Ph. D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI. Kovári Júlia. Okleveles vegyészmérnök. A prokarióta Escherichia coli- és az eukarióta ecetmuslica dutpáz szerkezetének és

Hasonló dokumentumok
Ph. D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI. Varga Balázs DUTPÁZOK SZERKEZET-FUNKCIÓ VIZSGÁLATA A KATALÍTIKUS MECHANIZMUS LEÍRÁSÁRA ÉS INHIBITOROK TESZTELÉSÉRE

Eukarióta dutpázok szerkezet- és funkcióvizsgálata oldatfázisban

Nukleokapszid-dUTPáz, egy retrovirális fehérje szerkezete és funkciója. Tézisfüzet

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben

Kutatási eredményeim a 2014 február 1- augusztus 31. a Varga József Alapítvány Pungor Ernő doktorjelölti ösztöndíjas időszak során

Hemoglobin - myoglobin. Konzultációs e-tananyag Szikla Károly


MedInProt Szinergia IV. program. Szerkezetvizsgáló módszer a rendezetlen fehérjék szerkezetének és kölcsönhatásainak jellemzésére

Elválasztástechnikai és bioinformatikai kutatások. Dr. Harangi János DE, TTK, Biokémiai Tanszék


Több oxigéntartalmú funkciós csoportot tartalmazó vegyületek

[S] v' [I] [1] Kompetitív gátlás

Összefoglalók Kémia BSc 2012/2013 I. félév

DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI. Pécsi Ildikó Okleveles Biológus. Témavezető: Dr. Tóth Judit. Tudományos főmunkatárs

Enzimek. Enzimek! IUBMB: szisztematikus nevek. Enzimek jellemzése! acetilkolin-észteráz! legalább 10 nagyságrend gyorsulás. szubsztrát-specificitás

folsav, (a pteroil-glutaminsav vagy B 10 vitamin) dihidrofolsav tetrahidrofolsav N CH 2 N H H 2 N COOH

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak

Bevezetés a bioinformatikába. Harangi János DE, TEK, TTK Biokémiai Tanszék

3. Sejtalkotó molekulák III. Fehérjék, enzimműködés, fehérjeszintézis (transzkripció, transzláció, poszt szintetikus módosítások)

FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN. Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium. Alkímia Ma, Budapest,

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

transzláció DNS RNS Fehérje A fehérjék jelenléte nélkülözhetetlen minden sejt számára: enzimek, szerkezeti fehérjék, transzportfehérjék

Intelligens molekulákkal a rák ellen

kutatás során legfőbb eredményeinket a szerin proteázok aktiválódásának mechanizmusával és az aktiválódás fiziológiai következményeinek

A fehérjék hierarchikus szerkezete

Az enzimműködés termodinamikai és szerkezeti alapjai

A 3-FOSZFOGLICERÁT KINÁZ ENZIM DOMÉNZÁRÓDÁSÁNAK VIZSGÁLATA: SZERKEZETI ÉS FUNKCIONÁLIS MEGKÖZELÍTÉSEK. dr. Perbiróné Szabó Judit okleveles biológus

3. Sejtalkotó molekulák III.

BME Vegyészés Biomérnöki Kar MTA Enzimológiai Intézet. Genom Metabolizmus és Javítás Laboratórium

ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával.

A fehérjék szerkezeti hierarchiája. Fehérje-szerkezetek! Klasszikus szerkezet-funkció paradigma. szekvencia. funkció. szerkezet! Myoglobin.

Fehérjeszerkezet, és tekeredés

OTKA nyilvántartási szám: F Töltéssel rendelkező oldalláncok szerepe retrovirális proteinázok szubsztrát-specificitásában Az elmúlt évtizedek

A nukleinsavak polimer vegyületek. Mint polimerek, monomerekből épülnek fel, melyeket nukleotidoknak nevezünk.

