Egyetemi doktori (PhD) értekezés tézisei ÚJ MŰVI PORTO-CAVALIS SHUNT MODELL MIKROSEBÉSZETI MÓDSZEREKKEL VALÓ KIALAKÍTÁSA ÉS MICROCIRCULATIÓS, MICRO-RHEOLOGIAI VIZSGÁLATAI Dr. Klárik Zoltán Témavezető: Dr. Németh Norbert DEBRECENI EGYETEM Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola 2015
Új művi porto-cavalis shunt model mikrosebészeti módszerekkel való kialakítása és microcirculatiós, micro-rheologiai vizsgálatai Értekezés a doktori (PhD) fokozat megszerzése érdekében a klinikai orvostudományok tudományágban Írta: Dr. Klárik Zoltán okleveles általános orvos Készült a Debreceni Egyetem Klinikai Orvostudományok doktori iskolája (Klinikai vizsgálatok programja) keretében Témavezető: Dr. Németh Norbert, PhD A doktori szigorlati bizottság: elnök: Prof. Dr. Berta András, az MTA doktora tagok: Dr. Bereczky Zsuzsanna, PhD Dr. Ferencz Andrea, PhD A doktori szigorlat időpontja: Debreceni Egyetem ÁOK, Szemészeti Tanszék könyvtára 2015. június 8., 11 óra Az értekezés bírálói: Prof. Dr. Bogár Lajos, az MTA doktora Dr. Szokoly Miklós, PhD A bírálóbizottság: elnök: Prof. Dr. Berta András, az MTA doktora tagok: Prof. Dr. Bogár Lajos, az MTA doktora Dr. Bereczky Zsuzsanna, PhD Dr. Ferencz Andrea, PhD Dr. Szokoly Miklós, PhD Az értekezés védésének időpontja: Debreceni Egyetem ÁOK, Belgyógyászati Intézet A épület tanterme 2015. június 8., 13 óra 2
1. BEVEZETÉS A művi porto-cavalis shunt-ök olyan ér-anastomosisok, amelyeket a portalis és a szisztémás vénás keringés között hoznak létre megfelelő indikációk mellett. Ezek a shunt-ök a vena portae keringéséből vezetik el részlegesen vagy teljes mértékben a vért, így csökkentve a portalis hypertensiót és szövődményeinek kialakulását. A shunt típusa szerint teljesen vagy csak részlegesen vezeti el a vért a portalis keringésből és ennek megfelelően szelektív, illetve nem-szelektív megoldásokat különböztethetünk meg. A portalis hypertensio kezeléséhez napjainkban elsősorban farmakológiai kezelést használnak, de a sikertelen terápia és a portalis hypertensio szövődményei fokozódása esetén (varixok okozta vérzés) endoszkópos szkleroterápiát, valamint transjugularis intrahepaticus porto-szisztémás shunt-öt alkalmaznak. Sürgősségi, életmentő beavatkozások során (pl.: súlyos recurrens oesophagiás és gastric varixok vérzés) a mai napig a sebészi porto-cavalis anastomosisok készítése az elsődleges kezelési módszer, valamint a máj transplantatio recipiens műtét protokolljában a shunt-ök létrehozása az egyik előkészítő lépés. Állatkísérleti kutatásokban is gyakran alkalmaznak művileg elkészített porto-cavalis shunt-öket különböző laboratóriumi állatokban. A mikrosebészeti technikák térhódításával az ér-anastomosis modellek már egerekben, vagy patkányokban is könnyen kialakíthatóak. A sebészi biztonság növelése szempontjából a microcirculatio intraoperativ monitorizálása fontos információt adhat az érintett szövetek és szervek perfusiójáról különösen ér-anastomosisok készítése során. A megfelelő szöveti perfusio biztosításában a micro-rheologiai paraméterek (a vörösvérsejt deformabilitás és vörösvérsejt aggregatio) jelentős szerepet játszanak, ezért változásainak és a microcirculatióval való összefüggéseinek együttes vizsgálata hasznos lehet. 3
