A HAP2-sapka és a flagelláris filamentum közötti kölcsönhatás mechanizmusának vizsgálata A doktori értekezés tézisei Készítette: Diószeghy Zoltán Témavezetı: Dr. Závodszky Péter egyetemi tanár az MTA rendes tagja ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Vezetıje: Dr. Erdei Anna akadémikus, egyetemi tanár Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezetı: Dr. Gráf László akadémikus, egyetemi tanár Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézete Budapest 2008
Köszönetnyilvánítás Szakdolgozatom elkészítése kapcsán ezúton szeretném kifejezni köszönetemet: Témavezetımnek, Dr. Závodszky Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai Intézete igazgatójának, aki hozzájárult, hogy az általa vezetett kutatócsoportban dolgozhassam, munkámat irányította és támogatta, és mindig kitartásra biztatott; Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki mind a kutatásokban, mind a dolgozat megírásában rendkívül sokat segített, akinek tapasztalata és hasznos tanácsai mindig átsegítettek a nehézségeken; Dr. Friedrich Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai Intézete volt igazgatójának, aki lehetıvé tette, hogy kutatásaimat az intézetben végezhessem; Dr. Gráf László akadémikusnak, a Szerkezeti Biokémia Doktori Program vezetıjének; Végh Barbarának, Gugolya Zoltánnak és Szenczi Árpádnak a dolgozat elkészítéséhez nyújtott segítségükért; Csoportunk volt és jelenlegi tagjainak, Dr. Kardos Józsefnek, Dr. Svingor Ádámnak, Dr. Gál Péternek, Dr. Dobó Józsefnek, Dr. Lırincz Zsoltnak, Dr. Ambrus-Aikelin Gézának, Dr. Németh Attilának, Kamondi Szilárdnak, Hajdú Istvánnak, akiket mindig zaklathattam kérdéseimmel; Az Enzimológiai Intézet valamennyi munkatársának, aki valamilyen formában a segítségemre volt az elmúlt évek során; Volt és jelenlegi munkahelyi vezetıimnek, amiért türelemmel viselték a doktori eljárás hosszúra nyúlt folyamatát; Végül, de nem utolsó sorban feleségemnek és szüleimnek, amiért folyamatosan biztattak, támogattak és mindenben mellettem álltak.
Bevezetés és célkitőzés A baktériumok egy összetett fehérjekomplexum, a flagellum révén aktív mozgásra képesek. A flagellum két fı része a membránfehérjékbıl álló motor és a membránból messzire, akár 15 µm-re is kinyúló helikális filamentum. A motort a belsı sejtmembránon átáramló protonok hajtják, az átlagos forgási sebesség 15-20 ezer fordulat/perc. A forgás 20-30 µm/sec-os úszási sebességet biztosít oly módon, hogy a filamentumok csokorba állnak össze egy balmenetes szuperhélixet alkotva, és így hajtják elıre propellerként a sejtet. A forgó mozgást egy membránba ágyazott, több különbözı fehérjébıl összeálló makromolekuláris struktúra, a bazális test hozza létre. Az itt létrejövı forgást egy különleges szerkezeti egység, a kampó viszi át a filamentumra. A kampó egyúttal kardáncsuklóként a forgás tengelyét is képes megváltoztatni. A szuperhelikális szerkezető flagelláris filamentumot a flagellin nevő fehérje több tízezer példánya építi fel. A filamentum külsı átmérıje 230 Å, közepén egy 20 Å átmérıjő csatorna húzódik. 11 flagellin alegység alkot két menetet a helikális szerkezetben, azaz menetenként 5.5 alegység van. A filamentumnak két figyelemre méltó tulajdonsága van: az önszervezıdı képesség és a polimorfizmus. Az elsı sajátosság azt jelenti, hogy a flagellin alegységek megfelelı külsı körülmények hatására képesek a polimerizációra, azaz a szuperhelikális szerkezet létrehozására. A második, a polimorfizmus azt takarja, hogy a filamentum külsı megjelenése többféle is lehet: bizonyos külsı körülmények megváltozása illetve a motor forgásirányának megfordulása esetén módosítja a formáját. A filamentum végén egy molekuláris sapka található, amit öt darab HAP2 (FliD) fehérje épít fel. A sapka a flagellin molekulák in vivo