DNS MARKEREK VIZSGÁLATA A BAROMFI ÁLLOMÁNYOK GÉNMEGŐRZÉSÉBEN Hidas András Kisállattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet, Gödöllő Bevezetés A genetikai kutatások forradalmi változásokon mentek át az elmúlt évtizedben. Az örökítő anyagról begyűjtött ismeretek gombamód szaporodtak csakúgy, mint a kutatómunkát elősegítő újabb és újabb módszerek. A kutatások során vehettük igazán csak észre, hogy mennyi megfejtendő információt hordoz akár csak egy egyszerű szervezet genetikai állománya. A fenotípusosan közvetlenül megfigyelhető változatosság (ami háziállatainkban nem csekély) is csak egy kis töredéke a genetikai anyagban előforduló variációknak. A genetikai kutatások fő célkitűzései attól függnek, mely területeken folytatják őket. A humán genetikai területen elsősorban örökletes betegségek, betegségekre való hajlam DNS-ben tárolt jelzőit, markereit és génjeit keresik. Egyre nagyobb figyelemmel követik napjainkban már a genetikai anyag kifejeződését ill. annak szabályozását is a különböző kóros folyamatokban. Az állattenyésztésben és a növénytermesztésben a termelési értékmérők alakulásában fontos szerepet játszó gének, génváltozatok markereinek keresése a fő cél, hogy ezek azonosításával megvalósulhasson a markereken alapuló szelekció. Ez a kutatómunka rengeteg DNS markert tárt fel különböző fajokban, amelyek kisebb-nagyobb mérvű polimorfizmust mutatnak és igen alkalmasak egyedek, állományok genotipizálására. Különösen jelentősek a nem aktív génekben előforduló polimorfizmusok, mivel ezek nincsenek szelekciós hatás alatt, mutációval történő változásai neutrálisak a fenotípusra ill. a túlélésre, ezért fennmaradnak a generációk során. A fajták, állományok jellemzésére szélesebb körben alkalmazott módszerek Ma már szinte számtalan módszer létezik, amellyel DNS szekvencia változatokat detektálhatunk, ezek közül a genotipizálásban kettő terjedt el szélesebb körben: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markerek A módszer azon alapul, hogy önkényesen megválasztott szekvenciájú, 10-15 bázispár hosszúságú primerekkel indítunk polimeráz láncreakciót (PCR) viszonylag kevéssé szekvenciahű hibridizációt ill. polimerizációt megengedő reakciófeltételek mellett (Williams és mtsai 1990). Amennyiben a primerek
kötődési helyei elég közel vannak egymáshoz a genomban, akkor különböző fragmentek szintetizálódnak, amelyeket gél elektroforézissal lehet kimutatni. A képződő fragmentek száma a primertől, fajtól és reakciófeltételektől függően 5-20 körül lehet, amelyek között szintén változó számban találunk variábilis elemeket (1.ábra). A detektálható polimorfizmusok forrása lehet a primer kötési helyeinek megléte vagy hiánya (szekvenciaváltozása) egy adott lokuszon illetve a primer kötési helyek eltérő távolsága (deléciós vagy inszerciós helyek). A módszer előnye, hogy a genom előzetes ismerete nélkül is alkalmazható egy újonnan vizsgálandó fajon. Egyszerre több lokusz vizsgálható, tehát egy lépésben több polimorfizmus detektálható. A primerek tetszőleges kialakításával esetleg párosításával igen sok genetikai marker azonosítható. A RAPD markerek domináns jellegűek, ritkán azonban több allél is megfigyelhető. Viszonylag egyszerű módszer: egy polimeráz láncreakció és azt követő gélelektroforézis. Mivel a vizsgálati lehetőségek szinte korlátlanok (a tervezett primerek sokfélesége), a genotipizálás finomsága, felbontása a megválasztott primerek számától függ csak és szinte