CB2 receptorok megoszlása gerincvelő hátsó szarvában

CB2 receptorok megoszlása gerincvelő hátsó szarvában Készítette: Hegedűs Krisztina DEBRECENI EGYETEM DEBRECEN 2013

1. Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék......1 2. Bevezetés.....2 3. Témafelvetés, célkitűzés.........4 4. Szakirodalmi áttekintés..... 5 4.1. Gerincvelő..5 4.2. Cannabinoid receptorok...6 4.2.1. A cannabinoid receptorok endogén ligandjai és szignalizációs útvonalai...7 4.2.2. A CB2 receptor megoszlása...9 5. A vizsgálatok anyaga és módszere..............11 5.1. Kísérleti állatok...11 5.2. Mintavétel és minta előkészítés...11 5.3. Fénymikroszkópos DAB alapú immunhisztokémia...12 5.4. Fluoreszcens alapú immunhisztokémia...13 5.5. Poliakrilamid gélelektroforézis és western blot...14 5.6. Fluoreszcens alapú kettős jelöléses immunhisztokémia..15 6. Vizsgálati eredmények és azok értékelése......17 6.1. Az antitestek specificitásának vizsgálata.17 6.2. Az CB2 receptorok megoszlásának vizsgálata patkányban.24 7. Következtetések, javaslatok 27 8. Összefoglalás..28 9. A szakirodalom jegyzéke...30 10. Köszönetnyilvánítás...33 11. Mellékletek 34 1

2. Bevezetés Az indiai kendert (Cannabis sativa var. indica) már az időszámításunk előtti harmadik évezredben alkalmazták a gyógyításban. Írásos emlékek szerint kivonatát Kínában fájdalomcsillapításra, Indiában szorongás oldására, valamint étvágyfokozásra használták. Napjainkban a köznyelvben marihuánának nevezett cannabis kivonat széles körben ismert és használt élvezeti cikknek számít. Orvosi alkalmazása a hozzászokás és függőség miatt a XX. század első felében háttérbe szorult, hivatalos gyógyszerként betiltották. Az utóbbi időben újra felmerült a marihuana gyógyászati alkalmazásának kérdése. Évtizedes vita folyik, vajon használható-e orvosi célokra a marihuana. Néhány amerikai államban törvénybe foglalták, hogy orvosi tanácsra fogyasztható. Számos orvos azonban vitatja, hogy valóban vannak olyan egészségi állapotok, amelyekben ez lenne a helyes gyógyszer. A marihuana jótékony hatása mellett kiálló ellentábor véleménye szerint viszont csillapítja a fájdalmat, csökkenti a hányingert, oldja az izomgörcsöket, továbbá csökkenti a szemnyomást a zöld hályogos betegeknél, segít az álmatlanságban, depresszióban szenvedő betegeken és így tovább. A kaliforniai egyetem San Diego-i orvosi karán létrehoztak egy intézetet a kérdés tisztázására. A cannabinoid rendszer kutatása két évtizedes múlttal rendelkezik, súlyos betegségekkel és kórállapotokkal való kapcsolata miatt ma az egyik leginkább kutatott területe az orvostudománynak. Az endocannabinoid rendszer működése és aktivitása a szervezet legtöbb szövetében és szervében igazolt, szerepet játszik számos fiziológiai és patológiai folyamatban. Vizsgálták a központi idegrendszerben, gastrointestinalis, hepaticus, pulmonalis, csont, reproduktív rendszerekben, malignus megbetegedésekben, a fájdalom és gyulladás mechanizmusában betöltött szerepét, valamint szemészeti vonatkozásait. A cannabinoid rendszer kutatásának kiindulópontját a Δ9-tetrahidrokannabinol (THC) marihuánából történő izolálása, majd az ezt követő THC-val és szintetikus analógjaival történő vizsgálatok adták. (Gaoni és mtsai, 1964) A kísérletek eredményei receptor mediálta mechanizmust vetettek fel. A felvetést igazolta, hogy az 1990-es évek elején sikerült klónozni 2

a CB1 receptort elsőként patkányból, majd emberből is. A CB2 receptort 1993-ban azonosították és elsőként HL60 (humán promyelocyta leukémia) sejtvonalból klónozták (Matsuda és mtsai, 1990; Munro és mtsai, 1993). A CB1 receptor főként a központi idegrendszerben fordul elő, de szinte minden perifériás szövetben kimutatták már. A CB2 elsősorban az immunrendszer sejtjeiben, valamint a hemopoetikus rendszerben expresszálódik. Innen kapta a perifériás cannabinoid receptor elnevezést. Az irodalmi adatok azt mutatják, hogy a receptor a legtöbb szervben és szervrendszerben megtalálható. Sikerült kimutatni a központi idegrendszerben, agyi és gerincvelői szinten egyaránt, viszont pontos megoszlását és működésének mechanizmusát nem ismerjük. 3

3. Témafelvetés, célkitűzés A CB2 receptor gerincvelői szinten betöltött szerepének és működésének megismerése érdekében célul tűztük ki a CB2 receptor megoszlásának vizsgálatát a gerincvelő hátsó szarvában. A kereskedelmi forgalomban kapható CB2 antitestek közül (amelyek különböző gyártók, különböző epitópok ellen előállított termékei) ki akartuk választani azt, amelyik specifikusan képes kimutatni a CB2 receptorokat az általunk használt kísérleti állatok, patkányok és egerek gerincvelőjének hátsó szarvában. A specifikusnak talált antitesttel vizsgálni akartuk a CB2 receptor megoszlását a lumbalis gerincvelői szürkeállomány hátsó szarvában DAB, illetve fluoreszcens alapú immunhisztokémiai reakciók segítségével. 4

