzimcikluson mennek keresztül az erőgenerálás során (1B. ábra). A miozin család képviselőinek sokrétű élettani (mechanikai) funkciói ugyanakkor az enzimciklus egyedi finomhangolását is megkövetelik [6]. Valamennyi miozin tartalmaz egy katalitikus (motor) domént, amely általában a fehérjék N-terminálisán helyezkedik el, és az ATP valamint az aktin kötőhelyét tartalmazza (1A. ábra). A motordoménből indul ki az erőkarként funkcionáló nyaki régió, amelyet a kalmodulin családba tartozó könnyűláncok stabilizálnak. Újabb eredmények szerint magányos egyszálú α-hélix motívumok is betölthetik az erőkar funkcióját [7, 8]. A C-terminális farokrégió a nehézláncok dimerizációjáért (és a filamentumképzésért) felelős coiled-coil-formáló szakaszokat, illetve egyéb effektor (pl. szállítmány- vagy membránkötő) doméneket tartalmazhat (1C. ábra) [5]. A miozin szupercsalád rendkívüli formagazdagsá- 13
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály gának és univerzális előfordulásának köszönhetően mára az eukarióta életfa filogenetikai kutatásának egyik legfontosabb objektumává nőtte ki magát [9, 10]. A motordomén három legfontosabb funkcionális egysége a nukleotidkötő zseb, az aktinkötő árok, valamint az erőkar kiindulópontja kifinomult intramolekuláris kommunikációt valósít meg az enzimciklus során (1A-B. ábra) [4]. A funkcionális egységek összehangolt működése teszi lehetővé a hatékony erőgenerálást, melynek során az erőkar felhúzásának aktinról levált, lecsapásának pedig aktinkötött állapotban kell történnie. Lencsevégen az erőgenerálás instabil köztiállapota A miozin enzimciklus fő útvonalának (1B. ábra) számos köztiállapotáról széleskörű szerkezeti és kinetikai-energetikai ismerettel rendelkezünk, azonban a folyamat legizgalmasabb része az erőgenerálás egyben a legkevésbé fel- 2. ábra. A blebbistatin stabilizálja az erőgeneráló lépés kezdőállapotát. A) A blebbistatin szerkezete. B-C) Egytriptofános miozin mutáns (W501+) triptofán fluoreszcencia-emissziós spektrumai különböző nukleotidok jelenlétében, blebbistatin nélkül (B) illetve a gátlószer jelenlétében (C). A W501+ az erőkar szenzora: magas fluoreszcenciája blebbistatin és ADP jelenlétében a felhúzott erőkarú állapotot jelzi. D) A blebbistatin nem változtatja meg a miozin-adp komplex magas aktin-affinitását. Az ábra az ADPkötött miozinfejek aktinkötöttségi hányadának aktinkoncentráció-függését mutatja, amelyet ultracentrifugálást követő SDS-PAGE denzitometriás analízis révén határoztunk meg blebbistatin nélkül (teli négyzetek) illetve a gátlószer jelenlétében (üres négyzetek). E: Elektronmikroszkópos felvételek, amelyek azt igazolták, hogy a blebbistatin erőkar-felhúzást indukál az ADP-kötött miozinfejekben. Ezen eredmények alapján az aktomiozin-adpblebbistatin komplex szerkezete nagyban hasonlít az 1B ábra jobb alsó sarkában bemutatott erőgenerálás-indító állapotra. 14
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály derített is [4, 11]. A nukleotidmentes, aktinhoz erősen kötött (rigor állapotú) miozin ATP-kötése a miozin aktinkötő árkának kinyílásához és az aktomiozin komplex disszociációjához vezet [12, 13]. A kötött ATP ezután a switch-2 hurok záródását indukálja, mely egyrészt katalitikus konformációba hozza az aktívhelyet, másrészt allosztérikus kommunikációs útvonalakon az erőkar felhúzását eredményezi [4, 14]. A hidrolízist követően kialakuló miozin-adp-foszfát komplex visszakötődik az aktin sínhez, amely kinetikailag