Kovács Csilla Sándor Erzsébet Peles Ferenc Szőlőtőkékből izolált endofita Trichoderma izolátumok micéliális növekedése és kompetíciós képessége Mycelial growth rate and mycoparasitic ability of endophytic Trichoderma isolates from grapevine trunks k.csilla20@gmail.com Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, PhD. hallgató Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, egyetemi docens Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, adjunktus Összefoglalás A szőlő tőkeelhalás (GTD) napjainkban az egyik legfontosabb betegség világszerte, mely már hazai ültetvényekben is jelen van. A Trichoderma fajokat már korábban is használták biopeszticidként különböző kórokozó gombák ellen. A nemzetség az Ascomycota törzs, Sordariomycetes osztály, Hypocreaceae családjába sorolható. Vizsgálataink célja a tokaji borvidékről, szőlőtőkékből származó Trichoderma izolátumok micéliális növekedésének és kompetíciós képességének vizsgálata volt. A vizsgálat tíz Trichoderma izolátum közül nyolcat molekuláris markerek (ITS1,2 és tef1 szekvenciák) alapján Trichoderma harzianum, Trichoderma orientalis fajként, illetve Trichoderma viride fajcsoportba tartozó fajként azonosítottuk. A növekedést Petri-csészén, burgonya-dextróz agar táptalajon mért micéliális növekedés alapján, a gombatelep két átmérőjének átlagából határoztuk meg. Az egyes Trichoderma izolátumok micéliális növekedését eltérő hőmérsékletek (18,5; 22,5; 25; 30 és 37 C) beállításával, négy napon keresztül, három ismétlésben mértük. A TR05 (T. harzianum) és a TR06 (T. orientalis) izolátumok minden vizsgált hőmérsékleten erőteljes növekedést mutattak. Minden vizsgált izolátum biokontroll indexe 100% volt a GTD kórokozóként ismert Diplodia seriata gombával szemben. Kulcsszavak: Trichoderma sp., biopeszticid, micéliális növekedés, mikoparazita képesség, szőlőtőke elhalás BEVEZETÉS A szőlő tőkeelhalás (GTD) napjainkban az egyik legfontosabb betegség világszerte, mely már hazai ültetvényekben is jelen van. A tőkeelhalásban különböző kórokozó gombák szerepét bizonyították, melyek közül a legfontosabbak a Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata, Fomitiporia mediterranae, Diplodia seriata (Bertsch et al., 2012). 180
A gombaspórák főként a metszési sebeken keresztül jutnak be a növénybe. Védekezési lehetőségként a betegség ellen a megfelelő higiéniás fertőtlenítés alkalmazása, valamint fertőzés csökkentésére irányuló fitotechnikai eljárások (például fertőzött oltványok kiszűrése) jelenthetnek a megoldást. Jelenleg sajnos nincs olyan hatékony fungicid, mely a betegség ellen hatásosan alkalmazható lenne. A nátrium-arzenitet, melyet korábban Nyugat-Európában alkalmaztak a betegség kezelésére (Mugnai et al., 1999), környezetre gyakorolt toxikus és karcinogén hatása miatt betiltották. Manapság a különböző fungicidekkel és a biológiai védekezési lehetőségekkel foglalkozó kutatások elsősorban a metszési sebek védelmére irányulnak (Halleen et al., 2010). A Trichoderma (teleomorf: Hypocrea) fajok talajlakó mikoparaziták, melyek antagonista képességgel rendelkeznek és mikotoxikus vegyületeket termelnek (Kubicek et al., 2007). Biopeszticidként különböző növényi kórokozó gombák ellen alkalmazzák. A nemzetség az Ascomycota törzs, Sordariomycetes osztály, Hypocreaceae családjába sorolható. A Trichoderma fajok konídiumtartói hifákon képződnek, konídiumai egysejtűek, melyeket nagytömegben fehér szín vagy zöld árnyalat jellemez. A hifafonalak rendkívül vékonyak, innen eredeztetik a faj nevét is, mely a görög tricho (hajszál) szó jelentéséből származik. Növekedésük optimális hőmérséklete 25-30 C között van. Gyors növekedésüknek és mikoparazita aktivitásuknak köszönhetően kiszorítják a patogén kórokozókat a növény környezetéből. A Trichoderma fajok biológiai védekezésben nyújtott szerepe 1930 óta ismert. A növény kórokozókkal szembeni ellenállása is növelhető egyes Trichoderma törzsekkel, a szisztémás és lokális védekezés indukálása révén (Harman et al., 2004). Vizsgálatok bizonyították, hogy az Eutypa lata okozta betegség előfordulási gyakorisága jelentősen csökkent a Trichoderma kezelések hatására a kontroll mintákhoz képest (Tran, 2010). Weindling 1932-ben részletesen leírta, hogyan pusztítja el a mikroparazita (hiperparazita) a kórokozó gombákat. A Trichoderma harzianum például rátekeredik a parazitált gomba hifájára (1. kép), majd hausztóriumot fejleszt, és kitináz enzimet termelve kilyukasztja a sejtfalát (Kotze et al., 2011). 