4. Szakirodalmi áttekintés 4.1. Gerincvelő: A gerincvelőn (medulla spinalis) megkülönböztetünk nyaki (cervicalis), mellkasi (thoracalis), ágyéki (lumbalis), és keresztcsonti (sacralis) szakaszt. A nyaki szakasz 8, a mellkasi 12, az ágyéki 5, a keresztcsonti szintén 5 szelvényből áll. Kísérleteink során a lumbális 4-es, 5-ös gerincvelői szegmentumból vett metszeteket vizsgáltunk. A gerincvelő átmetszetét tekintve belül H-betűt, vagy lepkéhez hasonló alakzatot mutatva helyezkedik el a szürkeállomány, amelyet a fehérállomány vesz körül. A szürkeállomány ventrális részét keresztmetszetben elülső szarvnak, míg dorsalis részét hátsó szarvnak /cornu posterius/ nevezzük. A szürkeállomány laminákra tagolódik, melyekből az első hat a hátsó szarvban található.(1. ábra) 1. ábra: A gerincvelő szürkeállományának laminaris felosztása 5

4.2. Cannabinoid receptorok: Az általunk a gerincvelő hátsó szarvában vizsgálni kívánt CB2 receptor a CB1 receptorhoz hasonlóan hét transzmembrán doménnal rendelkező, G-fehérje kapcsolt receptor.(2. ábra) 2. ábra: Az endokannabinoid receptorok szerkezete Emberben a két receptor teljes aminosav sorrendje csak 44%-ban egyezik meg. Ez a különbség egér esetén kisebb mértékű, a homológia 66%-os. A humán CB2 receptor csupán 60 aminosavban különbözik a rágcsálókétól, ami 82%-os homológiát jelent. (Shire és mtsai, 1996) A CB2 receptorok intronokat tartalmaznak, így altarnatív spiclingon mehetnek keresztül, melynek következtében többféle variánsuk is kialakulhat. Emberben kétféle receptor variánst találtak. A CB2RA nagymértékben expresszálódik a herében, a CB2RB expressziója pedig splenocytákban mutat magas értéket.(liu és mtsai, 2009) Ezzel szemben humán B sejteken csak egy, míg rágcsáló B sejteken három féle mrns variánst is kimutattak. (Sherwood és mtsai, 2009) A szubtípusok szelektív expressziója lehetőséget nyújthat a fiziológiás válaszok CB2 receptorok általi szabályozására. 6

4.2.1. A cannabinoid receptorok endogén ligandjai és szignalizációs útvonalai: Mindkét receptort (CB1, CB2) ugyanazok az endogén ligandok aktiválják: az anandamid, illetve a 2-AG (2-arachidonoil-glicerol).(3. ábra) 3. ábra: Az anandamid és a 2-AG kémiai szerkezete Az anandamid N-arachidonoil-foszfatidil-etanol-amidból (NAPE) (membrán lipid prekurzor) keletkezik foszfolipáz C útvonalon keresztül NAPE-PLD (PLD: foszfolipáz D) segítségével. Az anandamid lebontásában a zsírsav-amid-hidroláz (FAAH) játssza a főszerepet. A 2-AG (diacil-glicerol) DAG-ból képződik DAG-lipáz segítségével, metabolizációját a (monoacilglicerol-lipáz) MAGL végzi. Jelátvivő rendszere komplex, aktivitása adenilát-cikláz aktivitáshoz kötött. A CB2 exogén expresszióját CHO és COS sejteken figyelték meg, ahol a receptor szignalizációja gátolta az adenilát-cikláz aktivitást, csökkentve ezzel a camp szintet a sejtekben. (Slipetz és mtsai, 1995) A camp szint csökkenése továbbá a T-sejtek jelátvitelének gátlásához vezet a camp/pka/csk/lck útvonalon keresztül. (Borner és mtsai, 2009) A CB2 aktiváció transzfektált CHO sejtekben p42/p44 MAP kináz aktvációhoz, HL60 és prostata epttheliális sejtekben az inracelluláris kálcium szint emelkedéséhez és peroxiszóma aktivált receptorok aktivációjához vezet. (O Sullivan és mtsai, 2009) Neuronokban kimutatták, hogy a CB2 stimulálása megnöveli az Akt foszforilációt, amely megvédi a sejteket az apoptózistól. Ebben a folyamatban a PI3 kináz is szerepet játszik, amit 7

foszfatidil-inozitol 3 (PI3) kináz inhibítor használatával bizonyítottak.(viscomi és mtsai, 2009) A CB2 receptor jelátvitel tehát szabályozza az intracelluláris kálciumot. A szignalizáció βγ G-fehérje alegységeken keresztül aktiválja a PLC-t I3P keletkezéséhez és a kálcium intracelluláris raktárakból való felszabadulásához vezetve.(zoratti és mtsai, 2003) HL-60 sejtekben specifikus agonista stimuláció hatására a CB2 receptorok érzéketlenné válnak C-terminusuk foszforilációja által. Ezt követően egy intracelluláris szignalizációs kaszkád indul be, amely magába foglalja a MAP kináz útvonal aktivációját és az NF-κβ mobilizációját, inflammatorikus citokinek és más faktorok expresszióját szabályozva.(4. ábra) (Jean-Marie Derocq és mtsai, 2000) 4. ábra: CB2 receptor aktiváció HL-60 sejtekben A depolarizáció következtében a neuronokba áramló Ca 2+ hatására a2-ag negative feedback kontrollá válik saját szintézisére nézve. A CB2 receptorok aktivációja Ca 2+ felszabadulást eredményez. A 2-AG segíti az inozitol-tri-foszfát IP 3 hatását. A CB2 receptor aktivációja részlegesen gátolja a camp keletkezését, a 2-AG egyrészt gátolja a mitogénaktivált-protein-kinázt (MAPK), melynek következtében a krox-24 aktiválódik, másrészt 8

elősegíti a camp válasz elem (CRE), a nucleáris faktor B (NF-B) és az indukált nitrát-oxidszintáz (inos) protein-kináz A (PKA) mediált aktivációját.(5. ábra)(v. Di Marzo, 1998) 5. ábra: A 2-AG lehetséges intracelluláris, CB2 mediálta hatásai 4.2.2. A CB2 receptor megoszlása: A szakirodalmat áttekintve a közlemények többsége a CB2 receptort elsősorban az immunrendszerhez, illetve a hemopoetikus rendszerhez köti. A CB2 receptort a szervezet szinte minden szervrendszerében leírják, viszont a központi idegrendszer vonatkozásában az irodalom nem foglal egyértelműen állást. Néhány közlemény egyértelműen kizárja a CB2 jelenlétét a központi idegrendszerben, míg mások agyi és gerincvelői szinten is leírják. A CB2 mrns jelenlétét a legtöbb immunszövetben igazolták (Buckley és mtsai, 2000). A specifikus immunsejtek közül a CB2-t a legnagyobb mértékben a makrofágok, CD4+ T- sejtek, CD8+ T-sejtek, B-sejtek, természetes ölő sejtek (NK-sejtek), monociták expresszálták. (Maresz és mtsai, 2007; Dittel, 2008) Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy a CB2 hiányzik a központi idegrendszerből. A CB2 mrns-t 1993-ban, a receptor első sikeres klónozásakor in situ hibridizációval sikerült kimutatni patkány agyban. Később a receptort karakterizálták immunsejteken, de egér agyon 9

