Izotópok alkalmazása az orvostudományban

Átírás

1 Kísérleti állatok radioizotópos leképezése Izotópok a az orvostudományban kutatás diagnosztika terápia Dr. Márián Teréz NUKLÁRIS MDICINA INTÉZT DOC anyagcsere folyamatok sejtosztódás nyomjelzés térfogatmérés koncentráció mérés biokémiai folyamatok gyógyszerkutatás funkcionális vizsgálatok anyagcsere folyamatok tumor diagnosztika izotópeloszlás térkép kétdimenziós térkép háromdimenziós térkép sugárterápia radionuklid terápia Új izotóppal jelzett ligandok biológiai tesztelése Gyógyszerkutatás Orvostudomány Állatkísérletek: In vitro: receptor kötıdési vizsgálatok x vivo: szervi megoszlásos vizsgálatok autoradiográfia In vivo: Funkcionális:PT, Mini-PT, SPCT, Anatómiai: CT, MRI 3 4 Az állatkísérlet végzésének törvényi feltételei Hol? a létesítményt a hatóságnak (területi Állategészségügyi Állomás) nyilvántartásba kell vennie (állatok tartása és gondozása, állatházi viszonyok, személyzet, berendezések, stb.) Miért? a kutatási tevékenységet (projektet) engedélyeztetni kell a hatósággal (célja, indoka, tudományos alapjai, módszertana) Hogyan? a kísérleti eljárásokat a MÁB-nak jóvá kell hagynia (mint elıbb, csak részletesebben, állatok faja és száma; fájdalom, szenvedés, tartós nélkülözés és károsodás értékelése; ezek megszüntetésére vagy minimalizálására tett intézkedések; a kísérlet idıtartama; stb.) Ki? a kísérletet vezetı illetve abban résztvevı személyeknek megfelelı, a hatóság által elismert végzettséggel ill. gyakorlattal kell rendelkezniük Feltételek (2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett intézményben és engedély alapján végezhetı. (Ávt. 25. ) (1) Állatkísérlet kizárólag olyan felelıs személy vezetésével végezhetı, aki külön jogszabályban meghatározott végzettséggel és gyakorlattal rendelkezik, és ismeri az állatkísérletek etikai elveit, jogi szabályait. (2) Állatkísérletet az végezhet, a kísérleti állatot az gondozhatja, felügyelheti, aki erre képesítı oktatásban részesült. (Ávt. 30. ) Kísérleti célra állatot tenyészteni (szaporítani), tartani, szállítani, valamint forgalomba hozni a tartás helye szerinti állategészségügyi hatóság engedélyével szabad. (Ávt. 31. (1) bek.) 5 6 Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság (MÁB) 34. (1) A MÁB feladata az intézmény a) állatkísérleti szabályzatának (etikai kódexének) elkészítése; b) állatkísérleti szabályzata végrehajtásának ellenırzése; c) állatkísérleteinek szakmai-etikai felügyelete. A MÁB feladata továbbá az intézményben az állatkísérlet végzésére jogosult személyek oktatásának, képzésének szervezése. (2) A MÁB az intézmény belsı állatkísérleti szabályozásának megsértése esetén jogosult - az állat-egészségügyi hatóság egyidejő értesítése mellett - a kísérlet azonnali leállítására. (Ávt. 34. ) (4) A MÁB nyilvántartást vezet az általa jóváhagyott kísérletekrıl, valamint az intézményben folyó állatvédelmi oktatásról (az oktatás tematikája, a résztvevık névsora). (Korm. rend. 9. ) Állatkísérletek engedélyeztetése tikai engedély Csak erre a célra tenyésztett állatokkal szabad kísérletezi gér Patkány Nyúl Macska Kutya Sertés Majom 7 8

2 In vitro autoradiográfia Állatkísérletek izotóppal jelölt biomolekulákkal x vivo autoradiográfia, szervi megoszlásos vizsgálatok In vivo molekuláris képalkotó technikák Az autoradiográfia nagy múltú technika Niepce St. Victor in 67 ben mutatta ki, hogy az uránium só feketedést okoz az ezüst klorid/bromid sót tartalmazó emulzión H. London készítette az elsı makroautoradiográfiát, ahol egy békát rádium izotóppal jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából jött leképezte egy filmre Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhetı Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával. Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze. Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezetben, szervekben, sejthalmazon, sıt egyes sejteken belüli lokalizációja meghatározható Gyógyszerkutatás Élettani folyamatok nyomon követése Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió, membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitest jelölésekkel stb) Kémiai analitikai módszerek Autoradiográfia A metszetek fagyasztva szárítása Izotóp injektálása Állatok elıkészítése a metszésre A beágyazó anyag elıkészítése Beágyazás Metszés lımetszés Metszés A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás) A szeletek elıkészítése a detektáláshoz A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával. Kiértékékelés 15 16

3 Izotópeloszlás detektálása sugárérzékeny filmen,vagy beta imager technikával LICA CM 3600 cryomacrotom 17 gésztest autoradiográfia Tumordiagnosztika, Anatómia kép terápia hatékonyságának kimutatása állatkísérletekben Patkány modell FDG Megelızı Orvostani Intézet TTK Molekuláris Biológiai Intézet Anatómiai kép (felsı) és emissziós FDG-PT kép (középsı) fúziója (alsó kép) A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával Látens kép kialakítása AgBr kristály keletkezı Ag atomok a látens kép prekurzorai AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására Zselatin Ag+ + e- = Ag folyamatban Instabil állapot Radioactív halmozás Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 oc-on végezzük Minta (metszet) A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökıdik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik

4 lıhívás Fixálás Az elıhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak. AgBr----Ag Látens kép ezüst szemcse lıhívás itt jelenik meg gyorsabban a látható kép Autoradiogram A látens kép láthatóvá tétele 25 Az elıhívott kép rögzítése: Az elıhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdıben eltávolítjuk Mosás: sók eltávolítása a zselatinból 26 Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen A felbontóképesség függ: az izotóp energiájától a minta rétegvastagságától a fotoemulzió rétegvastagságától a minta és a film közötti távolságtól az expoziciós és elıhívási idıtıl stb. Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm 2 ) létrehozott Ag szemcsék száma Optimalizálás Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással Preflash elıvilágítási technika In vitro állatkísérletek: autoradiográfia A szervekbıl készített szövettani metszetek jelölése a membránhoz kötıdı specifikus izotóppal jelölt ligandokkal: Receptor-ligand kötıdés Kompetíciós vizsgálatok Specifikus nem specifikus jelölıdések 27 F NCA kötıdése egéragyban 100 nm FNCA 100 µm hideg FNCA 28 Coronális metszetek Radioluminescencia detektálása George Luckey 1975-ben fejlesztette ki- Gyors, regenerálható detektálása a radioaktiv felhalmozódásnak az egyes metszetekben, gélekben, szeletekben stb. BaFBr:u 2+ Kiolvasás lazer fénnyel nergia csapda Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezeten belüli felhalmozódásának, kiürülésének, kötıdésének vizsgálata szervi megoszlásos ex vivo állatkísérletekben - Állatok injektálása a radiofarmakonnal -xpoziciós idı eltelte után az állatok leölése -Szervek kipreparálása Szervek tömege és a radioaktivitás mérése Gamma számláló, folyadék szcintillációs berendezés ID%= 1 g szervben mért aktivitás normálva a beadott aktivitásra és a teljes tömegre 31 32

5 Szerv plazma 0,339±0,060 0,268±0,002 0,198±0,069 0,195±0,029 vérsejt 0,266±0,100 0,9±0,050 0,097±0,030 0,104±0,040 lép 0,390±0,050 0,684±0,177 0,250±0,140 0,638±0,192 agy 0,506±0,100 0,350±0,040 0,280±0,060 0,205±0,030 tüdı 0,778±0,131 0,641±0,080 0,5±0,190 0,494±0,075 szív 1,687±0,314 0,914±0,039 0,747±0,092 0,572±0,039 gyomor 1,450±0,087 1,873±0,849 0,223±0,047 0,243±0,070 vastagbél 0,359±0,204 0,386±0,147 0,307±0,132 0,372±0,051 vékonybél 1,593±0,417 6,907±1,877 3,336±0,131 7,390±2,511 vizelet 1,036±0,411 2,846±1,508 1,779±0,922 4,282±1,347 máj 2,611±0,450 2,959±0,520 2,665±0,519 2,105±0,547 n= 3 (átlag±s.d.) 2.táblázat: [ 11 C]ISC szervekben, szövetekben történı akkumulációja, egér modellben Kutatási szintek egy biológiailag aktív molekula (ligand, gyógyszer) életében Alap kutatás Betegség kutatás Gyógyszer felfedezés Preklinikai vizsgálatok Klinikai trial I, II, III Gyártás Nem szabályozott GLP GCP GMP (Good clinical practice) (Good manufacturing practice) In vivo állatkísérletek PT kamerával 11 C Gyors szintézisben a legtöbb szerves vegyületbe beépíthetı. Nincs gyógyszertani különbség a jelzett és a jelzetlen molekula között. Az izotóp effektus elhanyagolható N Gyors szintézis szükséges. N-tartalmú vegyületek esetén a jelzett és jelzetlen vegyület biológiai szempontból azonos. Fı a ammónium ionként történik, szívizom perfuzió vizsgálatában. 15 O Igen gyors szintézis szükséges. Alkalmazás oxigén gázként, vízként, széndioxidként és n- butanolként az agy és a szívizom vérellatásának vizsgálatában Funkcionális vizsgálatok PT izotóppal jelölt biomolekulákkal F A legkisebb pozitron energiájú PT izotóp. Igen szép a képalkotás. A fiziológiai folyamatok kvantitatív értékelését is lehetıvé teszi. Sokféle molekulába beépíthetı. Metabolikus anyagforgalom nyomjelzıi: FDG, 11 C-kolin, 11 C-metionin, Targetspecifikus biomolekulák: jelzett receptor-ligandok Perfúziós tracerek: 15 O-butanol 13 N-ammónia 99m Tc-MIBI (SPCT) 39 40

6 vese béltraktus MiniPT-2 kamera szív hólyag szív tüdı béltraktus 2. ábra: A receptor ligand aktivitás eloszlása dinamikus PT vizsgálat alatt, nyúlban (szaggitális sikok, transzmissziós vizsgálatra helyezett emissziós képek). 41 DOC NMI ATOMKI MDISO KFT közös fejlesztés 42 MiniPT-2 kamera Tulajdonságai: hálózat alapú adatgyőjtés teljes győrős, 5 cm axiális látóterő kamera szoftveresen mozgatható ágy felbontás: ~1mm kristálytípus: LYSO kristályméret: 1.27 x 1.27 x 12 mm3 kristályszám: 35 x 35 detektorszám: 12 axiális látómezı : ~50mm Patkány agy CT-FDG A radioaktivitás mértékegységei Aktivitás (bomlás/másod) [Bq] Becquerel SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másod [Ci] Curie 1gram tiszta 226 Ra aktivitása 1Curie=3,7x10 10 Bq 10mCi=400MBq 1MBq= 27uCi 37MBq=1mCi 47