polimerizációjához szükséges, hiányában a sejten nem képzıdik filamentum (a felépülés megáll a kampónál), a citoplazmából a filamentumok belsejében lévı csatornán át transzportálódó flagellin alegységek nem épülnek be a filamentum végére, hanem monomer formában az extracelluláris térbe ürülnek. Eszerint a sapka szerepe egyrészt a flagellin kijutásának a megakadályozása, másrészt a polimerizáció elısegítése. Ez okozza azt a furcsa kettısséget, hogy a HAP2 nagyon erısen kapcsolódik a filamentum végéhez, és gyakorlatilag sohasem válik le onnan, ezáltal megakadályozza a flagellin molekulák kiürülését az extracelluláris térbe, viszont mégis elég laza a kötıdés ahhoz, hogy az újonnan érkezı flagellin alegységek képesek legyenek a sapka és a filamentum vége közé ékelıdni. A HAP2 erıs kötıdése miatt ugyanakkor a sapkával ellátott filamentumhoz laboratóriumi körülmények között nem lehet 1
további flagellin molekulákat hozzáadni. In vitro kétféle módszer létezik a filamentum monomerekbıl történı létrehozására: ammónium-szulfát, illetve rövid filamentum kezdemények (magok) hozzáadása. A filamentumot felépítı (axiális) fehérjék közös szerkezeti motívumokkal: konzerválódott terminális régiókkal és változékony középsı szakasszal rendelkeznek. Az elıbbiek konzervatív jellege fontosságukra utal: a polimerizáció szabályozásában, az alegységek közötti kölcsönhatásokban, a flagellum specifikus fehérjeexportban egyaránt szerepet játszanak. A terminális régiók monomer formában rendezetlen szerkezetőek, szemben a rendezett struktúrájú, kompakt középsı szakasszal. Ugyanakkor bár harmadlagosan rendezetlen a szerkezetük, de tartalmaznak dinamikusan változó fel- /letekeredı másodlagos helikális struktúrákat, amelyek polimerizálódva, azaz a filamentumban rendezıdnek, stabil harmadlagos szerkezetet vesznek fel. Ezt az is megerısíti, hogy a terminális régiókban hidrofób aminosavakból álló héttagú ismétlıdések találhatók, ami az α-helikális kötegekbe rendezıdı szekvenciák sajátossága. Korábban azt feltételezték, hogy a szomszédos alegységek terminális régiói alkotják a helikális kötegeket a polimerizáció során, stabilizálva ezáltal a filamentumot. Az újabb eredmények azonban megkérdıjelezték ezt a modellt, és inkább az alegységen belüli helikális kötegek lehetıségét valószínősítették, amelyeket az alegységek közötti egyéb hidrofób kölcsönhatások stabilizálnak. A teljes bakteriális flagellum bonyolult makromolekuláris struktúra, amelynek egyszerre csak egyes részei tanulmányozhatóak megfelelı alapossággal. Vizsgálataink ennek megfelelıen a flagelláris filamentum felépülésére, a filamentum stabilitására, illetve a HAP2 sapka ebben játszott szerepének felderítésére korlátozódtak. Kísérleteink során konkrét céljaink a következık voltak: A rendezetlen terminális régiók szerepének tisztázása a filamentum felépülésében. A fı célkitőzés a kölcsönhatásban résztvevı csoportok pontos felderítése volt festett flagellin monomerek terminális csonkítás utáni polimerizációjával. A flagelláris filamentum stabilitásának, illetve a HAP2 stabilizáló képességének pontosabb jellemzése a következı munkaterv alapján: A natív filamentum stabilitásának vizsgálata különös tekintettel a HAP2 sapka esetleges stabilizáló hatására. A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 nélkül különféle rekonstruálási módszerek és körülmények alkalmazása esetén. 2