és patkány cerebellumon végzett Northern blottal nem tudták kimutatni.(schatz és mtsai, 1997) A további Northern blot (Beltramo és mtsai, 2006) és in situ hibridizációs (Hohmann és Herkenham, 1999a, b) vizsgálatokkal sem tudták kimutatni a CB2 receptort a gerincvelőben és a hátsó gyöki ganglionokaban. A kísérleti eredményeket figyelembe véve az irodalom a CB2 receptort perifériás cannabinoid receptornak tekinti. A mikroglia makrofágokból származik és mint rezidens immunsejt patológiás elváltozásokat jelez (Ashton és Glass, 2007) A CB2 mikrogliákon való expressziója függ a sejt aktivációs állapotától. (Cabral és mtsai, 2008) A CB2 modulálja a mikrogliák aktivációját és migrációját. (Price és mtsai, 2009) A CB2 mrns-t és fehérjét megtalálták mikrogliákon, bizonyítva ezzel, a CB2 szerepét a központi idegrendszerben.(beltramo és mtsai, 2006) Neuropátiás fájdalom modellben a CB2 mrns szintje szinkronban az aktivált mikrogliákkal megnő a gerincvelőben. (Zhang és mtsai, 2003) A CB2 receptorokat kimutatták a mikrogliák mellet astrocitákon és neuronokon is. Perifériás neuronokon először 1997-ben sikerült a CB2 mrns-ét kimutatni.(griffin és mtsai, 1997) A CB2-nek szerepet tulajdonítanak továbbá a szenzoros neuron funkciókban a gerincvelőben.(nackley és mtsai, 2004) Funkcionális és anatómiai kísérleti eredmények azt sugallják, hogy a CB2 expresszálódik az idegrendszerben aktivált mikrogliákon és néhány neuronon. Mivel alapvetően fontos a CB2 központi idegrendszerben betöltött funkcionális szerepének meghatározása, elengedhetetlen annak a megismerése, hogy a CB2 hol és hogyan expresszálódik a központi idegrendszerben, a gerincvelőben. 10

5. A vizsgálatok anyaga és módszere 5.1. Kísérleti állatok: Kísérleteinket Wistar patkányokon, vad típusú (Black6), illetve CB2 knock out (K.O.) egereken végeztük. Állatkísérleti engedélyszám: 19/2001 DE-MÁB 5.2. Mintavétel és minta előkészítés: 1) A kísérleti állatok altatása intraperitoneálisan beadott Nembutal injekcióval történt (50mg/kg testsúly). 2) Az állatokat mély anaesthesiában transcardiálisan perfundáltuk. A mellkas felnyitása után a perfúziós készülék tűjét bevezettük a szív bal kamráján keresztül az aortába, majd metszést ejtettünk a jobb pitvaron. 3) Fiziológiás sóoldatot vezettünk az aortába mindaddig, amíg az víztisztán nem távozott a jobb pitvaron keresztül. 4) 4% paraformaldehid (PA) tartalmú fixáló oldattal 20 percig fixáltuk a kísérleti állat szöveteit. 5) Kiemeltük a lumbalis gerincvelői szakaszt. 6) Utófixálás: a kiemelt anyagokat 4 órán keresztül hagytam állni a megfelelő fixálóban, hogy az kellően átjárhassa a szöveteket. 7) Az anyagok szacharóz oldatokba kerültek. 10%(m/m)-os szacharóz oldat /0,1M ph= 7,4 foszfát pufferben (PB) oldva/; /15 perc/ 20%(m/m)-os szacharóz oldat /0,1M ph= 7,4 PB-ben oldva/ /4-5 óra, vagy 1 éjszaka; mindaddig, amíg a fixált anyagok le nem süllyednek/ 8) A feltárást folyékony N 2 -nel történő fagyasztással végeztük. A fagyasztott anyagok 0,1M PB-be kerültek. 9) Az anyagok beágyazása agarba történt. 11

10) A beágyazott anyagokból vibratóm segítségével 50μm vastag metszeteket készítettünk. A kíméletesebb feltárás érdekében a fluoreszcens reakciók esetén a feltárást úszó metszeteken 50%(m/m)-os etil-alkohollal végeztük. A rendelkezésünkre álló antitestekkel DAB és fluoreszcens alapú immunhisztokémiai reakciót végeztünk a CB2 receptor kimutatására a vad típusú (Black 6), illetve a CB2 K.O. egerek lumbalis gerincvelői szakaszaiból származó metszeteken. 5.3. Fénymikroszkópos DAB alapú immunhisztokémia: 1) Mosás 0,1M-os PB-ben. /3*15 perc/ 2) 0,01%(m/m) H 2 O 2 -oldat. /30 perc/ 3) Mosás 0,1M-os PB-ben. /3*15 perc/ 4) TPBS /3*15 perc/ 5) Blokkolás 10%(m/m) Normal serum /50 perc/ 6) Mosás 1%(m/m) Normal serum /10 perc/ 7) Primer serum /2 nap/ 8) 1%(m/m)-os Normal serum /3*15 perc/ 9) Secunder serum /4-5 óra/ 10) 1%(m/m)-os Normal serum /3*15 perc/ 11) ABC komplex /1 éjszaka/ 12) TPBS /3*15 perc/ 13) 0,05M-os TRIS-oldat /3*15 perc/ 14) DAB-oldat /20perc/ 15) Hívás H 2 O 2 -oldattal /max. 10 perc/ 1ml DAB-oldathoz 10μl 1%(m/m) H 2 O 2 -oldat szükséges. 16) 0,05M-os TRIS-oldat /3*15 perc/ 17) Mosás 0,1M-os PB-ben. /3*15 perc/ 12