3.1 A dutpáz kiütés hatása a Mycobacterium életképességére, gyógyszercélpontok kijelölése

TEMATIKA Biokémia és molekuláris biológia IB kurzus (bb5t1301)

Biológiailag aktív molekulák kölcsönhatásvizsgálata NMR-spektroszkópiával

Anaerob fermentált szennyvíziszap jellemzése enzimaktivitás-mérésekkel

A CITOSZKELETÁLIS RENDSZER FUTÓ KINGA

Véralvadásgátló hatású pentaszacharidszulfonsav származék szintézise

Biofizika I

A MITOKONDRIÁLIS CITOKRÓM C POSZTTRANSZLÁCIÓS ÉRÉSE. Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei. Tenger Katalin

AMINOKARBONILEZÉS ALKALMAZÁSA ÚJ SZTERÁNVÁZAS VEGYÜLETEK SZINTÉZISÉBEN

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA

A timidilát bioszintézis és a genomi integritás preventív védelme

A C1 orf 124/Spartan szerepe a DNS-hiba tolerancia útvonalban

Gyógyszerrezisztenciát okozó fehérjék vizsgálata

Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén

A humán tripszinogén 4 expressziója és eloszlási mintázata az emberi agyban

PANNON EGYETEM. 2,3-DIHIDRO-2,2,2-TRIFENIL-FENANTRO-[9,10-d]-1,3,2λ 5 -OXAZAFOSZFOL KIALAKULÁSA ÉS REAKCIÓJA SZÉN-DIOXIDDAL ÉS DIOXIGÉNNEL

Tézisfüzet. Szerző: Nagy Gergely Nándor. Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Enzimatikus foszfátészter hidrolízis mechanizmusának tanulmányozása fehérjekrisztallográfiával

Hogyan lesznek új gyógyszereink? Bevezetés a gyógyszerkutatásba

Mutagenezis és s Karcinogenezis kutatócsoport. Haracska Lajos.

ONKOGÉN K-RAS MUTÁCIÓK: SZERKEZET ALAPÚ ALLÉL SPECIFIKUS INHIBITOR TERVEZÉS. Vértessy G. Beáta MedInProt Konferencia Budapest, április 22.

K68464 OTKA pályázat szakmai zárójelentés

2. Ismert térszerkezetű transzmembrán fehérjék adatbázisa: a PDBTM adatbázis. 3. A transzmembrán fehérje topológiai adatbázis, a TOPDB szerver

Reakciókinetika és katalízis

Fehérje expressziós rendszerek. Gyógyszerészi Biotechnológia

Fluorozott ruténium tartalmú katalizátorok előállítása és alkalmazása transzfer-hidrogénezési reakciókban

VILÁGÍTÓ GYÓGYHATÁSÚ ALKALOIDOK

Norvég Finanszírozási Mechanizmus által támogatott projekt HU-0115/NA/2008-3/ÖP-9 ÚJ TERÁPIÁS CÉLPONTOK AZONOSÍTÁSA GENOMIKAI MÓDSZEREKKEL

Bioinformatika 2 6. előadás

Vezető kutató: Farkas Viktor OTKA azonosító: típus: PD

Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól

Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dutpáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében.

SZAKDOLGOZAT. BÉKÉSI ANGÉLA ELTE TTK V. éves kémia tanár szakos hallgató

Tudományos Diákköri Konferencia. Dobrotka Paula

A DNS-javító dutpáz enzim kölcsönhatása kismolekulás és makromolekulás ligandokkal

Több szubsztrátos enzim-reakciókról beszélve két teljesen különbözõ rekció típust kell megismernünk.

A Ca 2+ szerepe a tormaperoxidáz enzim aktív szerkezetében. Szigeti Krisztián

Receptorok és szignalizációs mechanizmusok

KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA. az NMR spektroszkópia, mint a modern szem. Bodor Andrea

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

VEBI BIOMÉRÖKI MŰVELETEK KÖVETELMÉNYEK. Pécs Miklós: Vebi Biomérnöki műveletek. 1. előadás: Bevezetés és enzimkinetika

VEBI BIOMÉRÖKI MŰVELETEK

A glükóz reszintézise.

Fémionok szerepe az élő szervezetben: a bioszervetlen kémia alapjainak megismerése

(1) A T sejtek aktiválása (2) Az ön reaktív T sejtek toleranciája. α lánc. β lánc. V α. V β. C β. C α.