aktiválja az erőkar lecsapását és az erőgeneráló lépéshez (powerstroke) vezet utóbbi lépéshez kapcsoltan a hidrolízis-termékek is felszabadulnak a miozinról [15]. A felhúzott erőkarú aktomiozin-adp-foszfát négyes komplex ezért az erőgenerálás kiindulópontjának tekinthető [11]. Fontossága ellenére azonban ezt az állapotot rövid életideje és alacsony steady-state részaránya miatt rendkívül nehéz elkapni szerkezeti-energetikai jellemzés céljából. Korábban jellemeztük a blebbistatin, egy sejtbiológiai és élettani vizsgálatokban rendkívül hasznosnak bizonyult miozin-inhibitor gátlási mechanizmusát (2A. ábra) [16]. Újabb kísérleteinkben arra a meglepő felfedezésre jutottunk, hogy ADP jelenlétében a blebbistatin a miozint erős aktinkötő, felhúzott erőkarú szerkezetben fagyasztja be, amely állapot nagymértékben hasonlít az erőgenerálás gátlószer nélkül igen nehezen stabilizálható hiányzó láncszemére, amelyet így elsőként sikerült kimutatnunk [17]. A szerkezet spektroszkópiai és gyorskinetikai jellemzéséhez egytriptofános motordomén konstrukciókat használtunk, amelyek a switch-1 (és ezen keresztül az aktinkötő árok), illetve az erőkar mozgását érzékelik (2B-C. ábra) [18, 19]. A szerkezet nagy aktin-affinitását ultracentrifugálásos kísérletekkel (2D. ábra), az erőkar felhúzott állapotát pedig elektronmikroszkópos felvételekkel (2E. ábra) is igazoltuk. A miozin belső rugója megfeszül az aktin kötésekor A miozin erőgenerálásának alapvető mozzanata az aktomiozin kölcsönhatás létrejötte: az erőkifejtő lépés során létrejövő erős aktinkötés fontos energetikai hajtóerőt képvisel. Az erősen aktinkötött, nukleotidmentes (rigor) állapot az erőkifejtő lépés végállapota (1B. ábra) [4]. E fontos állapot atomi szerkezetét azonban több évtizednyi erőfeszítés ellenére sem sikerült meghatározni. A különálló fehérjék (miozin motordomén, aktin monomer) kristályszerkezeteinek a rigor komplex elektronmikroszkópos képeibe történő dokkolása arra derített fényt, hogy a motordomén akkor rendelkezésre álló aktinmentes szerkezetében megfigyelt aktinkötő ároknak be kell záródnia az erős aktinkötés létrejöttéhez [13, 20]. Később kiderült, hogy a vezikulum-transzporterként működő miozin 5, illetve eredményeink alapján a puhatestű (Loligo) izom miozin 2 nukleotidmentes állapotban zárt árkú szerkezetet vesz fel aktin távollétében is [21, 22]. Újabb spektroszkópiai, gyorskinetikai és kalorimetriás kísérleteinkben kimutattuk, hogy ez a szerkezeti változatosság pontos korrelációt mutat az egyes miozinok aktinkötésének energetikájával: ha az aktinkötési folyamat árokzáródást indukál, akkor endoterm karakterű; ha az árok eleve zárt aktin távollétében, akkor az aktinkötés exoterm (3. ábra) [23]. Atomi szintű energetikai számításaink és korábbi szerkezeti információk alapján az árokzáródással járó kedvezőtlen entalpia-változás a motordomén magjában elhelyezkedő hétszálú 15
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály 3. ábra. Különböző miozinok aktinkötésével járó entalpiaváltozás. Nukleotidmentes (fekete) állapotban egyedül a nyúl vázizom miozin 2 aktinkötése endoterm folyamat. Az ároknyílást indukáló ADP jelenléte (narancssárga) valamennyi miozin aktinkötését endoterm irányba tolja el. β-lemez torziós feszüléséből származik. Ez a szerkezeti elem jelenlegi nézetek szerint a nukleotid- és aktin-kötőhelyek közötti allosztérikus kommunikációt belső erőátvivő rugó gyanánt szolgálja [22]. A miozinban tehát ha az