A vörösvérsejt-deformabilitása, passzív alakváltozási képessége elengedhetetlen a capillárisokon való áthaladáshoz, valamint a vörösvérsejt aggregatio, a sejtek reverzibilis összekapcsolódása befolyásolhatja az áramlás dinamikáját. Egy esetleges hosszan elnyúló ischaemia hatására a hemodinamikai változások kialakulása miatt akár irreverzibilis károsodás alakulhat ki az érintett szövetben. A kirekesztett régióban pangó vérben számos fizikai és metabolikus változás jöhet létre, amely reperfusiókor az egész szervezetre kifejtheti hatását. A mikrokörnyezeti változások fokozott aggregatiót és csökkent deformabilitás képességet okoznak, amely mikrokeringési zavarokhoz vezet. A vér ph csökkenése rontja a vörösvérsejt aggregatiót és deformabilitást, az alkalikus ph értékeknél a vörösvérsejtek elveszítik bikonkáv alakjukat, csökken a sejttérfogatuk. A vérgáz paraméterekben bekövetkező változások szintén befolyásolják a vér micro-rheologiai tulajdonságait. Az elmúlt évtizedben, modern haemorheologiai készülékek használatával egyre szélesebb körű adat áll rendelkezésre a micro-rheologiai tulajdonságokról. Bebizonyosodott, hogy a lokális, illetve szisztémás vörösvérsejt deformabilitási és aggregatiós változások különböző pathofiziológiai kórfolyamatokban (gyulladás, sepsis, ischaemia-reperfusio, metabolikus változások) nagy jelentőséggel bírnak. A szakirodalomban azonban számos kérdéskör még tisztázatlan, illetve ellentmondásos. A művi ér-anastomosis kialakítása során bekövetkező szervi microcirculatiós változások mértékéről és a műtéttel együtt járó ischaemiareperfusio hatására bekövetkező haemorheologiai változások microcirculatiót befolyásoló tulajdonságáról kevés adat ismert. Tisztázatlan kérdéskör még, hogy mennyiben tér el a micro-rheologiai paraméterek alapértéke egymástól különböző területekről vett vérmintákban (aorto-porto-cavalis különbség). Figyelembe véve az előbbiekben leírt különbségeket, feltehetjük azt a kérdést, hogy vajon a portalis keringésből nyert vérmintákban milyen haemorheologiai (vörösvérsejt aggregatio és deformabilitás) alapértékeket 4
találhatunk és ezek milyen mértékben térhetnek el a szisztémás vénás és artériás alapértékektől. Az irodalomban nem található e kérdéskörben adat, azonban klinikai relevanciája jelentős lehet. Nem ismert, hogy porto-cavalis shunt készítése során fellépő ischaemia-reperfusio (az érintett vénák műtéttechnika szerinti leszorítása révén), valamint a shunt jelenléte hogyan modulálhatja a micro-rheologiai különbségeket és ezáltal az érintett szervek microcirculatióját. 2. CÉLKITŰZÉSEK 1. A kevéssé ismert aorto-porto-cavalis haemorheologiai különbségek vizsgálata patkányon, különös tekintettel a vörösvérsejt deformabilitásra és a vörösvérsejt aggregatióra. 2. Új kísérleti modell kialakítása mikrosebészeti módszerrel egy szelektív porto-cavalis shunt modell létrehozása laboratóriumi patkányban, mely során csak a vena mesenterica rostralist használjuk fel és a vena portae érintetlen marad a vena lienalis ágával együtt. 3. Többszervi (vékonybél, máj és jobb oldali vese) intraoperativ microcirculatiós vizsgálatok elemzése a meso-cavalis lokalizációban elkészített end-to-side anastomosis elkészítése előtt és után. 4. A shunt-ök elkészítése után postoperativ követéses vizsgálat lehetőségének előkísérleteként az 1. és a 14. postoperativ napon haematologiai és haemorheologiai paraméterek elemzése. 5