Nukleinsavak építőkövei

Biokémia laborgyakorlat. 8. sz mérés: Enzimek (enzim aktivitás mérés) Összeállította: Scholz Éva Salgó András Ercsey Klára Szántó Réka

Az enzimreakciók nemarrheniusi viselkedésének térszerkezeti háttere a konformációs flexibilitás szerepe a fehérjék hımérsékleti adaptációjában

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására

A doktori értekezés tézisei. A növényi NRP fehérjék lehetséges szerepe a hiszton defoszforiláció szabályozásában, és a hőstressz válaszban.

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Szénhidrátkémiai kutatások bioinformatikai esetek. Dr. Harangi János DE, TTK, Biokémiai Tanszék

Uracil-DNS degradáló faktor szerkezeti és funkcionális analízise

Bio-nanorendszerek. Vonderviszt Ferenc. Pannon Egyetem Nanotechnológia Tanszék

Diplomamunka (BMEVEMKU999)

Fémorganikus kémia 1

Fehérjeszerkezet analízis. Fehérjeszerkezet analízis. Fehérjeszerkezet analízis. Fehérjeszerkezet analízis. Fehérjeszerkezet analízis

Tel: ;

transzporter fehérjék /ioncsatornák

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer

BIOGÉN ELEMEK Azok a kémiai elemek, amelyek az élőlények számára létfontosságúak

A KAR-2, egy antimitotikus ágens egyedi farmakológiájának atomi és molekuláris alapjai

Zárójelentés. Humán dutpáz: kooperativitás és sejtbeli kölcsönhatások

SZERKEZET ALAPÚ VIRTUÁLIS SZŰRŐVIZSGÁLATOK A GYÓGYSZERKUTATÁS KORAI FÁZISÁBAN

ERD14: egy funkcionálisan rendezetlen dehidrin fehérje szerkezeti és funkcionális jellemzése

Átírás:

Ph. D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Kovári Júlia kleveles vegyészmérnök A prokarióta Escherichia coli- és az eukarióta ecetmuslica dutpáz szerkezetének és működésének összehasonlító vizsgálata Témavezetők: Dr. Vértessy G. Beáta A biológiai tudományok doktora, Tudományos tanácsadó Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézet Dr. Nagy József A kémiai tudományok kandidátusa, Egyetemi docens Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Szerves Kémia és Technológia Tanszék Készült a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjának Enzimológiai Intézetében és a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Karának Szerves Kémia és Technológia Tanszékén 2007.

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK A dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotido-hidroláz (dutpáz) enzim katalizálja a dutp hidrolízisét (1. 1. és 1. 2. ábra). A dutpáz a sejtbeli dutp/dttp arány csökkentésével gátolja az uracil DNS-be épülését. Így többek között - mint megelőző védelem - szerepet játszik a DNS információtartalmának megőrzésében. Enzimműködés hiányában az uracil feldúsul a DNS-ben, aminek hatására a sejtbeli uracil-dns vágó-javító mechanizmusok működésbe lépnek. Mindez ahhoz vezet, hogy a kromoszóma idővel fragmentálódik, és a sejt a programozott sejthalál útjára lép. A dutpáz elengedhetetlen a baktériumok életben maradásához, így antibakteriális ágensek kifejlesztéséhez ideális célpontnak tekinthető. A dutpáznak a DNS metabolizmusban betöltött fontos szerepét tekintve az enzim célpontnak tekinthető rák- illetve vírusellenes gyógyszerek tervezésénél is. 1. 1. ábra A homotrimer FIV (macska-félék immunhiányt kiváltó vírusa) dutpáz:dudp komplex kristályszerkezete (PDB ID: 1F7R) 2