Megfelelı módszer kidolgozása a HAP2 rekonstruált filamentumokhoz történı kötıdésének detektálására. A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 kötıdése után. Ezen belül különféle inkubálási technikák alkalmazásával a filamentum végére bekötıdött HAP2 molekulák mennyiségének változtatása, és a stabilizációs különbségek mikrokaloriméter, illetve spektropolariméter segítségével történı detektálása. A kapott eredmények felhasználásával egy olyan eljárás kidolgozása, melynek segítségével intakt sapkával ellátott filamentumok hozhatók létre. Ennek fontossága abban rejlik, hogy így lényegében az in vivo létrejövı filamentumokat lehet tanulmányozni, azaz a baktériumokban ténylegesen fennálló kölcsönhatások vizsgálhatók. Alkalmazott módszerek A felhasznált fehérjék expresszióját és tisztítását apróbb eltérésektıl eltekintve az irodalmi hivatkozásokban szereplı módon hajtottuk végre. A monomer flagellineket ammónium-szulfát, illetve rövid filamentumkezdemények (magok) segítségével polimerizáltattuk, a HAP2 sapka rekonstrukcióját különféle körülmények közötti inkubálással oldottuk meg. A filamentumok képzıdését és a HAP2 kötıdését sötét látóterő mikroszkópiával ellenıriztük. A natív sapkával rendelkezı, illetve terminálisan csonkított filamentumokat különféle enzimeket (ELC, V8, tripszin) felhasználó emésztési protokollok segítségével állítottuk elı. A festési vizsgálatokhoz a ciszteint tartalmazó flagellineket klasszikus irányított mutagenezissel gyártottuk le, a kölcsönhatásokat pedig fluoreszcencia spektroszkópiával követtük. A HAP2 szerepét a filamentum stabilitásában spektropolarimetria (CD) és mikrokalorimetria (DSC) segítségével vizsgáltuk. 3
Eredmények és következtetések A flagelláris filamentumokra és az azokat lezáró molekuláris sapkára irányuló vizsgálataink fontosabb megállapításai, illetve az új tudományos eredmények a következık: 1. A flagellin rendezetlen terminális régióinak szerepét a filamentum felépülésében fluoreszcencia spektroszkópiával tanulmányoztuk. A kiválasztott tiol-reaktív festékek ciszteinhez tudtak kötıdni, azonban a S. typhimuriumból származó flagellin aminosav szekvenciája egyetlen ciszteint sem tartalmaz. A kísérletek elsı lépéseként ezért irányított mutagenezis segítségével elkészítettünk két flagellin pontmutánst (S356C, G377C), melyek a vad típussal ellentétben ciszteint is tartalmaztak. A mutáns fehérjék alkalmasak voltak filamentumok létrehozására, azaz megırizték polimerizációs képességüket. 2. Fluoreszcencia mérési eredményeink alátámasztják a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli összefonódó helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét. A mérések során a filamentumba beépülı flagellin alegységek közötti fluoreszcencia rezonancia energia transzfert (FRET) követtük. A FRET jelenségét az egyik flagellin pontmutáns (S356C) különbözı fluoreszcens festékekkel történı jelölése révén sikerült a létrehozni. A festett flagellin monomerek terminális csonkítás utáni polimerizációjának spektrofluorimetriás vizsgálata alapján megállapítható, hogy a C-terminális α-hélix hiányában az összefonódó helikális kötegek nem tudnak kialakulni, ami az alegységek közötti hidrofób kölcsönhatásokat is lehetetlenné teszi. A filamentumot stabilizáló kölcsönhatások nélkül viszont nem tudnak új alegységek beépülni, ami a polimerizációs képesség teljes elvesztését eredményezi. Ezzel szemben az N-terminális α-hélix részleges hiánya mellett a helikális kötegek feltehetıen részben ki tudnak alakulni. Ezek a fragmentumok hozzákötıdtek a filamentumok végéhez, ami arra utal, hogy a tökéletlen helikális kötegek is képesek elegendı stabilizáló hidrofób kölcsönhatás létrehozására a már felépült filamentummal. Ugyanakkor a további polimerizáció hiányából arra következtethetünk, hogy a tökéletlen helikális kötegek egymással már nem tudnak megfelelı hidrofób kapcsolatokat alkotni. Összességében 4