18) A metszeteket zselatinozott tárgylemezekre szedtük, majd 24 órán keresztül száradni hagytuk. 19) A víztelenítést felszálló alkoholsorral végeztük. 20) Fedés DPX-el. 5.4. Fluoreszcens alapú immunhisztokémia: 1) Metszetek mosása PBS-ben /3*15perc/ 3) Blokkolás 10%(m/m) Normal serum /50 perc/ 4) Mosás 1%(m/m) Normal serum /10 perc/ 5) Primer serum /2 nap/ 6) Mosás 1%(m/m) Normal serum (PBS-ben) /3*15 perc/ 7) Secunder serum /2 óra/ 8) Mosás 1%(m/m) Normal serum (PBS-ben) /3*15 perc/ 9) Mosás PBS-ben /3*15 perc/ 10) Felszedés sötétben, fénytől védve /VECTRA SHIELD fedőanyag, sötét mappába tenni/ Az immunhisztokémiai reakciókkal párhuzamosan Western blot vizsgálatokat is végeztünk annak érdekében, hogy kiválaszthassuk a legspecifikusabb antitestet további vizsgálataink céljára. 13

5.5. Poliakrilamid gélelektroforézis és western blot: 1) Túlaltatás után, a gerincvelő lumbális szakaszát, a gyrus cingulit (továbbiakban: agy) és a lépet sztereomikroszkóp alatt eltávolítottuk a kísérleti állatokból. 2) A szövetmintákat mechanikusan homogenizáltuk és proteáz inhibitorokkal (4mM EDTA, 2,5 mm EGTA, 2 nm PMSF, 26 μm benzamidin, 8 μm pepstatin A, 2 μg/ml szójabab tripszin inhibitor, 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml aprotinin) kiegészített, 1% Nonidet P-40 és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát detergenseket tartalmazó (Sigma) 20 mm TRIS (ph 7,4) oldatban jégen, lassú rázatás mellett 1 órán át inkubáltuk. 3) A mintákat 14.000 rmp fordulatszámmal 4 o C-on 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót felhasználásig -70 o C tároltuk. 4) A minták fehérjetartalmát BCA módszerrel mértük (Pierce, Rockford, USA). 5) A fehérjemintákat (50 μg/ zseb) 10%-os poliakrilamid gélen futattuk (Laemmli rendszer), majd PVDF membránon (Millipore, Bedford, USA) elektroforetikusan immobilizáltuk. 6) A membránokat 10% normál borjú szérumot tartalmazó TTBS pufferben (20 mm TRIS, 500 mm NaCl, ph 7,7, 0,05% Tween-20) blokkoltuk, majd CB2 receptor-specifikus primer antitesttel inkubáltuk egy éjszakán át 4 o C-on. (A primer antitestek tesztelése során több gyártó által készített terméket próbáltunk ki: ABCAM (ab3561, ab45432), Cayman, Sigma, Tocris.) 7) A membránt TTBS pufferben 3x10 percig mostuk, majd szobahőn 4 órán át tormaperoxidáz enzimmel konjugált szekunder antitesttel (anti-nyúl Ig-HRP, 1:500; DAKO, Glostrup, Denmark) inkubáltuk. 8) Végül a jeleket DAB reakcióval vizualizáltuk. 14

1. táblázat: A tesztelt anti-cb2 antitestek (primer szérumok) és alkalmazott hígításaik gyártó katalógus szám epitóp termeltetve hígítás Abcam ab3561 1-32 aminosav rabbit 1:500 Abcam ab45942 200-300 aminosav rabbit 1:20000 Cayman 101550 20-33 aminosav rabbit 1:2000 Tocris 2231 19-33 aminosav rabbit 1:20000 Sigma C-1483 1-32 aminosav rabbit 1:10000 Alomone ACR-003 11-24 aminosav rabbit 1:20000 2. táblázat: Az alkalmazott secunder antitestek és hígításaik gyártó katalógus szám antitest hígítás Vector PK-4001 b-gar 1:200 Invitrogén A-21428 GAR Alexa 555 1:1000 A kiválasztott Abcam ab45942 antitesttel a továbbiakban patkány gerincvelő lumbalis szegmentumának metszetein fluoreszcens alapú immunhisztokémiai kettős jelöléses reakciókkal mikroglia (CD11b) és astrocita (GFAP) markerekkel kívántuk meghatározni azt, hogy a CB2 receptor gliasejteken, vagy neuronokon lokalizálódik-e a gerincvelő hátsó szarvában. (3. táblázat) 5.6. Fluoreszcens alapú kettős jelöléses immunhisztokémia: Az alkalmazott módszer alapjában véve megegyezik a fluoreszcens alapú immunhisztokémiánál leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy itt nem egyetlen primer, illetve annak megfelelő secunder serummal inkubáltunk, hanem primer és secunder szérumként kétkét antitest keverékét alkalmaztuk. (4. táblázat) 3. táblázat: Fluoreszcens alapú kettős immunhisztokémiai festésekre használt antitestek és hígításaik gyártó katalógus szám antitest hígítás Abcam ab45942 rabbit anti-cb2 1:5000 AbD Serotec MCA275R mouse anti-cd11b 1:500 Bachem T-3102.0001 mouse anti-cd11b 1:500 Millipore MAB3402 mouse anti-gfap 1:500 15

4. táblázat: Fluoreszcens alapú kettős immunhisztokémiai festésekre használt primer és secunder antitest keverékek és az antitestek hígításai Primer antitest keverék Secunder antitest keverék rcb2-mcd11b GAR A.555-GAM A.488 1:5000-1:500 1:1000-1:1000 rcb2-mcd11b GAR A.555-GAM A.488 1:5000-1:500 1:1000-1:1000 rcb2-mgfap GAR A.555-GAM A.488 1:5000-1:500 1:1000-1:1000 16