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleteinket az 1998. évi XXVIII., Az állatok védelméről és kíméletéről alkotott törvény, illetve az Európai Unió 2010. évi EEC 63 direktíva előírásait betartva végeztük, a Debreceni Egyetem Munkahelyi Állatjóléti Bizottság (DE MÁB) által 37/2007. és 6/2008. számon nyilvántartásba vett, a Hajdú-Bihar Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenőrzési Állomás által kiadott hatósági engedéllyel. 3.1. Aorto-porto-cavalis haemorheologiai különbségek vizsgálata 3.1.1. Kísérleti állatok és vérvételi protokoll A kísérletben 13 (8 hím [381,5 ± 13,4 g] és 5 nőstény [292,2 ± 20,9 g]) patkányt (Janvier Co., Franciaország) használtunk. Általános anaesthesiában (Na-thiopentál 60 mg/kg, i.p. Thiopenthal, Biocheme Gmbh, Ausztria) median laparotómiát végeztünk és óvatos, atraumatikus preparálási technika alkalmazásával az aorta abdominalis és vena cava caudalis infrarenalis szakaszát mobilizáltuk és izoláltuk. A vérvételekhez 26 G-s tűhöz csatlakozott anticoagulanst (Na-EDTA, 1,5 mg/ml) tartalmazó fecskendőt használtunk. A vérminták vétele a következő sorrendnek megfelelően történt: vena portae, vena cava caudalis, aorta abdominalis. Minden érből 0,6-0,8 ml mennyiségű vért vettünk. A minták a lehető leggyorsabban a tanszék Haemorheologiai Kutatólaboratóriumába lettek szállítva a mérések elvégzése céljából (teljes in vitro idő: <30 perc volt). 3.1.2. Laboratóriumi vizsgálatok 3.1.2.1. Laktát, vér ph és vérgáz analízis Vérgázanalizátor automata (ABL555 Radiometer Copenhagen, Dánia) által meghatározásra került a laktát koncentráció (mmol/l), a vér ph, valamint a pco 2, és po 2 értékek [Hgmm]. A vérmintát zárt rendszerben közvetlenül a készülékbe fecskendeztük, anélkül hogy közvetlenül érintkezett volna levegővel. 6
3.1.2.2. Haematologiai paraméterek Az általános haematologiai paramétereket Sysmex F-800 haematologiai automatával (TOA Medical Electronics Corp., Japán) határoztuk meg. 3.1.2.3. Haemorheologiai paraméterek vizsgálata Vörösvérsejt deformabilitás LoRRca MaxSis Osmoscan (Mechatronics BV, Hollandia) készülékkel kerültek meghatározásra a vörösvérsejtek elongatiós index (EI) értékei a nyírófeszültség (SS) [Pa] függvényében. Az EI-SS görbék összehasonlíthatóságához a Lineweaver Burk analízist használtuk, amellyel a kalkulált maximális elongatiós index (EI max) értéket és a maximális elongatiós index feléhez tartozó nyírófeszültség (SS1/2 [Pa]) értékét határoztuk meg, a következő egyenlettel: 1/EI=SS1/2/EI max 1/SS +1/EI max. A vörösvérsejt deformabilitás romlásával az EI max érték csökken, valamint az SS 1/2 érték növekszik. Osmoscan funkció: 250 μl vérminta 5 ml PVP oldattal kerül elegyítésre. A készülék állandó 30 Pa nyírófeszültséget generál a mintára, folyamatosan rögzítve az elongatiós indexet, miközben a médium ozmolalitása fokozatosan változik a minta, valamint 0 illetve 500 mosmol/lg ozmolalitású PVP oldat változó arányú, folyamatos adagolásával. A készülék által mért és kalkulált paraméterek: maximális elongatiós index (EI max megjegyzés: azonos a Lineweaver Burk analízissel meghatározott EI max értékkel), minimális elongatiós index (EI min) a legalacsonyabb ozmolalitás, ahol a vörösvérsejtek még nem rupturálódnak, valamint az EI max feléhez tartozó értékek a hyperosmolaris tartományban (EI hyper), az ezekhez tartozó ozmolalitás értékek (O EI max, O EI min, O EI hyper [mosm/kg]) és a görbe alatti terület (Area). 7
