Az ioncsatorna fehérjék szerkezete, működése és szabályozása. A patch-clamp technika Panyi György 2014. November 12.
Mesterséges membránok ionok számára átjárhatatlanok
Iontranszport a membránon keresztül: transzport fehérjékre van szükség! extracelluláris citoszolikus zárt nyitott ATP ADP+P i ATP-függő pumpa ioncsatorna transzporter 10 0-10 3 ion/s 10 7-10 8 ion/s 10 2-10 4 ion/s
Nettó töltés átjutása a membránon ÁRAM Két csatorna szimultán nyitása Membránpotenciál nyitott zárt Az egyedi ioncsatorna áramok néhány pa (10-12 A) nagyságrendűek Az egyedi ioncsatorna vezetőképesség (G=I/U) nagyságrendje néhányszor 10 ps (10-12 S, S:Siemens)
Az ioncsatornák integráns (transzembrán) fehérjék
Nobel Díj, Kémia, 2003 Roderick MacKinnon for structural and mechanistic studies of ion channels Crystal structure of the voltage gated potassium channel, S5-S6 Peter Agre, for the discovery of water channels
Az ioncsatorna egyszerűsített működési modellje: a membránon keresztül érő hidrofil pórus hajtóerő + nyitott kapu ionáram
Az elektrokémiai gradiens és a vezetőképesség határozza meg az ionáram nagyságát és irányát egyensúly esetén nincs nettó áram [K + ] o =5 mm E m =E K I = G (E m E K )= 0 E m [K + ] i =140 mm + RT [K ] i EK = ln = 89 mv + zf [K ] T= 37 o C, z=1 I = G(E m E K )= 0 o E m E K I = G(E m E K ) 0 E m <E K I<0, sejtbe irányuló K + áram E m >E K I>0, sejtből kifelé folyó K + áram
Az ioncsatornák osztályozása Kapuzás szerint megfelelő inger hatására bekövetkező konformáció változás a fehérjében, mely a csatornák különböző állapotaihoz vezet (pl. zárt, nyitott, inaktivált állapotok). Szelektivitás alapján csak bizonyos fajta ion (vagy ionok) számára átjárható a pórus (pl. nagy szelektivitású, kis szelektivitású, és nem szelektív csatornák).
Kapuzás I. A csatornák felosztása a nem vezető (zárt) és vezető (nyitott) állapot közötti átmenetet kiváltó inger alapján: feszültség kapuzott a membránpotenciál megváltozása (pl. idegsejtek depolarizáció aktiválta K + és Na + csatornái). ligand kapuzott a ligand bekötődése az extracelluláris oldalon (p.l ideg-izom kapcsolatban az acetikolin receptor). i.c hírvivő molekula által kapuzott a ligand bekötődése az intracelluláris oldalon (pl a Ca 2+ aktiválta K + csatorna). membrán feszülés által kapuzott ( stretch gated ) a membrán feszülése (pl. limfociták térfogatszabályzásában Cl csatornák nyitása).
