JELZÉSI TECHNIKÁK AUTORADIOGRÁFIA FEHÉRJÉK JELZÉSEI Izotópok alkalmazása az orvostudományban kutatás diagnosztika terápia Dr. Márián Teréz NUKLEÁRIS MEDICINA INTÉZET DEOEC anyagcsere folyamatok sejtosztódás nyomjelzés térfogatmérés koncentráció mérés biokémiai folyamatok Gyógyszerkutatás anyagcsere folyamatok tumor diagnosztika izotópeloszlás térkép kétdimenziós térkép háromdimenziós térkép funkcionális vizsgálatok sugárterápia radionuklid terápia 2 Az autoradiográfia nagy múltú technika Niepce St. Victor in 1867 ban mutatta ki, hogy az uránium só feketedést okoz az ezűst klorid/bromid sót tartalmazó emulzión. 3 4 1904 E.H. London készítette az első makro autoradiográfiát, ahol egy békát rádium izotóppal jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából jött leképezte egy filmre. Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhető Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával. Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze. 5 6 Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezetben, szervekben, sejthalmazon, sőt egyes sejteken belüli lokalozációja meghatározható Gyógyszerkutatás Élettani folyamatok nyomon követése Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió, membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitest jelölésekkel stb) Kémiai analitikai módszerek Mikro-autoradiográfia: izotóppal jelölt néhány mikronos vékony metszet (pl. tumoros szövet, specifikus izotópos antitesttel jelölve). Parafinba ágyazott fixált minták, fagyasztott minták (metszetek) Detektálás: filmmel Értékelés: fénymikroszkóp, elektronmikroszkóp Makroautoradiográfia: nagyméretű mintákat értékelünk. Planáris minták (röntgen film). Feldolgozás után szabad szemmel is látható Egésztest autoradiográfia: egér, patkány, nyúl stb. egész testéről készített fagyasztott metszetek (szeletek) 7 8
Izotóp injektálása Állatok előkészítése a metszésre A beágyazó anyag előkészítése Beágyazás Metszés Előmetszés Metszés Autoradiográfia A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás) A szeletek előkészítése a detektáláshoz A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával. Kiértékékelés 9 10 CMC=carboxi-metil-cellulóz LEICA CM 3600 cryomacrotom 11 12 Tumordiagnosztika, terápia hatékonyságának kimutatása állatkísérletekben Patkány modell 18 FDG Megelőző Orvostani Intézet TTK Molekuláris Biológiai Intézet 13 14 A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával AgBr kristály Zselatin AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására Radioactív halmozás Minta (metszet) 15 A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökődik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik. 16
A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával Előhívás Látens kép kialakítása Ag + + e - = Ag folyamatban keletkező Ag atomok a látens kép prekurzorai Instabil állapot Az előhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak. AgBr----Ag Látens kép ----- ezüst szemcse Előhívás ------ itt jelenik meg gyorsabban a látható kép Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 o C-on végezzük A látens kép láthatóvá tétele 17 18 Fixálás Autoradiogram Az előhívott kép rögzítése: Az előhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdőben eltávolítjuk Mosás: sók eltávolítása a zselatinból 19 20 Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen A felbontóképesség függ: az izotóp energiájától a minta rétegvastagságától a fotoemulzió rétegvastagságától a minta és a film közötti vastagságtól az expoziciós és előhívási időtől stb. 21 22 Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm 2 ) létrehozott Ag szemcsék száma Optimalizálás Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással Preflash elővilágítási technika A radioaktivitás mértékegységei Aktivitás (bomlás/másodperc) [Bq] Becquerel SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másodperc [Ci] Curie 1gram tiszta 226 Ra aktivitása 1Curie=3,7x10 10 Bq 10mCi=400MBq 1MBq= 27uCi 37MBq=1mCi 23 24
Aminósavak Fehérjék jelzési módszerei Az élő szervezett legelterjedtebb makromolekulái a fehérjék. A fehérjék nagy molekulatömegű, aminosavakból peptidkötésekkel felépített makromolekulák, a sejtek szerves anyag állományának jelentős részét képezik. A fehérjék aminosavakból peptidkötésekkel -CO-NHépülnek fel. 25 26 27 28 Fehérjék jelölése Izotópjelölés: szerkezetvizsgálat, funkcióvizsgálat, kimutatásuk, lokalizálásuk, kvantitatív meghatározásuk, Fehérjeszintézis in vivo mérése, tumordiagnosztika, terápia, receptorrendszer vizsgálata, peptidek, hormonok, antitestet jelölése stb. Kutatás, diagnosztika, terápia Jelzéseknél kérdés: Mi a jelző atom? Hol történik a jelzés a fehérjén? Melyek a kémiailag, biológiailag aktív csoportok a fehérjében az adott vizsgálatnál? 29 30 31 32 A fehérjék izotóppal történő jelöléseknél kívánalmak - a jelölés nagy érzékenységet biztosítson (nagy fajlagos aktivitás) - detektálási lehetőség biztosítva legyen - a használt radionuklid felezési ideje optimális legyen - a jelzés stabilitása megfelelő legyen - a jelzés során a biológiai aktivitás ne károsodjon Melyik funkcionális csoportot kívánjuk jelölni, hogy a kémiai, biológiai, immunológia stb. tulajdonságaik ne változzanak meg?????
Jelzett funkcionális csoport szerinti jelölések: Tirozin- 125 I Tirozin csoportok jódozása ( 125 I, 131 I) NaI-ból oxidálószer segítségével reaktív I + (H2O) oxidált jód gyök állítható elő, amivel a fehérjék, peptidek tirozin csoportjai jelölhetők. Amino-csoport- 14 C, 3 H SH csoport- 14 C, 3 H Komplexképző fémionok: 99m Tc, 111 In (antitestek) Peptidek, aminosavak jelölése PET izotópokkal 33 Oxidálószerek: Chloramin T- fehérjék denaturálódhatnak Iodogén- lassúbb reakcióidő, kontrolálható Enzimatikus jódozás: legkíméletesebb (H 2 O 2 jelenlétében, laktoperoxidáz enzim) A be nem épült jódtól redukálással szabadulunk meg, tisztítás, gélszűrés, HPLC. Jódozással megváltozhat a fehérje molekula biológiai aktivitása H 3 N + C O O - 34 C C H 2 O H H 35 36 kaliumborohidrid 3-(p-Hydroxyphenyl)-propionicsav-N-hydroxysuccinimidyl észter 37 38 High-grade tumor FDG METIONIN 39 40
Low-grade tumor FDG METIONIN 41