H 2 P P P Mg 2+ HN H N P HN H N + P P Mg 2+ H + + +2 1. 2. ábra A dutp dutpáz által katalizált hidrolízise protonfelszabadulás mellett (ph 7,5-8) dump-t és pirofoszfátot eredményez. A genetikai fejlődés különböző fokán álló dutpázok között fennálló szerkezeti és működésbeli különbségek felderítése hozzásegíthet például a bakteriális enzim célzott gátlásához, ami a humán vagy állatgyógyászatban alkalmazható antibakteriális ágensek kifejlesztését teszi lehetővé. Célom volt, hogy kinetikai, ligandumkötési és röntgenkrisztallogáfiai vizsgálatokkal jellemezzem a dutpázok funkcionális evolúcióját az eukarióta Drosophila melanogaster- és a prokarióta Escherichia coli dutpázokat alapul véve. A dutpáz szubsztrátkötő- és egyben katalitikusan aktív helyének részletes vizsgálata mind szerkezeti, mind funkcionális vonatkozásban jelentős előrelépést jelent a dutpáz működési mechanizmusának felderítésében és dutpáz inhibitorok tervezésében. Két inhibitorjelölt szubsztrátanalógot választottunk Dr. Barabás rsolya röntgenkrisztallográfussal az Escherichia coli dutpáz aktív helyének vizsgálatához: az α,βimido-dutp és az α,β-metilén-dutp molekulákat, melyek a szubsztrát dutp-hez hasonló szerkezetűek. Mindkét inhibitorjelölt esetén az egyetlen különbség az α és β foszforatomot összekötő csoportban van. Az α,β-imido-dutp-ben a természetes szubsztrát oxigénje helyett szereplő imidocsoport feltehetően jelentősen csökkenti e szubsztrátanalóg hidrolizálhatósági fokát. Az α,β-metilén-dutp-ben az oxigén metiléncsoporttal való helyettesítésével - a szénatom oxigénhez és nitrogénhez képest alacsonynak tekinthető elektronegativitása miatt (EN C =2,5<EN N =3,0<EN =3.4) valószínűleg tovább csökkenthető a dutpáz által katalizált 3

hidrolízis sebessége. E két szubsztrátanalógot kettős céllal alkalmaztuk: 1) hogy megállapítsuk róluk, vajon megfelelnek-e mint dutpáz inhibitorok, 2) hogy az aktív hely szubsztrátkötési és működési sajátságaira fényt derítsünk. 4

2. MÓDSZEREK A fehérjéket rekombináns módon BL21 E. coli baktériumokkal termeltettem, így a különböző eredetű dutpázokat nagy tisztaságban (>95%), jó kitermeléssel (10-20 mg/l) állítottam elő. A dutpáz katalitikus aktivitásának vizsgálatára a teljes kinetika követésére szolgáló folyamatos aktivitásmérő módszert alkalmaztam, ami az enzim kinetikai jellemzésére és sebességi együtthatók számítására alkalmas. A mérés során a dutp 1. 2. ábrán szereplő reakcióegyenlet szerinti hidrolízisekor bekövetkező protonfelszabadulást követtem fenolvörös sav/bázis indikátor színváltozásának spektrofotometriás mérésével. Limitált tripszinolízis segítségével információt nyerhetünk a fehérjék szerkezetének felépítéséről, és ezen belül feltérképezhetjük a tripszinnek kitett mozgékony fehérjeszakaszokat oldatfázisban. A kristályszerkezetek nyújtotta adatkészletből a mozgékony fehérjeszakaszok csak korlátozottan azonosíthatóak. Limitált tripszinolízis segítségével megállapítható, hogy melyek azok a mozgékony fehérjeszakaszok, amelyek ligandumkötődés hatására elvesztik flexibilitásukat. Az ecetmuslica dutpáz ligandumok jelen- és távollétében végrehajtott tripszinolízisének reakcióelegyéből különböző időpontokban mintát vettem aktivitásmérésre és Na-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézisre. Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiával információt nyerhetünk a fehérjék szerkezetéről, illetve szerkezetváltozásáról például szubsztrátkötődés hatására. A távoli ultraibolya (UV) tartományban felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, β-szerkezet, rendezetlen láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartományban mért CD spektrumok az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról adnak információt. Ez utóbbi enzim:ligandum disszociációs állandó meghatározását is lehetővé tette. 5

3. EREDMÉNYEK 3. 1. α,β-imido-dutp enzimatikus előállítása 1 2 3. 1. 1. ábra - α,β-imido-dutp (2) enzimatikus előállítása Előállítottam az α,β-imido-dutp-t α,β-imido-dudp-ből (1) és foszfoenolpiruvátból a piruvát kináz által katalizált foszforilálási reakcióval (3. 1. 1. ábra). 3. 2. Az ecetmuslica specifikus C-terminális dutpáz szegmens szerepének in vitro vizsgálata Különböző eredetű dutpázok fehérje-szekvenciáinak összehasonlításakor megfigyelhető, hogy az ecetmuslica enzim szekvenciája a C-terminálison tartalmaz egy 28 aminosav hosszú szakaszt, amely nem szerepel más dutpázok elsődleges szerkezetében (3. 2. 1. ábra). Megvizsgáltam ezen szegmens esetleges in vitro szerepét az enzim szerkezetének kialakulásában és működésében. Limitált tripszinolízis alapján valószínűsítettem, hogy a C-terminális 28 aminosavból álló fehérjeszegmens nem rendezett, és nem vesz részt a fehérje feltekeredésében nukleotid ligandum távol- és jelenlétében sem. 6