1. kép: A Diplodia seriata köré tekeredő Trichoderma harzianum Fotó: Kovács Csilla A vizsgálat célja a tünetmentes szőlőtőkéről származó Trichoderma izolátumok micéliális növekedésének és kompetíciós képességének vizsgálata volt. ANYAG ÉS MÓDSZER 181 181
A mikrobiológiai vizsgálatokat a Debreceni Egyetem MÉK Élelmiszertudományi Intézet mikrobiológiai laboratóriumában végeztük el. A vizsgálatokhoz 10 Trichoderma izolátumot (TR01-TR10) használtunk, melyek a Tokaji borvidékről származtak. A Trichodermákat egészséges szőlőtőkékből izoláltuk. Micéliális növekedés A Trichoderma izolátumokat különböző hőmérsékleten növesztettük (18,5; 22,5; 25; 30 és 37 C). A növekedést Petri-csészén, burgonya-dextróz agar táptalajon mért micéliális növekedés alapján, a gombatelep két átmérőjének átlagából határoztuk meg. A különböző Trichoderma izolátumok kompetíciós képességének vizsgálata A mikoparazita képesség vizsgálatát Szekeres et al. (2006) által leírt módszer alapján végeztük el. A Trichoderma sp. és a Diplodia seriata fajokat burgonya-dextróz (PDA) táptalajon növesztettük. A kísérletekhez két napos Trichoderma és három napos Diplodia seriata izolátumokat használtunk. Először a növényi patogén (Diplodia seriata) leoltását végeztük el malátás agarra Schubert et al. (2008), a Petri-csésze közepétől 1,5 cm-re, majd 24 óra után pedig a Trichoderma micéliumot oltottuk le a patogéntől 3 cm-re. 10 nappal később készítettünk fotót a tenyészetről. 10 nap után meghatároztuk a Biokontroll Indexet (BCI). DNS izolálás A gombasejtek feltárását MagNaLyser (Roche) készülékkel végeztük el, majd a DNS izolálásához NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel) kitet használtunk. A DNS koncentrációkat NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) készülékkel mértük meg. Az izolált DNS-t 0,8% agaróz gélben történő futtatással ellenőriztük. PCR amplifikáció és szekvencia analízis Az ITS1 and ITS2 szakaszokat tartalmazó riboszómális DNS régió felszaporításához SR6R és LR1 univerzális primereket alkalmaztunk (Smolik et al., 2011). A Trichoderma fajokat a tef1 markerszekvencia (EF1 728F és EF1 986R) segítségével azonosítottuk (Carbone-Kohn, 1999; Druzhinina et al., 2005). A PCR termékek tisztításához NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) kitet alkalmaztunk. A szekvenciák meghatározását a Microsynth Austria GmbH végezte. A szekvenciákat a Trichoderma (TrichoBLAST http://isth.info/tools/blast/index.php) adatbázisba blasztoltuk. A szekvenciák összerendezését Clustal-X program segítségével végeztük el (Larkin et al., 2007). A filogenetikai törzsfákat a MEGA 6 programmal (Tamura et al. 2013) készítettük. Statisztikai értékelés A mikrobiológiai paraméterek és az egyes tényezők közötti összefüggés statisztikai vizsgálatához varianciaanalízist és Tukey-tesztet, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis próbát és Dunn-féle összehasonlító tesztet alkalmaztunk. 5%-os P-érték alatt tekintettük a próbákat szignifikánsnak. Az eredmények kiértékeléséhez GraphPad Prism 3.02 (Motulsky, 1999) statisztikai programokat használtunk. 182