Vörösvérsejt aggregatio A vörösvérsejtek aggregatio meghatározása a Myrenne MA-1 erythrocyta aggregométer (Myrenne GmBH, Németország) készülékkel történt, amely fénytranszmissziós elven működik Schmid Schönbein által leírt módszer alapján. A Myrenne MA-1 aggregométerrel történő mérésekhez 20 μl alvadásgátolt vérminta szükséges. A vérminták 600 s 1 sebesség-gradiensen történő disaggregatióját követően a sebesség-gradiens hirtelen nullára (M mód) vagy 3 s 1 -re (M1 mód) csökken. A vérminta fénytranszmissziójának megváltozása alapján (disaggregatio: alacsony fénytranszmisszió, aggregatio: magasabb fénytranszmisszió), a készülék aggregatiós indexet számít az aggregatio folyamat 5., illetve 10. másodpercében. Fokozott vörösvérsejt aggregatio esetén az indexek paraméterek (M 5s, M1 5s, M 10s, M1 10s) nőnek. 3.1.3. Statisztikai analízis A statisztikai elemzést SigmaStat (Systat Software Inc., San Jose, California, USA) szoftverrel végeztük. Az aorta abdominalis, vena cava caudalis és vena portae vérminták összehasonlításához páros t-próbát vagy Wilcoxon-tesztet, illetve Student s t- próbát vagy Mann Whitney RS tesztet végeztünk az adateloszlás normalitása alapján. A szignifikancia szintet p<0,05-nél határoztuk meg. 3.2. End-to-side porto-cavalis shunt-ök morphologiai és intraoperativ mikrokeringési vizsgálatai 3.2.1. Kísérleti állatok, anaesthesia A műtéteket Sprague-Dawley patkányokon végeztük, általános anaesthesiában (Na-thiopentál 60 mg/kg i.p., Thiopenthal, Biochemie GmbH, Ausztria). Intraoperativ mértük a rectalis hőmérsékletet (SEN-06-RTH1, Experimetria Kft. Magyarország). A mikrosebészeti beavatkozásokhoz Leica 8
Wild M650 operáló mikroszkópot használtunk. A műtétek alatt video- és fotódokumentációt készítettünk. 3.2.2. Műtéti technika Előkísérletes tanulmányként három állaton (300-350 g, hím) anatómiai vizsgálatokat végeztünk, mely során feltártuk és mobilizáltuk a portalis rendszer fő ágait és a vena cava caudalis suprarenalis szakaszát, valamint elkészítettük a Lee és Fisher által leírt modellt. Az end-to-side anastomosis kialakítása során törekedtünk felmérni a feszülésmentesség műtéttechnikai feltételeit. Tíz állaton (340,9 ± 25,52 g, hím) mikrosebészeti módszerekkel elkészítettünk egy szelektív porto-cavalis shunt modellt, ahol a vena mesenterica rostralist használtuk fel az end-to-side anastomosis elkészítéséhez úgy, hogy a vena portae, illetve a vena gastrolienalis ága érintetlen maradt. Median laparatomiát és a belek anteponálását követően, a v. portae-t és az ágait kipreparáltuk. A v. cava caudalist a két v. renalis között szintén mobilizáltuk. Mikrosebészeti csipeszekkel a v. mesenterica rostralist izoláltuk és elválasztottuk a v. colica ágaitól egészen a v. gastrosplenica beszájadzásáig. Szükség esetén a v. colica mediát, illetve a v. pancreaticoduodenalis inferiort 8/0-s sodrott selyemfonállal lekötöttük és átvágtuk. A v. portae kettéválásánál a v. mesenterica rostralis proximális részét lekötöttük. Atraumatikus klippeket helyeztünk fel a distális v. mesenterica rostralisra, illetve a v. cava caudalisra distálisan és proximálisan. Az átvágott vena mesentericát fiziológiás sóoldatban hígított Na-heparinos (10%) oldattal átmostuk és a vénát feszülésmentesen a v. cava felé pozicionáltuk. A v. cava caudalis elülső falán elliptikus venotomiát végeztünk, melynek hossza megegyezett a v. mesenterica maximális átmérőjével. A venotomia helyét igyekeztünk minél laterálisabban végezni a v. cava-n. Először az anastomosis hátsó fala került megvarrásra tovafutó varratsorral 10/0 poliamid monofil varróanyaggal, majd az elülső falat készítettük el egyszerű csomós 9