In vitro aktivitásméréssel vizsgáltam e C-terminális 28 aminosavnak az enzim aktivitására esetlegesen gyakorolt szabályozó funkcióját. A katalitikus és a Michaelis állandók közel azonosak voltak a teljes hosszúságú és a C-terminális 28 aminosavat nem tartalmazó rekombináns dutpázokra nézve, tehát a konzervált szekvenciamotívumot nem tartalmazó C-terminális 28 aminosav nem befolyásolja a katalitikus aktivitást és az enzim szubsztrátkötési affinitását. Ez utóbbit közeli UV tartományban kivitelezett CD spektroszkópiával is alátámasztottam. 3. 2. 1. ábra - A Drosophila melanogaster dutpáz aminosav-szekvenciája A vastag betűkkel jelölt aminosavak konzerváltak a homotrimer dutpázokban. A konzervált motívumokat római számozással jelöltem. A Drosophila melanogaster dutpázra jellemző C-terminális 28 aminosavat bekereteztem. A tömegspektrometriával azonosított fehérjeszegmenseket aláhúzással jelöltem. 3. 3. Nukleotid ligandum hiányában fellépő Mg(II) kötődés hozzájárul az ecetmuslica dutpáz szerkezetének stabilizálásához CD spektroszkópia segítségével megállapítottam, hogy az ecetmuslica dutpáz szerkezetében található egy olyan hely, amely nukleotid ligandum hiányában konformációs változás kíséretében Mg(II)-ot köt. Feltehetően a Mg(II)-nak a katalitikus aktivitásban betöltött ko-faktor szerepe mellett van egy az ecetmuslica dutpáz szerkezetének kialakulásában illetve stabilizálásában betöltött szerepe is. Pásztázó kalorimetriás mérési adatok alátámasztották ezt a feltételezést. Az Escherichia coli dutpáz esetében nem találtak ehhez hasonló Mg(II) kötőhelyet. 7

3. 4. Az ecetmuslica dutpáz V. konzervált szekvenciamotívumot tartalmazó C- terminális karja rendeződik a dump, a dudp és az α,β-imido-dutp aktív helyre történő kötődésekor Az V. konzervált szekvenciamotívum elején található Arg 148 -Gly 149 közötti triptikus hasítás hatására az enzim elveszítette aktivitását, miközben megőrizte trimer feltekeredését. A 3. 4. 1. ábrán kék színű pálcikamodellel ábrázoltam az Arg 148 -at. Az enzim által katalizált hidrolízis terméke, a dump, a nem hidrolizálható dudp és a szubsztrátanalóg α,β-imidodutp kötődése az eukarióta dutpázhoz jelentős védelmet nyújtott az Arg 148 -Gly 149 közötti triptikus hasítással szemben. Ez a védelem azzal magyarázható, hogy a nukleotid hiányában rendezetlen és hajlékony V. motívumot tartalmazó C-terminális kar mono-, di- vagy trifoszfáttartalmú nukleotid kötődésekor az aktív zsebre zárul, rendeződik, így a tripszin számára ez a hasítási hely nehezen hozzáférhetővé válik. Az Escherichia coli dutpáz esetében az V. motívumot tartalmazó C-terminális kar kizárólag trifoszfát-nukleotid kötődésekor záródik az aktív zseb bejáratára. 8