elmondható, hogy eredményeink alátámasztják a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli összefonódó helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét. 3. A HAP2 sapka jelentısen (mintegy 4 C-kal) emeli a natív filamentumok denaturációs hımérsékletét, illetve növeli a hıindukált depolimerizációval szembeni ellenálló képességüket is. A flagelláris filamentumok polimerizációja, illetve depolimerizációja csak a filamentumok távolabbi végén megy végbe. A monomer flagellin denaturációs hımérséklete (47 C) fölött a filamentum depolimerizációja visszafordíthatatlan. A HAP2 sapka stabilizáló hatása arra utal, hogy a filamentumok hımérséklet okozta megsemmisülése depolimerizációval kezdıdik, amit az alegységek legombolyodása követ. Míg a HAP2 sapkával való kölcsönhatás a filamentumok stabilizálódását eredményezi, addig ez a stabilizáló hatás aszimmetrikus: a natív filamentum-hap2 komplexum ugyanazon a hımérsékleten (61 C) gombolyodik le, ahol a HAP2 hıdenaturációja megtörténik. Vagyis a HAP2 denaturációja az a lépés, ami a natív filamentum-sapka szerkezetek széteséséhez és denaturációjához vezet. 4. A HAP2 sapka stabilizáló hatására alapozva kifejlesztettünk egy eljárást, melynek segítségével az intakt HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumok hatékonyan elválaszthatók és megtisztíthatók. A módszer lényege a natív filamentum minták hosszas inkubálása 45 C-on tripszin jelenlétében. A kapott natív filamentum-sapka komplexumok erısen ellenálltak a proteolítikus lebontásnak és a depolimerizációnak. Ezek a minták elısegíthetik a filamentum-hap2 komplexumok egyrészecskés elektronmikroszkópiás szerkezetanalízissel történı tanulmányozását. 5. A filamentum létrehozásának körülményei (a filamentumkezdemények, illetve az ammónium-szulfát aránya) szintén jelentıs mértékben befolyásolják a filamentum stabilitását. A magasabb precipitálószer koncentráció egyrészt megnöveli a polimerizáció sebességét, ami 5
emeli a szerkezeti hibák számát, csökkentve ezáltal a filamentum stabilitását. Másrészt az ammónium-szulfát, illetve a filamentumkezdemények nagyobb koncentrációja egyszerre több helyen indítja be a polimerizációt, ami rövidebb filamentumokat eredményez. Egy rövidebb filamentumokat tartalmazó minta ugyanakkor várhatóan magasabb depolimerizációs sebességet mutat, mivel ilyenkor magasabb a szabad végek száma, azaz a depolimerizáció is egyszerre több helyen történik. A gyorsabb depolimerizáció következtében pedig alacsonyabb denaturációs hımérsékletet tapasztalunk. 6. A HAP2 kötıdés sötét látóterő mikroszkóppal történı detektálására kidolgoztunk egy módszert, melynek lényege az, hogy csak azokra a filamentumkezdeményekre fognak további flagellin alegységek ráépülni, melyek végén nem található HAP2, vagyis csak ekkor növekszik látható méretővé a filamentum a mikroszkóp alatt. Ez praktikus, kevés felszerelést igénylı módszer, ráadásul rendkívül érzékeny, mivel a filamentumkezdemények egészen alacsony koncentrációjánál megindul a polimerizáció, viszont már egy-két HAP2 alegység is tökéletesen meggátolja azt. 7. A rekonstruált filamentum stabilitása megnı a HAP2 kötıdésével, ami egyrészt a denaturációs hımérséklet megemelkedésében, másrészt a depolimerizációval szembeni ellenállás megnövekedésében mutatkozik meg. A stabilizáció növekedésének mértéke szabályozható az inkubálási feltételek megváltoztatásával. A HAP2 ugyan könnyen kötıdött a rekonstruált filamentumok végéhez, azonban a kapott filamentum-hap2 komplexumok egyik esetben sem érték el a natív szerkezetek stabilitását, és megemelt hımérsékleteken gyors depolimerizáción mentek keresztül. Az eltérés magyarázata valószínőleg az, hogy az in vitro növesztett filamentumok vége eltér az in vivo filamentumokétól. A filamentum vége még natív esetben sem teljesen sík felület, emiatt a sík HAP2 sapka alegységei eltérı erıséggel, illetve eltérı konformációban vesznek részt a filamentum végével való kölcsönhatásban. A filamentum in vivo felépülése a HAP2 sapka szabályozó hatásának köszönhetıen az egymenetes hélix mentén történik, azonban a filamentumot 6