aktinkötés nyitott árkú (pl. nukleotidkötött) állapotból indul belső feszültség ébred az aktinhoz történő precíz térbeli illeszkedés érdekében. Nukleotidcsere szabályozza a miozinok haladási sebességét Az eddig említett kísérletek az izolált miozin motordomén energia-átalakító működésének megértését célozták. In vivo azonban gyakorlatilag minden miozin több motoregységből álló szerveződésben ( kétfejű * dimerként, illetve filamentumokba vagy egyéb szupramolekuláris egységekbe kötegelve) fejti ki működését [5]. A mechanikailag és energetikailag hatékony működés megköveteli a motoregységek (fejek) tevékenységének összehangolását [6]. Ennek a magasabb szerveződési szinten zajló kommunikációnak a megvalósítására a motorenzimek az egyes fejekre a nyak húzásán keresztül ható mechanikai terhelést használják fel [24, 25]. Ez a kommunikációs forma a klasszikus allosztéria-fogalom kiterjesztésére ad alapot: az egyes motoregységekre ható külső mechanikai erő a motordomén szerkezetének, illetve energiatájképének módosításán keresztül döntően befolyásolhatja az enzimciklus kinetikaienergetikai paramétereit. A kétfejű * dimerként, alternáló (hand-over-hand) mechanizmussal lépegető miozin és kinezin izoformák processzív haladásának feltétele, hogy bármely időpillanatban legalább az egyik fej kötődjön a sínhez. Ehhez az enzimciklusok öszszehangolt, eltolt fázisú működése szükséges. A steady-state működés során a miozin 5 egyedi fejei a ciklusidő kb. 70 %-át töltik aktinkötött állapotban (duty ratio, terhelési arány). A fejek közti koordináció hiányában egy dimer molekula * Fej alatt a motordomén és a hozzá tartozó nyakrégió együttesét értjük 16
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály így átlagosan kb. 10 lépési ciklust végezhetne a sínről való leválást megelőzően. Egyedimolekula-motilitás kísérletek alapján tudjuk viszont, hogy a miozin 5 processzivitása ennél jelentősen magasabb, átlagosan 60 lépés elvégzésére is képes [26]. Ezt az magyarázza, hogy a két fej között fellépő ellentétes irányú húzóerő a vezető fej aktinról való leválásának lassulását (mozgás irányával ellentétes erő hatása), míg a követő fej leválásának gyorsítását (mozgással egyirányú erő hatása) eredményezi [27]. Újabb kísérletek tanúsága szerint a miozin 5 mechanikai koordinációja a processzív haladás energetikai hatékonyságát is növeli a felesleges, transzlokációhoz nem vezető ATPáz ciklusok elkerülésének elősegítésével [7]. Arra a kérdésre, hogy a fejek közötti feszültség az enzimciklus mely kinetikai lépéseit hangolja, a nem-izom miozin 2 (NM2) és miozin 5 motorokon végzett gyorskinetikai, szerkezeti és egyedimolekula-mérések alapján kaptunk választ [28, 29]. Mindkét miozintípus a magas terhelési arányú motorok közé tartozik, e sajátság NM2 esetén a hosszú távú erőtartásban, míg miozin 5 esetén a fent említett processzív dimer működésben játszik fontos szerepet. A magas terhelési arányt mindkét miozin esetén az biztosítja, hogy az ATP-hidrolízist, az aktinhoz való visszakötődést és a foszfát-felszabadulást követően létrejövő erősen aktinkötött miozin-adp komplexből az ADP felszabadulása lassú (a működési ciklus sebesség-meghatározó lépése) [30-32]. Az NM2 in vivo minifilamentumokba rendeződve szolgál a citokinézis, a sejtmigráció és a simaizom-kontrakció hajtóerejéül [33]. Egyfejű (terheletlen kontroll) és kétfejű aktinkötött (terhelt) NM2 konstrukciók gyorskinetikai és elektronmikroszkópos vizsgálatával