3. 4. 1. ábra - A humán dutpáz:mg(ii):dupnpp kristályszerkezetében (2HQU) jelöltem a Drosophila melanogaster dutpázra jellemző két triptikus hasítási helyet. A dutpáz alegységeit szalagmodellel ábrázoltam. A központi csatornát felépítő Arg 131 és az aktív helyen levő Arg 148 aminosavakat pálcikamodellel is jelöltem. Az α,β-imido-dutp-t pálcikamodellel, a Mg(II)-okat gömbökkel ábrázoltam. A központi csatornát felépítő Arg 131 és az aktív hely közötti hozzávetőlegesen 17 Å távolságot nyíl szemlélteti. (Az Arg 131 αc és az Arg 148 NH1 között 16,3 Å a távolság a humán dutpáz kristályszerkezete alapján.) Megjegyzés: A kristályszerkezetben ligandumkötődés hatására a három aktív hely közül csupán két aktív hely bejáratára záródott az Arg 148 -at tartalmazó C-terminális kar. 3. 5. A szubsztrátanalóg dudp és α,β-imido-dutp kötődésekor allosztériára utaló változás figyelhető meg az ecetmuslica dutpáz szerkezetében Limitált tripszinolízisből származó fehérjefragmensek tömegspektrometriás elemzése kimutatott egy - a központi csatorna egyik végén elhelyezkedő - tripszinre érzékeny hasítóhelyet (Arg 131 -Ile 132 ), amely az aktív helytől megközelítőleg 17 Å távolságra van, és az aktív zsebben történő dudp illetve dupnpp kötődés hatására védetté válik a triptikus hasítással szemben (3. 4. 1. ábra). Tehát dudp illetve dupnpp kötődés hatására az aktív helytől kiindulva feltehetően allosztérikus konformációváltozás megy végbe, amely során 9

megváltozik a központi csatornabeli Arg 131 -Ile 132 hasítóhely helyzete. Így valószínűsíthető, hogy az aktív helyek a poláros központi csatornán keresztül kommunikálnak egymással. Ennek a kommunikációnak a közvetítésében a szerkezeti Mg(II)-nak is lehet szerepe. A prokarióta Escherichia coli dutpázban az aktív centrumtól, vagyis az V. motívumbeli Arg 141 -Gly 142 triptikus hasítási helytől, eltérő helyen nem találni egyéb tripszinolízisre érzékeny peptidkötést. Kinetikai adatok alapján valószínűsíthető, hogy az Escherichia coli dutpáz aktív helyei nem kooperálnak egymással, vagyis egymástól függetlenül működnek. 3. 6. A nukleofil támadó vízmolekula azonosítása Röntgenkrisztallográfiás szerkezetelemzés segítségével oldatfázisú vizsgálatokkal kiegészítve terveztük az Escherichia coli- és az ecetmuslica dutpázok szubsztrátkötő és egyben aktív helyeinek összehasonlító vizsgálatát is. A prokarióta enzim esetében az oldatfázisú vizsgálatok eredményeivel összhangban homotrimer elrendeződésű enzimkristályszerkezeteket kaptunk. Az ecetmuslica dutpáz is homotrimer feltekeredést mutatott oldatfázisban, azonban az adott kristályosítási körülmények között felnövekedett mérhető kristályokban homodimer szerkezetet alakítottak ki a dutpáz alegységek. Ennek következtében csupán az Escherichia coli dutpáz szubsztrátkötő aktív zsebét elemeztük. Az általam előállított α,β-imido-dutp és AspIIIAsn mutáns Escherichia coli dutpáz komplexének kristályszerkezete és a vad típusú Escherichia coli dutpáz és α,β-imido-dutp komplexének kristályszerkezete alapján Barabás és munkatársai azonosították a dutp hidrolízisében elengedhetetlen szerepet játszó nukleofil támadó vízmolekulát. 10

AspI GlnIV AlaI Monomer B ArgII W cat AspIIIAsn 3.6 A 170 0 LeuIII Monomer A GlyII SerII TyrIII 3. 6. 1. ábra - A vad típusú (fekete, PDB ID: 1RN8) és az AspIIIAsn mutáns (világosszürke, PDB ID: 1RNJ) E. coli dutpáz:α,β-imido-dutp:mg(ii) komplexek szerkezete egymásra illesztve Az egyedüli különbség a két szerkezet között a katalitikus vízmolekula (W cat ) hiánya a mutáns szerkezetből. A Mg(II)-okat nagy gömbökkel, a vizeket kis gömbökkel ábrázoltam. 3. 7. α,β-metilén-dudp előállítása 3. 7. 1. 5 --tozildezoxiuridin előállítása 3 4 3. 7. 1. 1. ábra 5 --tozildezoxiuridin előállítása (4) Előállítottam az 5 --tozildezoxiuridint a 3. 7. 1. 1. ábrán látható reakció szerint. 11