öltésekkel (6-7 db) ugyanazzal a varróanyaggal. A klippek felengedését követően, az anastomosis átjárhatóságát teszteltük (Acland-teszt), és ha szükséges volt, a kisebb vérzéseket tamponáltuk. Az intraoperativ vizsgálatokat (3.2.3, 3.2.4. fejezetek) követően a beleket visszahelyeztük a hasüregbe, majd a hasfalat két rétegben zártuk. 3.2.3. Morphologiai elemzés Az operáló mikroszkóphoz csatlakoztatott kamera segítségével videofelvételt készítettünk, majd off-line elemeztük az erek geometriáját: a v. cava caudalis, és a v. mesenterica rostralis külső átmérőjét, valamint az anastomosis elkészítése után a beszájadzási szög és az anastomosis alatt és felett mért érátmérőket. A képelemzést Adobe Photoshop CS5 software segítségével végeztük. Az elemzés során, a képen adott volt 1 mm-es távolsághoz tartozó pixelszám (a micro-ér klipp festett barázdái közti távolság 0,5 mm) és így a két fal közti távolság pixelszáma alapján számoltuk ki a metrikus értéket. 3.2.4. Intraoperativ microcirculatiós vizsgálat Laser Doppler szöveti áramlásmérőt (LD-1 Laser Doppler Flowmeter, Experimetria Kft., Magyarország, laser hullám hossza = 780 nm ± 10 nm, energiája a mérőfej végénél = 0,5-1,0 mw, laser Doppler signal = 10 Hz -19 khz) használtunk, amelynek a standard pencil mérőfejét (MNP100XP, Oxford Optronix Kft. UK) a máj középső lebenyének elülső felszínére, egy jejunum kacs antimesenteralis szélére, majd a jobb vese elülső-középső felszínére helyeztük. A mérőfej a készülékhez tartozó állványhoz volt rögzítve, amely fixen tartotta az adott mérési ponton. A légzés, illetve perisztaltika okozta artefaktumok elkerülése végett a pencil mérőfejet kicsit a felszínhez érintettük, kerülve a jelentősebb impressziót. 10
A jel stabilizációját követően a BFU értékeket 20 másodpercen keresztül regisztráltuk, amelyet a számítógéppel később off-line analizáltunk. Az összehasonlításhoz e mérési szakaszok BFU értékeinek átlagát vettük. A laser Doppleres mérések a shunt készítése előtt, röviddel a klippek felhelyezése után, majd a klippek levétele előtt és után (reperfusio 0. perc), valamint a reperfusio 30. percében történtek mindhárom szerv vonatkozásában. 3.2.5. Laboratóriumi vizsgálatok A kísérletsorozat utolsó két állatában külön-külön az 1. és a 14. postoperativ napon is végeztünk további vizsgálatokat. Ezen állatok a műtétet követően 5 ml 0,9%-os NaCl oldatot kaptak (s.c.), valamint Flunixint (20 mg/kg, s.c.) postoperativ fájdalomcsillapításra. Altatásban re-laparotomia során vért vettünk a vena cava caudalisból és a 3.1.2.2. és 3.1.2.3. fejezetben leírt módszerek szerint a vérmintából meghatározásra kerültek a micro-rheologiai paraméterek. 3.2.6. Statisztikai analízis A statisztikai elemzést ebben a tanulmányban is SigmaStat szoftverrel végeztük. Az intraoperativ laser Doppler áramlásmérő különböző mérési helyről kapott összehasonlító adatait páros t-próbát vagy Wilcoxon-teszttel, illetve Student s t-próbával, vagy Mann Whitney RS teszttel hasonlítottuk össze. A csoporton belüli változások (mérési hely) analizálására egyirányú ANOVAtesztet használtunk (Dunn- és Bonferroni-módszer). A szignifikancia szintet p<0,05-nél határoztuk meg. 11
4. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS 4.1. Aorto-porto-cavalis haemorheologiai különbségek vizsgálata 4.1.1. Laktát koncentráció, vér ph és vér gáz értékek A laktát koncentráció kis mértékben, de szignifikánsan magasabb volt az artériás vérmintákban (vs. szisztémás vénás vérminták: p=0,001 t-próbával, p=0,007 páros t-próbával; és vs. portalis vénás vérminták: p=0,064 t-próbával és p=0,073 páros t-próbával) (12. ábra). A vér ph értéke is nagyobb volt az artériás vérmintákban (vs. szisztémás vénás vérminták: p=0,002 t-próba és p<0,001 páros t-próbával; vs. portalis vénás vérminták p=0,008 t-próbával és p=0,006 páros t-próbával), amíg a szisztémás vénás és a portalis vénás mintákban majdnem azonosak voltak. A vérgáz paraméterek élettanilag a vártak szerint alakultak. A po2 az artériás vérben volt a legmagasabb (vs. szisztémás vénás vérminták: p<0,001 t- próbával és páros t-próbával; és vs. portalis vénás vérminták: p<0,001 t-próbával és páros t-próbával), míg a pco 2 a szisztémás vénás vérben (vs. szisztémás vénás vérminta: p=0,028 t-próbával és p=0,016 Wilcoxon-teszt; és vs. portalis vénás vérminta: p=0,063 t-próbával és p=0,082 páros t-próbával). 4.1.2. Haematologiai paraméterek A fehérvérsejtszám kisebb volt az artériás vérmintákban, mint a szisztémás vénás (p=0,013 Mann Whitney-teszttel és p<0,001 páros t-próbával) és portalis vénás vérmintákban (p=0,009 t-próbával és p=0,002 páros t- próbával). Bár nem szignifikánsan, de a vörösvérsejtszám és a haematocrit értékei kismértékben magasabbak voltak a szisztémás és a portalis vénás vérmintákban. Az MCV nem különbözött jelentősen, a vénás mintákban kissé alacsonyabb volt. A thrombocyta szám kismértékben nagyobb volt a szisztémás vénás és portalis vénás vérmintákban. A többi vizsgált haematologiai paraméter értékeiben nem volt számottevő különbség. 12
4.1.3 Haemorheologiai paraméterek 4.1.3.1. Vörösvérsejt deformabilitás Bár a szórás átfedésben volt, a különbségek tisztán megfigyelhetőek voltak az EI-SS görbék között: a legmagasabb EI értékeket a szisztémás vénás vérmintákban, a legalacsonyabbat az artériás vérmintákban mértük, míg a portalis vénás értékek a kettő közé estek. Az EI max értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az artériás vérmintákban, mint a szisztémás vénás vérmintákban (p=0,004 Mann Whitneyteszttel és p=0,003 Wilcoxon-teszttel). Az SS 1/2 értékek magasabbak voltak az artériás vérmintákban, mint a szisztémás vénás vérmintákban (p=0,023 páros t- próba). Az artériás és portalis vénás vérminták közti különbség nem volt szignifikáns. A minimális elongatiós index értékek kismértékben magasabbak voltak a szisztémás és portalis vénás vérmintákban. A maximális EI értékek nem különböztek egymástól, csak a vénás vérmintákban volt kissé emelkedett. EI hyper mérsékelten volt nagyobb mindkét vénás mintában az artériás vérmintákhoz képest. Az ozmolaritás EI max-nál kismértékben ugyan, de magasabb volt a szisztémás vénás vérmintákban, mint az artériásban. A legalacsonyabb a portalis vénás mintákban volt, megközelítve a szignifikancia szintet a szisztémás vénás vérmintához hasonlítva (p=0,072 páros t-próbával). 4.1.3.2. Vörösvérsejt aggregatio Az artériás vérben az 5. másodpercben mért vörösvérsejt aggregatio index M paraméterei bizonyultak a legalacsonyabbnak (1,15 ± 0,46) a szisztémás vénás (1,26 ± 0,52) és a portalis vénás (1,21 ± 0,58) vérmintákhoz képest, de a különbség nem volt szignifikáns. Az 5 másodperces M1 paraméter az artériás vérmintákban (2,03 ± 0,88) volt magasabb, mint a szisztémás vérmintában (1,87 ± 0,85). A legmagasabb 13