6. Vizsgálati eredmények és azok értékelése: 6.1. Az antitestek specificitásának vizsgálata: A kereskedelmi forgalomban hat anti-cb2 antitest volt fellelhető. Elsőként meghatároztuk az antitestek optimális hígítását patkányból és egérből származó mintákon. A 4% paraformaldehiddel fixált vad típusú (Black 6), illetve CB2 K.O. egerek DAB protokoll alapú immunfestett gerincvelői metszetein összehasonlítottuk az adott antitesttel kapott immunreaktivitást. Az immunfestés mellett az antitestek specificitását Western blot analízissel is megerősítettük. A kétféle vizsgálattal kapott eredmények együttes elemzésével döntöttük el, hogy az adott antitest megfelel-e további kísérleteinkhez. Anti-CB2 Abcam AB 3561 antitest: Az antitest optimális hígítását egér gerincvelőn 1:500-ban találtuk megfelelőnek. A 10x-es nagyítású képeken (kalibráció:100μm) nagyon gyenge pontszerű festődés figyelhető meg a hátsó szarv I-II. lamináiban. A K.O. mintában ehhez képest jelölés szinte egyáltalán nem látható. (1.a,b kép) A Western blot membránon a lépben két immunfestett sávjelent meg, míg a 45kDa-nál megjelenő sáv lényegesen gyengébb. Az agyban és gerincvelőben a jel nagyon gyenge intenzitást mutat. Ez a gyenge immunfestődés azonban több jelölődő sávot is kirajzol. (1.c kép) 1.a kép: Abcam 3561, Black6, 10x 1.b kép: Abcam 3561, CB2 K.O., 10x 17

1.c kép: Western blot agy, gerincvelő, lép mintákban anti-cb2 Abcam AB3561 antitesttel Anti-CB2 Cayman antitest: Egér gerincvelőn a Cayman Chemical által forgalmazott antitest esetén az optimális hígítás 1:1000-nek adódott. Ebben az esetben a vad típushoz tartozó mintáról készült felvételen jól látható az immunreaktivitás a gerincvelő hátsó szarvában, ami zömében kerekded alakú jelölésekként nyilvánul meg, melyek mérete nem minden esetben azonos. Emellett pontszerű festődés is megfigyelhető, ami a hátsó szarv I-II. lamináiban kifejezettebb. A vad típusú állatból származó mintán látható jelölés a K.O. gerincvelő esetén teljesen hiányzik.(2a, b kép) A Western blott membránon azonban több sáv is látható a 39,8-58kDa tartományban. A sávok intenzitása mintán belül eltérő. A lépben a 39,8kDa-nál látható sáv a legerőteljesebb, míg az agykéregben és a gerincvelőben a 45kDa-nál lévő sávok a legszembetűnőbbek. (2.c kép) 2.a kép: Cayman, Black6, 10x 2.b kép: Cayman, CB2 K.O., 10x 18

2.c kép: Western blot agy, gerincvelő, lép mintákban anti-cb2 Cayman antitesttel Anti-CB2 Tocris antitest: Az antitestet 1:20000 hígításban alkalmazva erőteljes, homogén festődés figyelhető meg mind a vad típusú, mind a K.O. állatokból származó mintákon. A hátsó szarv I-II. laminái erősebben festődnek a mélyebb lamináknál, ahol gyengébben festődő, kisméretű kerekded jelölések láthatóak. A K.O. mintában a festődés erőssége gyengébb, de a megoszlása hasonlít a vad típusú állatban megfigyelhető festődés megoszlásához. (3a, b kép) Az antitest tehát várakozásainkkal ellentétben nem mutatott kellő immunreaktivitásbeli különbséget a különböző mintákon. A Western blot agyban és gerincvelőben több sávot is mutat a 39,8-58kDa-os tartományban. Az agyi minta esetén a 45kDa felett elhelyezkedő erős intenzitású sáv alatt és felett egy-egy gyengébb intenzitású is látható. Gerincvelő esetén a 45kDa felett elhelyezkedő, erős intenzitású sáv alatt szintén egy plusz sáv jelenik meg, míg a lépben egy halvány sáv látható csupán a 45kDa-nak megfelelő helyen.(3.c kép) 3.a kép: Tocris, Black6, 10x 3.b kép: Tocris, CB2 K.O., 10x 19

3.c kép: Western blot agy, gerincvelő, lép mintákban anti-cb2 Tocris antitesttel Anti-CB2 Sigma antitest: A Sigma anti-cb2 antitestjét 1:10000 hígításban használva erőteljes, homogén háttérfestődés mellett kerekded, illetve kissé ovális képletek, valamint pontszerű festődés figyelhető meg a gerincvelő hátsó szarvában. Az immunreaktivitás a hátsó szarv felszínes lamináiban a legerősebb. A K.O. gerincvelői metszetnél az immunreaktivitás gyengébb ugyan, de a jelölés ugyanúgy megfigyelhető. (4a, b kép) A Western blot képén az agyban és a gerincvelőben a 45kDa felett egy-egy erősebb sáv látható, melyek alatt még egy-egy gyengébb sáv is megjelenik, míg a lép (ahol mindenképpen jelet vártunk) teljesen üres. (3.c kép) 4.a kép: Sigma, Black6, 10x 4.b kép: Sigma, CB2 K.O., 10x 20

4.c kép: Western blot agy, gerincvelő, lép mintákban anti-cb2 Sigma antitesttel Anti-CB2 Alomone antitest: Az 1:20000 hígítás mellett a DAB reakcióval a vad típus és a K.O. minták között festődésbeli különbség a mintázatot tekintve nem figyelhető meg. Az I. és a II. lamina gyengébb, homogén festődéséből apró, pontszerű jelölések tűnnek elő. A pontszerű jelölés a mélyebb laminákban is megmarad, a felszínes laminákhoz képest kisebb számban. Az eltérés a két minta az immunreaktivitás erősségében mutatkozik meg, a K.O. metszetek gyengébben festődnek. (5a, b kép) A Western blotton agyi és gerincvelői mintákban 45kDa-nál egy-egy gyenge intenzitású sáv látható. (5.c kép) 5.a kép: Alomone, Black6, 10x 5.b kép: Alomone, CB2 K.O., 10x 21