megállapítottuk, hogy az egyes fejek különböző irányú terhelése markánsan befolyásolja az ADP-felszabadulás kinetikáját, lehetővé téve így a molekula terhelési arányának hangolását [28]. Az erőtartó funkció segítésére a molekulán belül fellépő mechanikai feszültség csökkenti a mozgás irányával ellentétes irányú erő hatása alatt lévő fej ADP-felszabadulásának sebességét, így biztosítva hosszú távú erőtartást; míg a mozgás irányába ható erő gyorsítja az ADP-felszabadulást, így az NM2 fejek nem akadályozzák a gyorsabb motorok (pl. simaizom-miozin) által hajtott kontrakciót. A miozin 5 esetében a fellépő intramolekuláris feszültség szintén a sebességmeghatározó ADP-felszabadulás időzítését szabályozza az erősen aktinkötött aktomiozin-adp komplexben [24, 25]. Az egyedi fejek aktinról való leválásának ilyen módon történő összehangolása biztosítja a szállítmány (endoplazmatikus retikulum, melanoszómák, szinaptikus vezikulumok) 1-2 µm (30-60 lépésnyi) távolságba juttatását. A közelmúltban végzett kísérleteinkkel igazoltuk, hogy az ADP-felszabadulás hangolása az élettani funkció betöltését segítő adaptációs mechanizmusként működik a miozinok evolúciója során [29]. Miozin 5 esetén a szállítmány célhelyre juttatása mellett a haladás sebességének optimalizálása is fontos lehet egyes folyamatok során, pl. a fotoreceptorokban és a belsőfül szőrsejtjeiben működő, gyors ingerületvezetést biztosító szinapszisok esetében [34]. Kimutattuk, hogy a nukleotid-kötőzsebben található switch-2 hurok, amely a G-fe- 17
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály hérjék, kinezinek és miozinok konzervált szerkezeti eleme (4A. ábra) [2, 3], az NTP-hidrolízis katalízise mellett kiterjedt kommunikációs kapcsolatai révén biztosítja az NTP hidrolíziséből származó energia produktív felhasználását. A switch-2 szekvenciája a miozin szupercsaládon belül egyetlen pozícióban mutat variabilitást (4A. ábra). E pozícióban a miozin 5 osztály tagjai tirozint tartalmaznak, míg ugyanitt számos más miozin osztályban kisebb oldalláncú aminosavak találhatók. Vad típusú és pontmutáns miozin 5 konstrukciók kinetikai és 4. ábra. A switch-2 hurok szerkezete meghatározza az ADP-felszabadulás kinetikáját és a miozin 5 processzív haladási sebességét. A) A switch-2 aminosav-szekvenciája és konzervált kommunikációs útvonalai különböző NTPázokban. B) Vad típusú és switch-2 ( X pozíció ) pontmutáns miozin 5 konstrukciók ADP-felszabadulási tranziensei stopped-flow gyorskinetikai mérésben. C) A konstrukciók steady-state ATPáz aktivitásának aktinkoncentráció-függése. D) Kétfejű vad típusú (fekete) és switch-2-mutáns (piros) miozin 5 konstrukciók aktinon való haladásának sebessége TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) egyedimolekula-motilitás mérésben. A B-D ábrákon bemutatott eredmények alapján az Y439A switch-2 mutáció az ADP-felszabadulás (nukleotidcsere) kinetikai változásán keresztül az ATPáz aktivitás és a mozgási sebesség arányos lassulását okozta. E) Kétfejű miozin 5 konstrukciók processzív futáshossz-eloszlása TIRF kísérletben. Az eredmények megmutatták, hogy az Y439A mutáns haladási sebességének lassulása ellenére a processzivitás és az energetikai hatékonyság változatlan maradt, e sajátságok tehát egymástól függetlenül szabályozhatók. egyedimolekula-motilitás vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy a switch-2 miozin 5-re jellemző változata teszi lehetővé a szállítófehérje gyors processzív működését [29]. A Mg 2+ -függő ADP-felszabadulás kinetikája a konstrukciókban precíz korrelációt mutatott az aktinon történő transzlokáció sebességével: ezáltal demonstráltuk, hogy a nukleotidcsere kémiai folyamata közvetlenül megha- 18