M1 értékeket a portalis vénás vérmintákban mértük (2,95 ± 2,03; p=0,055 vs. szisztémás vénás, t-próba). A 10. másodperces M index értékek jelentős különbséget mutattak. A vena cava caudalisból vett mintában volt a legalacsonyabb (2,27 ± 0,83), amely szignifikánsnak bizonyult az artériás (4,38 ± 2,51; p=0,001 Mann Whitneyteszt) és a portalis vénás (4,71 ± 1,98; p<0,001 Mann Whitney-teszt) mintákhoz képest. A 10. másodperces M1 értékek esetén nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. Az artériás vérmintákban (5,27 ± 3,13) mérsékelten magasabbak voltak a szisztémás vénás értékekhez képest (5,03 ± 2,24), míg a legmagasabb értékeket a portalis vénás mintákban mértük (6,18 ± 4,24). 4.1.4. Megbeszélés és következtetések Jelen tanulmányunkban célunk volt feltárni a lehetséges aorto-portocavalis vörösvérsejt deformabilitás, vörösvérsejt aggregatio különbségeket, a haematologiai paraméterek, a vér ph, laktát koncentráció, a pco 2 és po 2 értékek együttes vizsgálatával. Az ozmotikus gradiens ektacytometria (osmoscan) adatok nem mutattak jelentős aorto-porto-cavalis különbséget. Azt azonban meg lehetett figyelni, hogy a vena portae-ből vett vérmintákból szabálytalanabb görbéket kaptunk 350-400 mosm/kg felett. Tekintettel arra, hogy nagyon kevés adat áll még rendelkezésünkre az új osmoscan funkcióról, eddig nem találtunk magyarázatot erre az eredményre az irodalomban. A vörösvérsejt aggregatio és a vörösvérsejt deformabilitás számottevő aorto-porto-cavalis különbségeket mutathat patkányban. Ezért a megfelelő kontroll vizsgálatok elengedhetetlenek a kísérletes sebészeti és mikrosebészeti kutatási modellekben (pl. művi porto-cavalis shunt modellek), a lokális és szisztémás haemorheologiai változások pontosabb feltárásához és elemzéséhez. További összehasonlító vizsgálatok szükségesek, hogy jobban megértsük e különbségeknek a hátterét és in vivo jelentőségét. 14
4.2. End-to-side porto-cavalis shunt-ök morphologiai és intraoperativ microcirculatiós vizsgálatai 4.2.1. Technikai kivitelezés és morphologiai elemzés Az elkészített meso-cavalis lokalizációjú end-to-side porto-cavalis anastomosisok (n=10) jól funkcionáltak: az anastomosisnál nagyobb vérzés nem volt tapasztalható, átjárhatóságuk megtartott volt és stenosis sem alakult ki. A műtéti idő 48,75 ± 11,26 perc volt (kirekesztési idő: alkalmanként 15-25 perc). A műtétek leghosszabb szakaszát az erek preparálása és megfelelő pozicionálása tette ki, amely biztosította az erek feszülésmentességét, megelőzve a szakadást az anastomosis készítése során. A beavatkozással együtt járó, szükségszerű érleszorítások végén az érintett szervek színének változása jól megfigyelhető volt. A vékonybélben vénás pangás volt látható, míg a máj halvány vörössé vált. A vena mesenterica rostralis és a vena cava caudalis anastomosis alatti és feletti szakaszának a külső átmérője tágultabbá vált az anastomosis elkészítését követően a műtét előtti állapotokhoz képest. A vena mesenterica rostralis dilatációja nem volt szignifikáns, de a vena cava caudalis shunt feletti (p<0,001 vs. alap; p=0,05 vs anastomosis) és alatti (p<0,001 vs. alap; p= 0,004 vs. anastomosis) szakaszánál mért átmérő jelentősen tágultabb volt. 4.2.2. Intraoperativ mikrokeringési vizsgálatok A máj (32,64 ± 13,68), jejunum (35,83 ± 13,67) vagy a vese (36,14 ± 17,71) műtét előtti mikrokeringést leíró BFU értékei nem mutattak szignifikáns különbséget. A várakozásoknak megfelelően a klippek felhelyezését követően a vékonybél és a vese BFU értékei csökkentek, amely kifejezettebb volt a jejunum kacson. Leszorítást követően a vékonybél értékei (17,61 ± 9,09) szignifikáns mértékben csökkentek az alapértékhez képes (p< 0,001), valamint a máj (29,13 ± 14,45, p<0,001) és a vese (24,75 ± 10,86, p=0,001) értékeihez képest is 15