egyedi azonosítás érhető el vele. Kisállatoknál ez azonban ritkán cél, gyakoribb igény a fajták, állományok azonosítása, megkülönböztetése, amire ez a módszer jó lehetőséget nyújt (Smith és mtsai 1996; Wei és mtsai 1997) Régi igény a származásellenőrzés megoldása a baromfi állományok esetében, amihez jó adalékokat nyújtottak vizsgálataink az őshonos és a köztenyésztésben álló fajták összehasonlításával. Megállapítottuk, hogy állományok kevert mintáival is nagyon jól elkülöníthető a fajták DNS markerek segítségével, ami a gyakorlati származásellenőrzésben is jó eszközt nyújt. 1. ábra: Egy tipikus RAPD elektroforézis kép (Typical RAPD electrophoretogramm) 2. ábra: Mikroszatellita allélek (Microsatellite alleles)
Mikroszatellit markerek A mikroszatellitek (2. ábra) abba a repetitív szekvencia családba tartoznak, amelyben igen egyszerű, 1-4 bázis ill. szekvencia ismétlődik egy szakaszon, ugyanakkor a kópiaszám nagy mértékű variabilitást mutat. A mikroszatellitek viszonylag egyenletesen oszlanak el a genomban, ami igen jó lehetőséget nyújt a géntérképezéshez, a nagy marker variabilitást pedig igen jól lehet hasznosítani egyedi ill. fajtaazonosításban és genetikai összehasonlításokban is (Crooijmans és mtsai 1996; Takahashi és mtsai 1998; Zhou és mtsai 1999; Romanov és Weigend 2001). Előnye a RAPD módszerrel szemben, hogy egy lókuszon a heterozigócia is detektálható (kodominancia) és több allél is előfordulhat. Viszonylagos hátránya, hogy többé-kevésbé fajspecifikusak,ill. csak részlegesen használhatók a közel rokon fajoknál is. Az egyes lokuszokra specifikus primerszekvenciákat kell tervezni, aminek előfeltétele természetesen, hogy szekvencia ismerettel rendelkezzünk a genom mikroszatelliteket hordozó fragmentjeiről. Ezért a mikroszatellit markerek kifejlesztése jelentős előmunkálatokat igényel. További hátrányai a módszernek, hogy nagy értékű szekvenáló elektroforézises készülékeken lehet csak hatékonyan vizsgálni őket, mivel a különböző allélek nem ritkán csak 1-4 bázispárban térnek el egymástól ill. az allélek pontos beazonosítása is ilyen felbontású futtatást igényel. Költségesebb ez a vizsgálat azért is, mert egy PCR reakcióban csak egy lókuszra nyerünk információt. Lehetséges ugyan multiplex PCR alkalmazása is, több lókusz amplifikálása közös elegyben és protokollal, ez azonban újabb további optimalizálásokat igényel. Molekuláris genetikai markerek révén nyert információk alkalmazása Molekuláris genetikai markerekkel számos kalkulációt végezhetünk és gyakoriságuk puszta megállapítása mellett további információkat nyerhetünk az állományokon belüli értékelésekben,pl. polimorfizmus %: a fajban ismert variábilis markerek milyen hányada mutat változatosságot az adott állományban; heterozigozitás szint, fragmentmintázat hasonlóság: az állomány homogenitására utaló jelző számok (Zhu és munkatársai 1996a, 1996b). Az állományok összehasonlítására a genetikai távolság (hasonlóság) becslése az alkalmas megközelítés (Nei 1972). További nagy jelentősége van a molekuláris genetikai markereknek az állományok beltenyésztettségi szintjének becslésére. Különösen a génmegőrzésben szerepet játszó állományoknál nagy jelentősége lenne az erre vonatkozó információknak. Sajnos többségük esetében az állományok eléggé viszontagságos körülmények között cseréltek gazdát néhány évenként, ami azt is jelentette egyben, hogy gyakorlatilag semmilyen pedigré adattal nem rendelkeznek jelenlegi tenyésztőik saját tenyésztési programjaikat megelőző időszakokról. Ezért azután legfeljebb fenotípusos jegyek (leromlás) alapján