5.c kép: Western blot agy és gerincvelő mintákban anti-cb2 Alomone antitesttel Anti-CB2 Abcam AB 45942 antitest: Az optimális hígítás egér gerincvelői metszeteken 1:20000-nek adódott. Az adott hígításban a többi antitesttől eltérően a K.O. állatból származó metszeteken jelölés nem látható. Ezzel szemben a Black 6-os egér gerincvelői metszetein erős immunreaktivitás figyelhető meg. A gerincvelő hátsó szarvának I-IV. lamináiban főként pontszerű jelölés látható, de emellet néhány, ovális alakú képlet is kirajzolódik. (6a, b kép) Immunhisztokémiai reakciókkal párhuzamosan Western blot vizsgálat agy, gerincvelő és lép mintákon egyaránt 45kDa-nál egyetlen sávot mutat. A különböző mintákban kapott sávok intenzitásának erőssége nem egyforma, a lépben kissé erősebb jel látható az agyi, illetve gerincvelői mintákhoz képest. (6.c kép) A vad típusú és a K.O. gerincvelői mintákat szimultán vizsgáltunk Western blottal az adott antitestre. A vad típusú mintában határozottan egyetlen sáv látható, míg a K.O. minta teljesen üres. (6. d kép) 6.a kép: Abcam 45942, Black6, 10x 6.b kép: Abcam 45942, CB2 K.O., 10x 22

6.c kép: Western blot agy, gerincvelő, lép mintákban anti-cb2 Abcam AB45942 antitesttel 6.d kép: Western blot CB2 K.O. és vad típusú egerek gerincvelői mintáiban anti-cb2 Abcam AB45942 antitesttel Az antitestek specificitásának vizsgálata során a Sigma és az Alomone antitestek esetén a DAB reakció eredménye egyáltalán nem mutatott különbséget a Black6, illetve a CB2 K.O. minták között. A Cayman és a Tocris antitestek is hasonló festődési mintázatot mutattak a vad és a K.O. állatokban, habár a K.O. állatok festődési intenzitása sokkal kisebb volt, mint a vad típusúaké. A Western blottokon több, különböző intenzitású sáv látható az egyes mintákban. Az Abcam AB 3561 antitest esetén a vad típusban nagyon gyenge pontszerű festődés figyelhető meg a hátsó szarv I-II. lamináiban. A K.O. mintában ehhez képest jelölés szinte egyáltalán nem látható. A blot képén mindhárom mintában több immunreaktív sáv látható, de a lépben látható sáv intenzitása sokkal erősebb. Az Abcam AB 45942 antitesttel a vad típusú állatok metszetein erős pontszerű immunfestődést kaptunk. A CB2 K.O. mintákból ez a festődési mintázat teljesen eltűnt. A CB2 K.O. állatokon ezzel az antitesttel nem kaptunk immunfestődést. A blotton mindhárom mintában egyetlen immunreaktív sáv jelent meg kicsit eltérő intenzitással. 23

Az immunhisztokémiai és a Western blot vizsgálatok alapján az Abcam anti-cb2 AB 45942 antitest tűnt a legmegfelelőbbnek a teszteltek közül. További kísérleteinket az Abcam anti-cb2 AB 45942 antitestjével végeztük. 6.2. Az CB2 receptorok megoszlásának vizsgálata patkányban: A továbbiakban a kiválasztott antitesttel elsőként DAB reakcióval vizsgáltuk a receptor megoszlását patkány gerincvelő szürkeállományának hátsó szarvában. A 10x nagyítású felvételen a patkány gerincvelő hátsó szarvában elszórtan, mind a felszínes, mind a mélyebb laminákban immunreaktivitás figyelhető meg folt-, illetve pontszerű jelölés formájában. (7.a kép) A nagyobb nagyítású felvételen látható, hogy a hátsó szarv II. laminájára főként a kisebb és nagyobb foltok megjelenése, míg az I. laminájára zömmel a pontszerű jelölés a jellemző. (7.b kép) 7.a kép: Abcam 45942, patkány, 10x 24

7.b kép: Abcam 45942, patkány, 20x A megoszlás pontosabb meghatározásának céljából végzett fluoreszcens alapú immunhisztokémiai reakcióink co-lokalizációt engednek feltételezni a CB2 receptor és mikroglia, illetve astrocita sejtek között. A 60x-os nagyítású konfokális felvételeken (kalibráció: 5µm) a mikrogliák, illetve astrociták sejtestjei és nyúlványai szépen kirajzolódnak. (8.a, 9.a, 10a kép) A CB2 jelölés pont, illetve foltszerű festődést mutat. (8.b, 9.b, 10b kép) A mikroglia sejtek esetén a CB2 receptor főként a sejttestben helyezkedik el, megjelenése a nyúlványokon nem jellemző. (8.c, 9.c kép) Az astrocita sejteket tekintve a CB2 receptort a nyúlványokon figyelhetünk meg. A co-lokalizáció mértéke ebben az esetben szemmel láthatóan kisebb, mint a mikroglia sejtek esetén. (10.c kép) 8.a kép: CD11b (AbD Ser.) 8.b kép: CB2 8.c kép: összevetített (CD11b+CB2) patkány, 60x patkány, 60x patkány, 60x 25

9.a kép: CD11b (Bachem) 9.b kép: CB2 9.c kép: összevetített (CD11b+CB2) patkány, 60x patkány, 60x patkány, 60x 10.a kép: GFAP 10.b kép: CB2 10.c kép: összevetített (GFAP+CB2) patkány, 60x patkány, 60x patkány, 60x 26