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály tározza a motor mechanikai teljesítményét (4B-E. ábra). Az eredmények azt is jelzik, hogy a switch-2 génsebészeti módosítása mesterséges motorok sebességének hangolására is felhasználható. Egyre több megerősítést nyer az a szemlélet, amely szerint a Mg 2+ -függő nukleotidcsere a metabolikus, jelátviteli és erőgeneráló folyamatokat működtető enzimek széles skálájának univerzális, ám egyedileg finomhangolt szabályozója [1, 35]. E kép alapján az aktin például a miozin allosztérikus nukleotidcserefaktorának ( GEF-jének ) tekinthető. A közeljövőben a területen zajló kutatás vezérfonalát alighanem e szabályozási mechanizmus szerkezeti és dinamikai részleteinek, elveinek felderítése fogja képezni, ami tovább gazdagítja majd az életfolyamatok fizikai-kémiai alapjairól alkotott képünket. Nagy Nikolett 2008-ban szerzett diplomát az ELTE TTK biológus szakán. 2008 szeptembere óta az ELTE Szerkezeti Biokémia Doktori Programjának hallgatója. Az ELTE Biokémiai Tanszékén, Kovács Mihály motorenzimológiai kutatócsoportjában készíti doktori munkáját. Fő kutatási területe a processzív motorműködés szerkezet-funkció összefüggéseinek feltárása. Takács Balázs 2006-ban szerzett biológusdiplomát az ELTE TTK-n. Szakdolgozatát az ELTE Immunológiai Tanszékén, prof. Sármay Gabriella témavezetésével készítette. 2006 szeptemberében felvételt nyert az ELTE Szerkezeti Biokémia doktori programjára. Kovács Mihály csoportjában végzett munkája alapján jelenleg doktori dolgozatát írja. Kovács Mihály az ELTE-n szerzett biológusdiplomát 1998-ban. Tanulmányait az ELTE-n és a Leicesteri Egyetemen folytatta, 2002-ben kapott Ph.D. fokozatot. Ezután az amerikai National Institutes of Health-ben dolgozott posztdoktorként. 2005-ben tért vissza az ELTE Biokémiai Tanszékére, ahol a motorenzimológiai kutatócsoportot vezeti (www. mk-lab.org). 2008-ban habilitált, munkáját 2009-ben az MTA Talentum Díjával jutalmazták. Fő érdeklődési területe különböző biológiai motorok (aktomiozinrendszerek, DNS-helikázok) működési és szabályozási mechanizmusainak, valamint mechanikai erők enzimműködésre gyakorolt hatásainak vizsgálata. Irodalomjegyzék 1. Goody, R. S. and Hofmann-Goody, W. (2002) Exchange factors, effectors, GAPs and motor proteins: common thermodynamic and kinetic principles for different functions, Eur. Biophys. J. 31, 268-274. 2. Kull, F. J., Vale, R. D., and Fletterick, R. J. (1998) The case for a common ancestor: kinesin and myosin motor proteins and G proteins, J. Muscle Res. Cell Motil. 19, 877-886. 3. Vale, R. D. (1996) Switches, latches, and amplifiers: common themes of G proteins and molecular motors, J. Cell Biol. 135, 291-302. 4. Geeves, M. A. and Holmes, K. C. (2005) The molecular mechanism of muscle contraction, Adv. Protein Chem. 71, 161-193. 5. Sellers, J. R. (1999) Myosins Oxford University Press, New York. 6. De La Cruz, E. M. and Ostap, E. M. (2004) Relating biochemistry and function in the myosin superfamily, Curr. Opin. Cell Biol. 16, 61-67. 19