EREDMÉNYEK Tíz Trichodema izolátum micéliális növekedését vizsgáltuk. A TR01-TR05 izolátumok hasonlóan növekedtek 18 és 25 C között (1. ábra). Az izolátumok 30 C hőmérsékleten növekedtek a leggyorsabban. Az izolátumok növekedésének mértéke 37 C-on csökkent, de ez a csökkenés nem volt szignifikáns. 1. ábra: TR01-TR05 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleteken A TR07-TR10 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése szignifikánsan alacsonyabb (P<0,05) volt 37 Con (2. ábra), mint a TR01-TR05 izolátumok esetén (1. ábra). Növekedésük 18,5 és 30 C között egyenletes volt. 2. ábra: TR07-TR10 Trichoderma izoátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleteken A két csoport (TR01-05 és TR07-10) két-két izolátumát a TR06-al összehasonlítva (3. ábra) jól látható, hogy a TR06 minden vizsgált hőmérsékleten szignifikánsan magasabb növekedési értéket mutatott. A TR01, TR04, és TR05 izolátumokra 37 C-on az alacsony növekedés volt jellemző, mely azonban nem volt szignifikáns. A TR08 183 183
és TR09 izolátumok viszont szignifikánsan alacsonyabb növekedési aktivitással rendelkeztek a többi izolátumhoz képest ezen a hőmérsékleten (3. ábra). 3. ábra: TR01, TR04, TR05, TR06, TR08 és TR09 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleten Trichoderma izolátumok kompetíciós képességének vizsgálata A 2. képen a TR07 izolátum és a Diplodia seriata kórokozó interakciója látható. A Biokontroll-index értéke 100% volt, vagyis a Trichoderma fajok a kórokozó Diplodia seriata fajokat túlnőtték. Jól látható volt a mikoparazita spóraképzése is. Az általunk vizsgált valamennyi Trichoderma izolátum azonos Biokontroll-index értéket mutatott. Minden esetben megfigyelhető volt a mikoparazita a pusztító hatása a Diplodia seriata patogén ellen (2. kép). Diplodia seriata Trichoderma TR07 2. kép: A Trichoderma harzianum és a Diplodia seriata interakciója Fotó: Kovács Csilla 184
A B 4. ábra: Az ITS 1, 2 (A), és a tef1 (B) szekvenciák alapján, a MEGA 6 programmal készített Maximum Likelihood törzsfa. A TR01-10 a saját izolátumokat jelöli, a fajnevek előtti számok a deponált szekvenciák azonosítója a GeneBank adatbázisban. Az elágazások hossza arányos a szekvenciákban található nukleotid eltérések számával, a skála alul található. A vonalak felett és mellett található kék számok a Bootstrap analízis (n=1000) eredményét mutatják. (Csak az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük). A szőlőtőkékről izolált Trichoderma fajok riboszómális DNS régiójának, és transzlációs elongációs faktor 2 (tef1) szekvenciája alapján a TR01-05, TR07, TR09 és TR10 izolátumok Trichoderma harzianum (tel. Hypocrea lixii) fajhoz tartoznak (4. ábra). A minden vizsgált hőmérsékleten a leggyorsabb növekedést mutató TR06 (3. ábra) az ITS1,2 szekvencia alapján a Trichoderma longibrachiatum csoportba, a tef1 szekvenciája alapján ezen belül a Trichoderma orientalis fajhoz tartozik. A TR08 az ITS1,2 szekvencia alapján a Trichoderma viride csoportba sorolható. A pontos faji identifikálást a későbbiekben a kitináz (Chit gén) szekvencia alapján végezzük el. A fenti szekvenciák felhasználásával ugyanezt a besorolást kaptuk TrichoBLAST programmal (1. táblázat). 1. táblázat: Trichoderma izolátumok identifikálásának eredménye ITS 1és 2 és tef1 rdns szekvenciák alapján, a TrichoBLAST program segítségével Izolátum megnevezése Besorolás ITS alapján Besorolás tef1 alapján Section 1 Pachybasium Trichoderma harzianum TR01-05, TR07, TR09, TR10 Clade 1 Harzianum (teleomorf: Hypocrea lixii) TR06 Section 2 Longibrahiatum Clade 14 Longibrachiatum T. orentalis 185 185
TR08 Section 4 Trichoderma: Clade 12 Viride - KÖVETKEZTETÉS ÉS ÖSSZEFOGLALÁS Eredményeink alapján elmondható, hogy az általunk vizsgált izolátumok 18,5 C-on alacsony növekedési aktivitással rendelkeztek, és a TR01-TR05 és TR07-TR10 izolátumok magasabb 37 C-on lassabb növekedést mutattak. A TR05 és TR06 izolátumokat minden vizsgált hőmérsékleten a többieknél szignifikánsan magasabb növekedés jellemezte, mely 30 és 37 C hőmérsékleten volt a legintenzívebb. A TR05 és TR06 izolátumok maximális biokontroll indexük (BCI=100%) alapján potenciális biopeszticideknek tekinthetők, hiszen tág hőmérsékleti határok között is aktív növekedésre képesek. A riboszómális DNS régió ITS1,2, illetve a transzlációs elongációs faktor 2 (tef1) szekvenciák alapján az izolátumokat Trichoderma harzianum, Trichoderma orientalis fajként, illetve Trichoderma viride fajcsoportba tartozó fajként azonosítottuk. További vizsgálataink célja az izolált Trichoderma fajok felhasználási lehetőségeinek vizsgálata a tőkeelhalás (GTD) visszaszorításában. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése konvergencia program című kiemelt projekt keretei között valósult meg. A publikáció elkészítését a TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024 számú, valamint a TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KONV- 2010-0007 számú projekt is támogatta. Sándor Erzsébet munkáját a Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata támogatta. A kutatások a COST FA1303 keretében zajlottak. SZAKIRODALMI JEGYZÉK Bertsch C., Ramírez-Suero M., Magnin-Robert M., Larignon P., Chong J., Abou-Mansour E., Spagnolo A., Clément C., F. Fontaine. (2012): Grapevine trunk diseases: complex and still poorly understood. Plant Pathology, 62. 2. 243-265. Carbone I., Kohn L.M. (1999): A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia, 91. 3. 553-556 Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., Komoj M., Bissett J., Szakacs G., Kubicek C.P. (2005): An oligonucleotide barcode for species identifcation in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology, 42. 813-828. 186
Jukes T.H., Cantor C.R. (1969): Evolution of protein molecules. In Munro HN, editor, Mammalian Protein Metabolism, Academic Press. New York, 21-132. Halleen F., Fourie P.H., Lombard P.J. (2010): Protection of grapevine pruning wounds against Eutypa lata by biological and chemical methods. South African Journal of Enology and Viticulture, 31. 125-132. Harman G. E., Howell C. R., Viterbo A., Chet I., Lorito M, (2004): Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology, 2, 1. 43-56. Kotze C., Niekerk J.V., Mostert L., Halleen F., Fourie P. (2011): Evaluation of biocontrol agents for grapevine pruning wound protection against trunk pathogen infection. Phytopathology Mediterranea, 50, Supplement, S247-S263. Kubicek C.P., Komon-Zelazowska M., Sándor E., Druzhinina I. (2007): Facts and challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols in Trichoderma. Chemistry and Biodiversity, 4. 1068-1082. Larkin MA.. Blackshields G., Brown NP.. Chenna R., McGettigan PA., McWilliam H., Valentin F., Wallace IM., Wilm A., Lopez R.,Thompson JD., Gibson TJ., Higgins DG. (2007): ClustalW and ClustalX version 2.0. Bioinformatics Advance Access, 2. Motulsky H. J. (1999): Analyzing Data with GraphPad Prism. GraphPad Software Inc., San Diego CA. 379. Mugnai L., A. Graniti A., Surico G. (1999): Esca (black measels) and brown wood-streaking: two old and elusive diseases of grapevines. Plant Disease, 83. 404-416. Schubert M., Siegfried F., Francis W.M.R. Schwarze F.W.M.R. (2008): Evaluation of Trichoderma spp. as a biocontrol agent against wood decay fungi in urban trees. Biological Control, 45. 111-123. Smolik M., Krupa-Małkiewich M., Smolik B., Wieczorek J., Predygier K. (2011): rdna Variability Assessed in PCR Reactions of Selected Accessions of Acer. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 39. 1. 260-266. Szekeres A., Leitgeb B., Kredics L., Manczinger L., Vágvölgyi Cs. (2006): A novel, image analysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. Journal of Microbiological Methods, 65. 619-622. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013): MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30. 2725-2729. Tran N.H.A. (2010): Using Trichoderma species for biological control of plant pathogens in Vietnam. Journal of International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences (ISSAAS) 16. 1. 17-21. Weindling R. (1932): Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology, 22. 837-845. 187 187