7. Következtetések, javaslatok: Eredményeink az irodalmi adatokkal egybehangzóan azt mutatják, hogy a CB2 receptor a gerincvelő hátsó szarvában mikroglia és astrocita sejteken egyaránt megtalálható. A CB2 receptor gerincvelő hátsó szarvában való megoszlásának pontosabb meghatározásához további vizsgálatokra van szükség. Elektron mikroszkópos vizsgálatok segítségével a CB2 receptor sejtes elemeken való lokalizációja pontosabban meghatározható. A CB2 receptor és a mikroglia, illetve astrocita sejtek fluoreszcens alapú kettős festéséről készült konfokális felvételek kvantitatív elemzése pontosabb képet adhat a co-lokalizáció mértékéről. A CB2 receptor aktiválásáról, működéséről és megoszlásáról a gerincvelő hátsó szarvában bővebb információt nyerhetnénk, ha azt különböző fájdalom modellekkel vizsgálnánk. 27

8. Összefoglalás: Az endocannabinoid rendszer működése és aktivitása a szervezet legtöbb szövetében és szervében igazolt, szerepet játszik számos fiziológiai és patológiai folyamatban. A CB2 elsősorban az immunrendszer sejtjeiben, valamint a hemopoetikus rendszerben expresszálódik. Sikerült kimutatni a központi idegrendszerben, agyi és gerincvelői szinten egyaránt, viszont pontos megoszlását és működésének mechanizmusát nem ismerjük. A CB2 receptor gerincvelői szinten betöltött szerepének és működésének megismerése érdekében célul tűztük ki a CB2 receptor megoszlásának vizsgálatát a gerincvelő hátsó szarvában. A kereskedelmi forgalomban kapható CB2 antitestek közül ki akartuk választani azt, amelyik specifikusan képes kimutatni a CB2 receptorokat az általunk használt kísérleti állatok, patkányok és egerek gerincvelőjének hátsó szarvában. A specifikusnak talált antitesttel vizsgálni akartuk a CB2 receptor megoszlását a lumbalis gerincvelői szürkeállomány hátsó szarvában. A rendelkezésünkre álló antitestekkel DAB és fluoreszcens alapú immunhisztokémiai reakciót végeztünk a CB2 receptor kimutatására vad típusú (Black 6), illetve CB2 K.O. egerek lumbalis gerincvelői szakaszaiból származó metszeteken. Az immunhisztokémiai reakciókkal párhuzamosan Western blot vizsgálatokat is végeztünk annak érdekében, hogy kiválaszthassuk a legspecifikusabb antitestet további vizsgálataink céljára. Az immunhisztokémiai és a Western blot vizsgálatok alapján az Abcam anti-cb2 AB 45942 antitest tűnt a legmegfelelőbbnek a teszteltek közül. További kísérleteinket az Abcam anti-cb2 AB 45942 antitestjével végeztük. A kiválasztott Abcam ab45942 antitesttel a továbbiakban patkány gerincvelő lumbalis szegmentumának metszetein fluoreszcens alapú immunhisztokémiai kettős jelöléses reakciókkal mikroglia (CD11b) és astrocita (GFAP) markerekkel kívántuk meghatározni azt, hogy a CB2 receptor gliasejteken, vagy neuronokon lokalizálódik-e a gerincvelő hátsó szarvában. A CB2 jelölés pont, illetve foltszerű festődést mutat. A mikroglia sejtek esetén a CB2 receptor főként a sejttestben helyezkedik el, megjelenése a nyúlványokon nem jellemző. 28

Az astrocita sejteket tekintve a CB2 receptort a nyúlványokon figyelhetünk meg. A colokalizáció mértéke ebben az esetben szemmel láthatóan kisebb, mint a mikroglia sejtek esetén. Eredményeink az irodalmi adatokkal egybehangzóan azt mutatják, hogy a CB2 receptor a gerincvelő hátsó szarvában mikroglia és astrocita sejteken egyaránt megtalálható. A CB2 receptor gerincvelő hátsó szarvában való megoszlásának pontosabb meghatározásához további vizsgálatokra van szükség. Elektronmikroszkópos, illetve további fluoreszcens alapú immunhisztokémiai vizsgálatok és a reakciókról készült konfokális felvételek kvantitatív elemzésének eredményei eddigi eredményeinkkel együttesen nézve pontosabb képet kaphatnánk a CB2 receptor megoszlásáról a gerincvelő hátsó szarvában. 29

9. A szakirodalom jegyzéke: 1) Ashton JC., Glass M. (2007) The cannabinoid CB2 receptor as a target for inflammation-dependent neurodegeneration. Curr Neuropharmacol, 5, 73-80. 2) Beltramo M., Bernardini N., Bertorelli R., Campanella M., Nicolussi E., Fredduzzi S., et al. (2006) CB2 receptor-mediated antyhyperalgesia: possible direct involvment of neural mechanisms. Eur. J. Neurosci., 23, 1530-1538. 3) Borner C., Smida M., Hollt V., Schraven B., Kraus J. (2009) Cannabinoid receptor type 1- and 2-mediated increase in cycle AMP inhibits T cell receptor-triggered signaling. J. Biol. Chem., 284, 35450-35460. 4) Buckley N. E., McCoy K. L., Mezey E., Bonner T., Zimmer A., Felder C. C., et al. (2000) Immonulomodulation by cannabinoids is absent in mice deficient for the cannabinoid CB(2) receptor. Eur. J. Pharmacol, 396, 141-149. 5) Cabral G. A., Raborn E. S., Griffin L., Dennis J., Marciano-Cabral F. (2008) CB2 receptors in the brain: role in central immune function. Br. J. Pharmacol, 153, 240-251. 6) Derocq J-M., Jbilo O., Bouaboula M., Se gui M., Cle` re C., Casellas P. (2000) Genomic and Functional Changes Induced by the Activation of the Peripheral Cannabinoid Receptor CB2 in the Promyelocytic Cells HL-60, The Journal of Biological Chemistry 275, 21: 15621 15628 7) Di Marzo V., (1998) 2-Arachidonoyl-glycerol as an "Endocannabinoid": Limelight for a Formerly Neglected Metabolite, Biochemistry, (63), 1: 13-21. 8) Dittel B. N. (2008) direct supression of autoreactive lymphocytes int he central nervous system via the CB2 receptor. Br. J. Pharmacol, 153, 271-276. 9) Gaoni Y., Mechoulam R. (1964) Isolation, structure and partial synthesis of an active constituent of hashish. J Amer Chem Soc 86:1646-7. 10) Griffin G., Fernando S. R., Ross R. A., McKay N. G., Ashford M. L., Shire D. (1997) et al. Evidence for the presence of CB2-like cannabinoid receptors on nerve terminals. Eur. J. Pharmacol, 339, 53-61. 30