3. 7. 2. α,β-metilén-dudp előállítása 5 --tozildezoxiuridinből HN Ts H N CH 2 [P()(H) 2 ] 2 Et 3 N, CH 3 CN 80 o C, 12 h P H HN P H Et 3 NH+ Et H Et N NH 4 + H P P H 3 NH 4 + HN H N 4 5 3. 7. 2. 1. ábra α,β-metilén-dudp előállítása (5) Előállítottam az α,β-metilén-dudp-t a 3. 7. 2. 1. ábrán látható reakció szerint. 3. 8. Az α,β-metilén-dudp kötődése az Escherichia coli dutpáz aktív zsebében Az α,β-imido-dutp és a dudp a szubsztrátéval azonos konformációt vesz fel az Escherichia coli dutpáz aktív zsebében. E két szubsztrátanalóg a dutp-hez hasonlóan koordinálja a kofaktor Mg(II)-ot, ami a C3 -C4 -C5-5 dihedrális szöget tekintve a hidrolízis lejátszódásához elengedhetetlen gauche konformációban stabilizálja a nukleotidokat. A nem hidrolizálható szubsztrátanalóg α,β-metilén-dudp ellenben trans konformációt mutat ezzel kizárva a Mg(II) aktív helyen való kötődését (3. 8. 1. ábra). Ebből következhet, hogy a vizsgált metilénanalóg kötődési affinitása a dutpázhoz egy nagyságrenddel kisebb, mint a dudp:mg(ii) kötődési affinitása. 12

A B 3. 8. 1. ábra (A) Az α,β-imido-dutp molekulán jelöltem a C3 -C4 -C5-5 atomokat. (B) Az E. coli dutpáz:dudp:mn(ii) (gauche, PDB ID: 2HR6), az E. coli dutpáz:α,β-metilén-dudp (trans, PDB ID: 2HRM), az inaktív mutáns E. coli dutpáz:dutp:mg(ii) (gauche, PDB ID: 1RNJ) és az E. coli dutpáz:α,βimido-dutp:mg(ii) (gauche, PDB ID: 1RN8) komplexek egymásra illesztett szerkezeteinek térbeli ábrázolása. A katalitikus vízmolekulákat csillagokkal, a kétértékű fémeket gömbökkel jelöltem. 13

4. ALKALMAZÁSK A prokarióta (Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis) és az eukarióta (Drosophila melanogaster, Homo sapiens) dutpázok szubsztrátkötő aktív zsebei közel azonosak, ellenben a három azonos alegységből felépülő központi csatornáik eltéréseket mutatnak. A bakteriális enzim központi csatornáját, illetve a dutpáz monomer központi csatorna felépítésében szerepet játszó hidrofób felszínét specifikusan célzó gyógyszermolekulák tervezése például a humán gyógyászatban alkalmazható antibakteriális ágensek kifejlesztését teszik lehetővé. Az α,β-imido-dutp a hidrolizálhatósága, az α,β-metilén-dudp a kis kötődési affinitása miatt nem vált be a dutpáz hatékony inhibitoraként. Ez utóbbit nagy mennyiségben kellene alkalmazni a megfelelő hatás eléréséhez. Inhibitor tervezése nukleotidanalóg alapon kockázatos, mivel jelöltünk nem biztos, hogy in vivo körülmények között kizárólag a dutpáz működését befolyásolja, hanem kötődhet más nukleotidkötő fehérjékhez, és ezáltal mellékhatásokat válthat ki. Emiatt minimális mennyiségű inhibitormolekulát lenne célszerű alkalmazni. A fenti szubsztrátanalógok inhibitornak nem váltak be, ellenben a dutpáz szerkezetének és működésének vizsgálatát előrelendítették. Az imidoanalóg alkalmas a dutpáz:dutp kapcsolat tükrözésére. A metilénanalóg:dutpáz komplex nem ad hiteles képet az enzim:szubsztrát kapcsolatról. Ez az eredmény rávilágít arra, hogy általában is fontos fenntartásokkal kezelni a metilénanalógokat nukleotidkötő enzimek jellemzésekor. 14