Kapuzás II. Az ioncsatornák lehetséges kapuzási állapotai: -funkcionális állapotok (vezető, nem-vezető) -szerkezeti állapotok (pl. zárt, nyitott, inaktivált) E m Ny (O) /vezető Z (C) /nem-vezető I /nem-vezető O C +50 mv -120 mv 0.5 pa 100 ms I
A feszültség kapuzott ioncsatornák főbb szerkezeti elemei extracelluláris pórust alkotó S5-S6 hurok α α K + α citoszolikus feszültség érzékelő α NH 2 Feszültség érzékelő domén: a membránpotenciál változás érzékelése pórust kialakító domén: konduktancia pórust alkotó S5-S6 hurok négy alegység együtt alkot egy funkcionáló csatornát szelektivitási szűrő: a csatorna ion szelektivitásáért felelős extracelluláris S4 S6 S6 S4 citoszolikus S4-S5 kapcsoló kapu
Kapuzás III. A feszültség szenzor azonosítása feszültség szenzor egy pozitív töltéssel kevesebbet tartalmazó feszültség szenzor Nyitási valószínűség open probability 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 WT R368Q -100-50 0 50 100 test potential (mv) Membrán potenciál (mv)
Kapuzás IV. az inaktivációért felelős domain azonosítása a.) vad típusú K + csatorna Current Wild-type Deletion mutant Δ6-46 b.) mutáns K + csatorna Current Zagotta et al. 1990
Az ioncsatornák osztályozása szelektivitás alapján Nagy szelektivitású csatornák, négy alegység: K +, Na +, Ca 2+, Cl - Kis szelektivitású csatornák, öt alegység: Acetilkolin receptor, csak kationokra specifikus Nem szelektív csatornák: Gap junction csatorna (hat alegység)
A szelektivitást biztosító mechanizmusok Szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok 20Å K + K + K + pórus üreg méret alapján: ami nem fér be a pórusba az nem megy át a csatornán töltés alapján: a nem megfelelő töltésű ion nem mehet át specifikus kölcsönhatások alapján: a megfelelő méretű és töltésű ionok közötti válogatás
Töltés alapján szelektál a nikotinerg acetilkolin receptor (ligand kapuzott ion csatorna) pórus filter acetilkolin kötőhely extracell. plazmamembrán citoszolikus kapu
Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között I. röntgen krisztallográfiás kép a pórusról Szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok K + K + K + pórus üreg szelektivitási filter (GYGD) a pórusban tartózkodó ionok
Specifikus kölcsönhatások a pórus és az ionok között II. A vízburok helyettesítése a szelektivitási szűrőben K + : 1.33 Å Na + : 0.95 Å szelektivitási szűrő kálium ion pórus hurok H hyd = 322 kj/mol H hyd = 406 kj/mol K + K + ion a szelektivitási szűrőben K + Na + K + pórus üreg ion vizes közegben K + Na +
Hogyan tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérésével a patch-clamp technika alkalmazásával R f I p - + V ki E m I m V tart áram (pa) 600 400 200 0 +30 mv aktiváció -80 mv +30 mv -10 mv -50 mv inaktiváció -40 mv 0 200 400 600 800 1000 idő (ms)
cell attached patch whole cell vákuum húzás outside out patch
Patch pipetta a sejten ill. EM kép hőpolírozást követően Sakmann, Nobel lecture, 1992, Neuron 8:613-629.
Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál E m = RT p K[K] i + p Na[Na] i + p Cl[Cl] o ln Fz p [K] + p [Na] + p [Cl] K o Na o Cl i extracell. citoszolikus K + Na + Cl
Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál akciós potenciál Membránpotenciál (mv) +50 felszálló szár: depolarizáció 0 70 küszöb leszálló szár: repolarizáció Küszöb alatti ingerek utó hiperpolarizáció Vezetőképesség [mmho/(cm 2 )] Na + permeábilitás K + permeábilitás Idő (ms)
Az ioncsatornák főbb funkciói Membránpotenciál kialakítása és szabályozása nyugalmi potenciál akciós potenciál E m RT p K[K] i + p Na[Na] i + p Cl[Cl] o = ln Fz p [K] + p [Na] + p [Cl] extracell. K o Na o Cl i Intracelluáris ionkoncentráció változások kialakítása [Ca 2+ ] i emelkedés Az idegvégződés depolarizációjakor a feszültség-kapuzott Ca 2+ csatorna (1) kinyílik, Ca2+ influx szinaptikus vezikula szekréció (2). citoszolikus A. 1 K + Na + Cl 2 Idegsejt akciós potenciál 3 4 5 Izomsejt Szarkoplazmatikus retikulum
Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 1, pórus blokkolók e.c. gátlás i.c. gátlás
Az ioncsatornák gyógyszerek támadáspontjai 2, kapuzást módosító molekulák e.c. gátlás i.c.