11) Hohmann A. G., Herkenham M. (1999a) Cannabinoid receptors undergo axonal flow in sensory nerves. Neuroscience, 92, 1171-1175. 12) Hohmann A. G., Herkenham M. (1999b) Localization of central cannabinoid CB1 receptor messenger RNS in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: a double-label in situ hybridization study. Neuroscience, 90, 923-931. 13) Liu Q. R., C. H., Hishimoto A., Li C. Y., Xi Z.X., Llorente-Berzal A., Viveros M. P., Ishiguro H., Arinami T., Onaivi E. S., Uhl G. R. (2009) Species differences in cannabinoid receptor 2 (CNR2 gene) identification of novel human and rodent CB2 isoforms, differential tissue expression and regulation by cannabinoid receptor ligands, Genes Brain Behav., 8, 519-530. 14) Maresz K., Pryce G., Ponomarev E. D., Marsicano G., Croxford J. L., Shriver L. P., et al. (2007) Direct supression of CNS autoimmune inflammation via the cannabinoid receptor CB1 on neurons and CB2 on autoreactive T cells. Nat. Med., 13, 492-497. 15) Matsuda L.A., Lolait S.J., Browstein M.J., Young A.C., Bonner T.I. (1990) Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cdna. Nature, 346:561-4. 16) Munro S., Thomas K.L., Abu-Shaar M. (1993) Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature, 365:61-5. 17) Nackley A. G., Zvonok A. M., Makriyannis A., Hohmann A. G. (2004) Activation of cannabinois CB2 receptors suppresses C-fiber responses and windup in spinal wide dynamic range neuron sin the absence and presence of inflammation. J. Neurophysiol, 92, 3562-3574. 18) O Sullivan S. E., Kendall D. A. (2010) Cannabinoid activation of peroxisome proliferator-activated receptors: Potential for modulation of inflammatory disease. Immunobiology, 215(8):611-6 19) Price D. A., Martinez A. A., Seilleier A., Koek W., Acosta Y., Frenandez E., et al. (2009) WIN 55, 212-2, a cannabinoid receptor agonist, protects against nigrostriatal cell loss int he 1-methyil-4-phenyl-1,2,3,6,-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson s disease. Eur. J. Neurosci., 29, 2177-2186. 31

20) Schatz A. R., Lee M., Condie R. B., Kaminski N. E. (1997) Cannabinoid receptors CB1 and CB2: a characterization of expression and adenylate cyclase modulation within the immune system. Toxicol Appl. Pharmacol, 142, 278-287. 21) Sherwood T. A., Nong L., Agudelo M., Newton C., Widen R., Klein T. W. (2009) Identification of transcription start sites and preferential expression of select CB(2) transcripts in mouse and human B lymphocytes. J. Neuroimmune Pharmacol., 4(4):476-88. 22) Shire D., Calandra B., Rinaldi-Carmona M., Oustric D., Pessegue B., Bonnin- Cabanne O. et al. (1996). Molekular cloning, xpression and function of the murine CB2 peripheral cannabinoin receptor. Biochim Biophys Acta, 1307: 132-136. 23) Spiletz D. M., O Neill G. P., Favreau L., Dufresne C., Gallant M., Gareau Y., Guay D., Labelle, M., Metters K. M. (1995) Activation of the human peripheral cannabinoid receptor results in inhibition of adenylyl cyclase. Mol. Pharmacol., 48, 352-361. 24) Viscomi M. T., Oddi S., Latini L., Pasquariello N., Florenzano F., Bernardi G., Molinari M., Maccarrone M. (2009) Selective CB2 receptor agonisms protects central neurons from remote axotomy-induced apoptosis through the PI3/Akt pathway. J. Neurosci., 29, 4564-4570. 25) Zhang J., Hoffert C., Vu H. K., Groblewski T., Amad S., O Donnell D. (2003) Induction of CB2 recpetor expression int he rat spinal cord of neuropathic but not inflammatory chronic pain models. Eur. J. Neurosci., 17, 2750-2754. 26) Zoratti C., Kipmen-Korgun D., Obisow K., Malli R., Graier W. F. (2003) Anandamide initiates Ca (2+) signaling via CB2 receptor linked to phosphorilase C in calf pulmonary endothelial cells. Br. J. Pharmacol., 140, 1351-1362. 32

11. Mellékletek: Rövidítések: THC: Δ9-tetrahidrocannabinol CB1: cannabinoid 1-es receptor CB2: cannabinoid 2-es receptor PLC: foszfo lipáz C HL-60: humán leukocita sejtvonal ABC: avidin-biotin-komplex DAB: 3,3-diamino-benzidin PA: paraformaldehid PB: foszfát puffer PBS: sós foszfát puffer TRIS: tri-hidroxi-metil-amino-metán TPBS: TRIS-foszfát-puffer-saline b-gar: biotinilált goat anti rabbit GAR A. 555: goat anti rabbit Alexa 555 GAM A. 488: goat anti mouse Alexa 488 33

Ábrajegyzék: 1. ábra: Röhlich P. (2002) Idegrendszer, Szövettan, SE Képzéskutató, Oktatástechnológiai és Dokumentációs Központ, Budapest, 410. 2. ábra: www.upf.edu/cexs/actualitat/cb2receptors.html 3. ábra: Járai Z. (2006) Az endocannabinoid rendszer jelentősége, LAM Tudomány, 16, (12):1017-1024. 4. ábra: Derocq J-M., Jbilo O., Bouaboula M., Se gui M., Cle` re C., Casellas P. (2000) Genomic and Functional Changes Induced by the Activation of the Peripheral Cannabinoid Receptor CB2 in the Promyelocytic Cells HL-60, The Journal of Biological Chemistry 275, 21: 15621 15628 5. ábra: Di Marzo V., (1998) 2-Arachidonoyl-glycerol as an "Endocannabinoid": Limelight for a Formerly Neglected Metabolite, Biochemistry, (63), 1: 13-21. 34