gyanakodhatunk a súlyosabb beltenyésztettségre. Hosszabb távra visszamenőleg ismert pedigrével és viszonylag pontosan kalkulálható beltenyésztési együtthatóval rendelkező tyúk- és pulykaállományoknál Zhu és munkatársai (1996b) kapcsolták össze a pedigré alapján számolt beltenyésztettséget és a DNS fingerprinting mintázatokból számított hasonlóságot. Az általuk felállított regressziós egyenes megbízható becslési alapot nyújt a beltenyésztettségre az állományok molekuláris genetikai adatai alapján. Az európai biodiverzitás tyúkfajtákban történő, mikroszatellita markerekkel történő vizsgálata jelentős lépés volt a géntartalékok vizsgálatában. Ebben a vizsgálatban számos, köztenyésztésben levő ill. őshonos, génbankokban fenntartott állományokat vizsgáltak 25 mikroszatellita lókuszon (Rosenberg és mtsai 2001). A kutatócsoport az elért eredmények alapján ajánlotta a FAO számára ezeknek a markereknek az elfogadását, mint összehasonlíthatóságot lehetővé tevő eszközt. Ezek a markerek az eddig vizsgált fajtákban meglehetősen nagy variabilitást mutattak és viszonylag finom felbontású genetikai összehasonlításokat tesznek lehetővé. A molekuláris genetikai analízisek révén nyert információk génmegőrzésben való közvetlen használata körül ma még nincs teljes konszenzus. Kezdetben a genetikai távolságok számításával értékelték a fajtákat, ami azt jelentette, hogy génmegőrzési szempontból azok a legértékesebb fajták, amelyek a többitől legjobban eltérnek a markerek tekintetében. Újabb keletű szempont a megőrzendő állományok belső genetikai szerkezete is, azaz mekkora méretű variabilitást mutatnak. Ez a mutató természetesen jelentősen függ a fajta állományának történetétől, előfordult-e jelentős létszámcsökkenés a teljes állományt vagy csak a használt apaállatok számát illetően. Az aktuálisan mutatott genetikai variabilitás ezért jobban függ a fajta tenyésztésének múltjától, mint a jelenlegi állománymérettől. A fajták további értékelési szempontjai lehetnek a fajták ismert értékmérői, különleges, egyedi tulajdonságai (rezisztencia, húsminőség, stb.), amelyek természetesen magasabb értéket kölcsönöznek a fajtának. Időnként kérdéses, hogy maguk a DNS markerek mennyiben elegendőek egy fajta vagy egy állomány állomány értékeléséhez ugyanis jelentős különbségek lehetnek a gének expressziójában, ami már a genom működési szabályozási folyamatait érinti. A markerek azért nem lehetnek annyira átfogóak, hogy mellettük ne lehetnének még állomány-specifikus gének, génváltozatok. A génmegőrzést szolgáló tenyésztés egyik fő feladata a ritka allélek megőrzése, ami igen nehéz feladat, mert a genetikai állomány túlnyomó része nem szemmel
látható, feltűnő módon fejeződik ki. Az effektív populáció maximális szinten való tartása lehet erre megoldás, azonban ez rendkívül költséges megoldás. A molekuláris genetikai markerek nyújthatnak némileg segítséget a tenyészkiválasztásban. Intézetünkben régi hagyományai vannak az ilyen vizsgálatoknak. Ma már nyugdíjas kollégánk, Dr.Papp Miklós vércsoport vizsgálatokkal kimutatott markerekkel genotipizálta hosszú éveken keresztül az őshonos tyúkállományokban jelenlévő allélek gyakoriságát ill. azok változását a generációk során (Papp 1991; Papp és mtsai 1992). Amennyiben valamely fajtában marginális helyzetbe került egy-egy allél gyakorisága, azt a tenyésztő felé