stabilizáló kölcsönhatások az 5-, 6-, 11- és 16-menetes hélix mentén szomszédos alegységek között állnak fenn. Ez viszont azt jelenti, hogy az in vitro rekonstrukció során a felépülés valószínőleg nem az egymenetes hélix mentén történik, hiszen a megfelelı stabilizáló kölcsönhatások megléte esetén (azaz ha az 5-, 6-, 11- és 16-menetes hélix mentén egyaránt vannak szomszédos alegységek) be tud épülni egy új monomer. Emiatt a filamentum végén nagy valószínőséggel egy bonyolult, nagyobb kiugrásokkal és bemélyedésekkel tarkított struktúra jön létre. Az egyenetlen végekre viszont nem tud intakt, öt alegységbıl álló HAP2 sapka ráépülni, mint az in vivo filamentumoknál, hanem csak pár HAP2 alegység fog megkötıdni. A kapcsolódó HAP2 alegységek száma ugyanakkor az inkubálási körülmények módosításával befolyásolható, ami a filamentum eltérı stabilitásához vezet: minél több HAP2 molekula kötıdik, annál stabilabb a filamentum. 8. A rekonstruált filamentumok HAP2 hozzáadása után kevésbé voltak stabilak, mint a sapkával lezárt natív filamentumok. Habár a rekonstruált filamentum-hap2 komplexumok alakjukat tekintve nagyon hasonlítanak a HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumokhoz, szerkezeti hibákat tartalmaznak, melyek csökkentik a stabilitásukat. Ennek köszönhetıen magasabb hımérsékleten gyorsan depolimerizálódtak, és a proteolítikus emésztéssel szemben is érzékenyebbek voltak. Mindez arra utal, hogy laboratóriumi körülmények között csak kivételesen keletkezik intakt sapka, az esetek többségében ötnél kevesebb HAP2 molekula kötıdik be a filamentum végére. Ugyanakkor a tökéletes sapkával rendelkezı natív filamentumok izolálására általunk kifejlesztett eljárás megnyithatja az utat a pontosabb szerkezeti információk megszerzése elıtt. Publikációk A dolgozat alapjául szolgáló közlemények Nemzetközi folyóiratokban megjelent közlemények: Diószeghy Z., Závodszky P., Namba K., Vonderviszt F. (2004). Stabilization of flagellar filaments by HAP2 capping. FEBS Lett. 568, 105-109. 7
Gugolya Z., Muskotál A., Sebestyén A., Diószeghy Z., Vonderviszt F. (2003). Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Lett. 535, 66-70. Nemzetközi konferenciákon szereplı poszterek: Vonderviszt F., Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIVth INTERNATIONAL BIOPHYSICS CONGRESS. Buenos Aires, Argentína, 2002. április 27.- május 1. Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. KEIHANNA INTERNATIONAL CONFERENCE ON MOLECULAR BIOPHYSICS. Kyoto, Japán, 2002. szeptember 19-21. Hazai konferenciákon szereplı poszterek: Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.: A HAP2 sapka szerepe a flagelláris filamentumok szerkezetének stabilizálásában. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 5. MUNKAÉRTEKEZLETE. Sopron, 2000. május 8-11. Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 7. MUNKAÉRTEKEZLETE. Keszthely, 2002. május 14-17. Egyéb közlemények Nemzetközi folyóiratban megjelent absztrakt: Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F. (2005): The FliH component of the flagellarexport apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS CONGRESS AND 9th IUBMB CONFERENCE. Budapest, Magyarország, 2005. július 2-7. FEBS Journal 272, 347. 8
Hazai konferenciákon szereplı poszterek: Vonderviszt F., Jakab G., Diószeghy Z., Gugolya Z., Závodszky P.: A FliH fehérje szerepe a flagellum-specifikus exportapparátus mőködésében. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 8. MUNKAÉRTEKEZLETE. Tihany, 2003. május 12-15. Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Muskotál A., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.: A flagellum-specifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkezı multi-cink fehérje. MBFT XXII. KONGRESSZUSA. Debrecen, 2005. június 26-29. 9