Akikre büszkék vagyunk Talentum Díjat kapott Kovács Mihály 7. Baboolal, T. G., Sakamoto, T., Forgacs, E., White, H. D., Jackson, S. M., Takagi, Y., Farrow, R. E., Molloy, J. E., Knight, P. J., Sellers, J. R., and Peckham, M. (2009) The SAH domain extends the functional length of the myosin lever, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 106, 22193-22198. 8. Suveges, D., Gaspari, Z., Toth, G., and Nyitray, L. (2009) Charged single alpha-helix: a versatile protein structural motif, Proteins 74, 905-916. 9. Richards, T. A. and Cavalier-Smith, T. (2005) Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes, Nature 436, 1113-1118. 10. Odronitz, F. and Kollmar, M. (2007) Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species, Genome Biol. 8, R196. 11. Malnasi-Csizmadia, A. and Kovacs, M. (2010) Emerging complex pathways of the actomyosin powerstroke, Trends Biochem. Sci. under review. 12. Conibear, P. B., Bagshaw, C. R., Fajer, P. G., Kovacs, M., and Malnasi-Csizmadia, A. (2003) Myosin cleft movement and its coupling to actomyosin dissociation, Nat. Struct. Biol. 10, 831-835. 13. Holmes, K. C., Angert, I., Kull, F. J., Jahn, W., and Schroder, R. R. (2003) Electron cryo-microscopy shows how strong binding of myosin to actin releases nucleotide, Nature 425, 423-427. 14. Malnasi-Csizmadia, A., Pearson, D. S., Kovacs, M., Woolley, R. J., Geeves, M. A., and Bagshaw, C. R. (2001) Kinetic resolution of a conformational transition and the ATP hydrolysis step using relaxation methods with a Dictyostelium myosin II mutant containing a single tryptophan residue, Biochemistry 40, 12727-12737. 15. Gyimesi, M., Kintses, B., Bodor, A., Perczel, A., Fischer, S., Bagshaw, C. R., and Malnasi-Csizmadia, A. (2008) The mechanism of the reverse recovery step, phosphate release, and actin activation of Dictyostelium myosin II, J. Biol. Chem. 283, 8153-8163. 16. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., and Sellers, J. R. (2004) Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II, J. Biol. Chem. 279, 35557-35563. 17. Takacs, B., Billington, N., Gyimesi, M., Kintses, B., Malnasi-Csizmadia, A., Knight, P. J., and Kovacs, M. (2010) Myosin complexed with ADP and blebbistatin reversibly adopts a conformation resembling the start point of the working stroke, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 107, 6799-6804. 18. Kintses, B., Gyimesi, M., Pearson, D. S., Geeves, M. A., Zeng, W., Bagshaw, C. R., and Malnasi-Csizmadia, A. (2007) Reversible movement of switch 1 loop of myosin determines actin interaction, EMBO J. 26, 265-274. 19. Malnasi-Csizmadia, A., Woolley, R. J., and Bagshaw, C. R. (2000) Resolution of conformational states of Dictyostelium myosin II motor domain using tryptophan (W501) mutants: implications for the open-closed transition identified by crystallography, Biochemistry 39, 16135-16146. 20. Schroder, R. R., Manstein, D. J., Jahn, W., Holden, H., Rayment, I., Holmes, K. C., and Spudich, J. A. (1993) Three-dimensional atomic model of F-actin decorated with Dictyostelium myosin S1, Nature 364, 171-174. 21. Coureux, P. D., Wells, A. L., Menetrey, J., Yengo, C. M., Morris, C. A., Sweeney, H. L., and Houdusse, A. (2003) A structural state of the myosin V motor without bound nucleotide, Nature 425, 419-423. 22. Yang, Y., Gourinath, S., Kovacs, M., Nyitray, L., Reutzel, R., Himmel, D. M., O Neall- Hennessey, E., Reshetnikova, L., Szent-Gyorgyi, A. G., Brown, J. H., and Cohen, C. (2007) Rigor-like structures from muscle myosins reveal key mechanical elements in the transduction pathways of this allosteric motor, Structure. 15, 553-564. 20