jelezve, el lehetett kerülni eltűnését az állományból. A Kisállattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézetben 4 évvel ezelőtt kezdtük meg az őshonos baromfi állományok DNS markereinek felkutatását ill. azok előfordulását a különböző génbanki állományokban az OMMI megbízásából. Azóta több állományt (tyúk, pulyka, lúd, gyöngytyúk stb.) vizsgáltunk (Hidas, A.; Szalay 1999, Hidas és mtsai 2000,2002) és a szerzett tapasztalatok alapján sikerült valóban állományszintű, hatékony genotipizálási rendszert kialakítanunk. A génbanki állományokban egyedi DNS-minták vizsgálatával foglalkozunk, hiszen nem csak az állományok összehasonlítása a fő szempont, hanem az állományon belüli genetikai szerkezet vizsgálata, valamint a ritka allélek és hordozóik felderítése. Vizsgálataink általában az adott állománynak szinte minden egyedére kiterjednek, mivel általában csak 200 körüli tojó létszámot jelentenek a hozzá tartozó kakasokkal. Érdekes tapasztalat, a rendkívül ritka allélek megfigyelése (1-2 egyed az állományban), amelyek oly gyér előfordulásúak, hogy már az új mutáció gyanúja is felmerülhet. Ugyanis gyakoriság alapján a polimorfikus változatot a mutációtól ilyen alapon lehet elkülöníteni. Ford (1940) szerint ugyanis polimorfizmusnak az a genetikai változat tekinthető, ami nagyobb arányban fordul elő egy populációban, mint ahogy azt a visszatérő mutációk gyakorisága lehetővé tenné. Természetesen a RAPD markerek esetében a mutációs gyakoriságot igen nehéz lenne becsülni, mert ahhoz meg kellene keresni a genomban azt a lokuszt, azt a szekvenciát, aminek az eltérése lehetővé teszi egy adott RAPD reakcióban egy konkrét DNS fragmentum amplifikációját. Ilyen kis populációknál igen könnyen kerülhet egyegy allél ilyen marginális helyzetbe. Az őshonos állományok markervizsgálatai több érdekes biodiverzitástól független megfigyelést is lehetővé tehet. Ilyen vizsgálataink során találtunk pl. nőivarra (W-kromoszómára) specifikus RAPD fragmenteket a tyúk, gyöngytyúk és pulyka esetében is, ami az ivarmeghatározásban segíthet pl. embrionális ill. egyéb szöveteknél, sejteknél (Hidas és Edvi 2001).
További kutatásaink során folyamatosan fejlesztjük módszereinket, hogy minél hatékonyabb, nagyobb felbontású genotipizálást végezhessünk el értékes génbanki állományainkon és feltárhassuk egyedülálló genetikai értékeiket. Irodalom Crooijmans, R.P.M.A.-Groen, A.F.-van Kampen, A.J.A.-van der Beek, S.-van der Poel-Ford, E.B (1940): Polymorphism and taxonomy. The new Systematics (J. Huxley ed.) p. 493-513. Oxford Univ. Press (Clarendon) London and New York. Groenen, M.A.M. (1996): Microsatellite polymorphism in commercial broiler and layer lines estimated using pooled blood samples. Poultry Sci. 75. 904-909. Hidas, A.-Szalay, I. (1999): Identification of RAPD markers in fowl stocks maintained in a gene conservation programme. Proc. 1st Poultry Genetics Symposium,. 6-8. October, Mariensee, (Germany), 118. Hidas, A.-Szalay, I.-Koppány, G.-Sófalvy, F. (2000): RAPD marker analysis of domestic fowl stocks maintained in a Hungarian gene conservation programme. Proc. XXI. World's Poultry Congress,. 20-25. August, Montreal (Canada) P.8.03. Hidas, A.-Koppány, G.-Mihók, S.-Edviné Meleg, E.-Szalay, I. (2002): DNS polimorfizmusok (RAPD) vizsgálata pulyka génbanki állományokban. In: Innováció, a tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában (Szerk.: Jávor, A. és Magyar, K.) Debrecen, 35-41. Hidas, A.