5. KÖZLEMÉNYEK 5. 1. A doktori értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Kovári J, Barabás, Takács E, Békési A, Dubrovay Zs, Pongrácz V, Zagyva I, Imre T, Szabó P and Vértessy BG Altered Active Site Flexibility and a Structural Metal-binding Site in Eukaryotic dutpase: KINETIC CHARACTERIZATIN, FLDING, AND CRYSTALLGRAPHIC STUDIES F THE HMTRIMERIC DRSPHILA ENZYME. J Biol Chem 279, 17932-44. (2004) 2. Kovári J, Imre T, Szabó P and Vértessy BG Mechanistic studies of dutpases Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23, 1475-9. (2004) 3. Kovári J, Barabás, Varga B, Békési A, Tölgyesi F, Fidy J, Nagy J, Vértessy BG Methylene substitution at the α-β bridging position within the phosphate chain of dudp profoundly perturbs ligand accommodation into the dutpase active site Proteins, Közlés alatt (2007) 15

4. Kovári J THE PTENTIAL RLE F dutpase INHIBITIN IN CHEMTHERAPY PERIDICA PLYTECHNICA SER. CHEM. ENG. VL. 49, N. 1, PP. 60-61 (2005) 5. Barabás, Pongrácz V, Kovári J, Wilmanns M and Vértessy BG Structural Insights into the Catalytic Mechanism of Phosphate Ester Hydrolysis by dutpase. J Biol Chem 279, 42907-15. (2004) 6. Barabás, Dubrovay Zs, Harmat V, Kovári J, Takács E, Zagyva I, Náray-Szabó G, Vértessy BG Structural studies of Drosophila Melanogaster dutpase Acta Cryst. A58, C96 (2002) 5. 2. A doktori értekezés témájához kapcsolódó előadások 1. Kovari J., Barabas,., Merenyi, G., Zagyva, I., Vértessy, B. G. dutpase mrna silencing triggers apoptosis in cancer cells 31 st FEBS Congress, Molecules in Health & Disease, Isztambul, Törökország, 2006. június 24-29., poszterelőadás 16

2. Kovari J., Barabas,., Merenyi, G., Zagyva, I., Vértessy, B. G. dutpase mrna silencing triggers apoptosis in cancer cells Magyar Biokémia Egyesület Vándorgyűlése, Pécs, 2006. augusztus 30 szeptember 2., poszterelőadás 3. Kovári J, Barabás, Nagy J, Vértessy BG A dutpáz gátlásának potenciális szerepe a rákterápiában 2004. november 24., A PhD hallgatók 2. konferenciája, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki kar, szóbeli előadás 4. Kovári J, Takacs E, Imre T, Szabo P and Vértessy BG Mechanistic studies of dutpases Joint 11 th International and 9 th European Symposium on Purines and Pyrimidines in Man, 2003. június 9-13., Hollandia, Egmond aan Zee, Hotel Zuiderduin, poszter- és szóbeli előadás 5. Kovári J, Békési A, Takács E, Szavicskó I, Pongrácz V, Barabás, Szabó P, Vértessy BG Ecetmuslica dutpáz: Eukarióta modell az enzimműködés evolúciójának tanulmányozására A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának hetedik munkaértekezlete, Keszthely, 2002. május 14-17., poszterelőadás 17

6. Kovári J, Békési A, Barabás, Takács E, Szavicskó I, Szabó P, Vértessy BG Drosophila melanogaster dutpase: a preventive DNA repair factor EACR 17, 17th Meeting of the EURPEAN ASSCIATIN FR CANCER RESEARCH, 8-11 June 2002, GRANADA, poszterelőadás 5. 3. A doktori értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények 1. Békési A, Zagyva I, Hunyadi-Gulyas E, Pongrácz V, Kovári J, Nagy Á, Erdei A, Medzihradszky KF and Vértessy BG Developmental Regulation of dutpase in Drosophila melanogaster. J Biol Chem 279, 22362-70. (2004) 2. Faigl F, Thurner A, Tárkányi G, Kovári J, Mordini A, Tőke L ptical Resolution and Enantioselective Rearrangements of Amino Group Containing xiranyl Ethers Tetrahedron: Asymmetry, 13, 59-68 (2002) 18