-Edvi, M.E. (2001): Sex determination with RAPD markers. Proc. 2nd Poultry Genetics Symposium, 12-14. Sept. Gödöllő, (Hungary), 89. Nei, M. (1972): Genetic distance between populations. Am. Nat. 106. 283-292. Papp, M. (1991): Utilization of immunogenetic studies for gene conservation of the Hungarian native chicken breeds. Word Conf. Gene Conserv. Rare Breeds Survival, Budapest. Papp, M.-Koppány, G.-Kovács, I. (1992): Utilization of blood group examination for gene conservation of Hungarian native poultry breeds. Intern. Conf. Gene Conserv., Üllõ, Hungary. Romanov, M.N.-Weigend, S. (2001): Analysis of genetic relationships between various populations of domestic and jungle fowl using microsatellite markers. Poultry Sci. 80. 1057-1063. Rosenberg, N.A.-Burke, T.-Elo, K.-Feldman, M.W.-Freidlin, P.J.-Groenen, M.A.M.-Hillel, J.-Maki-Tanila, A.- Tixier-Boichard, M.-Vignal, A.-Wimmers, K.-Weigend, S. (2001): Empirical evaluation of genetic clustering methods using multilocus genotypes from 20 chicken breeds. Genetics 159. 699-713. Smith, E.J.-Jones, C.P.- Bartlett, J.-Nestor, K.E. (1996): Use of randomly amplified polymorphic DNA markers for the genetic analysis of relatedness and diversity in chickens and turkeys. Poultry Sci. 75. 579-584. Takahashi, H.K.-Nirasawa, K.- Nagamine, Y.-Tsudzuki, M.-Yamamoto, Y. (1998): Genetic relationships among Japanese native breeds of chicken based on microsatellite DNA polymorphism, J. Hered. 89. 543-546. Wei R.-Dentine M.R.-Bitgood J.J. (1997): Random amplified polymorphic DNA markers in crosses between inbred lines of Rhode Island Red and White Leghorn chickens. Animal Genetics 28. 291. Williams J.G.K.-Kubelik R.A.-Livak K.J.-Rafalski J.A.-Tingey S.V. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18. (22) 6531. Zhou, H.J.-Lamont, S.J. (1999): Genetic characterization of biodiversity in highly inbred chicken lines by microsatellite markers. Anim. Genet. 30. 256-264. Zhu, J.- Nestor, K.E.-Patterson, R.A.-Jackwood, D.J.-Emmerson, D.A. (1996a): Measurement of genetic parameters within and between turkey lines using DNA fingerprinting. Poultry Sci. 75. 439-446. Zhu, J.-Nestor, K.E.- Moritsu, Y. (1996b): Relationship between band sharing levels of DNA fingerprints and inbreeding coefficients and estimation of true inbreeding in turkey lines. Poultry Sci. 75. 25-58. Summary The revolutionary development of the genetic investigation methods greatly affected the gene conservation work as well. Since the largest part of the genome is hidden, very difficult and doubtful to evaluate genetic pools simply from their phenotypes. Two main types of the new methods are discussed concerning their utilization in genotyping breeding stocks of unique genetic value. Utilization of data obtained from molecular genetic markers (RAPD and microsatellites) is getting more and more sophisticated to describe investigated populations in details. Some new observations and experience accumulated in
the more than for years of population studies on the Hungarian gene conservation chicken, turkey, goose and guineafowl stocks are also discussed. During this investigations beside the calculations of genetic data from the investigated populations for their genetic structure, inbreeding level and their distance from other stocks, new tools were also achieved for poultry parentage testing at population level. Further research is going on to improve genotyping power of our methods.