alacsonyabbak voltak. A vese BFU értékei is szignifikánsan csökkentek az alapértékhez képes (p<0,001). A klippek felengedése előtt a a BFU csökkenés még inkább kifejezettebbé vált, megtartva a hasonló relációt az érintett szervek értékei között (jejunum: 12,03 ± 9,19, p<0,001 vs. alap és máj, p=0,036 vs. vese; máj: 23,26 ± 13,37, p<0,001 vs. alap, p=0,02 vs. vese; vese: 16,07 ± 10,91, p<0,001 vs. alap). A klippek felengedését követően a BFU értékek normalizálódni kezdtek, de nem egyforma mértékben. A vese BFU értékei közel teljes mértékben helyreálltak (31,87 ± 12,59), amíg a vékonybél (21,26 ± 17,07, p<0,001 vs. alap, p<0,001 vs. vese) és a máj (24,43 ± 12,06, p<0,001 vs. alap, p<0,001 vs. vese) értékei jóval a vese értékei mögött maradtak. A vizsgált reperfusio időtartam alatt a vékonybél értékei alacsonyabbak voltak a máj értékeihez képest, bár a p érték nem érte el a szignifikancia szintet, csak megközelítette azt (0. reperfusio: p=0,059; 30 reperfusio: p=0,051). 4.2.3. Haematologiai paraméterek A vörösvérsejtszám, haemoglobin koncentráció, valamint a haematocrit az első postoperativ napra és a második hét elteltével csökkent a Tanszék Haemorheologiai Kutatólaboratóriumának adatbázisából származó hasonló súlyú, korú és azonos nemű állatok kontroll értékeihez viszonyítva. 4.2.4. Haemorheologiai paraméterek 4.2.4.1. Vörösvérsejt aggregatio Az aggregatio fokozódott az első postoperativ napra, különösen az aggregatiós folyamat 10. másodpercében mért M és M1 index paraméterek esetén. Az 5. és 10. másodpercben mért M értékek alacsonyabbak voltak a kontroll értékekhez képest a 14. postoperativ napon, míg az M1 paraméter a kontrollhoz hasonló volt. 16
4.2.4.2. Vörösvérsejt deformabilitás A vörösvérsejtek deformabilitás romlása jól látszott az 1. és 14. napon vizsgált állatok értékeiben. A kontroll értékekhez viszonyítva az EI (3 Pa-nál), az EI max és az SS 1/2 értékek csak kisebb eltérést mutattak az 1. postoperativ napon, míg a 14. napon már jelentősebb deformabilitás romlás mutatkozott. 4.2.5. Megbeszélés és következtetések Az ér-anastomosisok biztonságos elkészítésére nagy figyelmet fordító kísérletes sebészeti kutatásoknak komoly klinikai jelentősége van, hiszen a sebészi biztonság növelésének, az erek morphologiai változásainak és az anastomosisok hosszú távú hatékonyságának figyelembe vétele elengedhetetlen a beavatkozások során. Ezeknek a szempontoknak a tanulmányozása szükséges a dekompresszáló porto-cavalis shunt-ök tulajdonságainak jobb megértéséhez is. Az általunk leírt szelektív porto-cavalis shunt műtéti technikájában különbözik az eddigi ismert meso-cavalis shunt modellektől. A műtéti protokoll tervezésénél legfőbb célunk az volt, hogy egy olyan állapotot alakítsunk ki, ami minimalizálja a képletek közötti feszülést. Ezért további ér (vena duodenalis) lekötésekre volt szükség, hogy a vena mesenterica rostralis teljesen mobilissá váljon és így az erek approximálása kevésbé feszült. A megfelelő mikrosebészeti technika alkalmazásával az erek nem nyúltak meg és az anastomosisok biztonságosan elkészülhettek. A modell előnye a parciális és szelektív tulajdonságában (a vena gastrolienalis érintetlen marad), valamint az erek jó hozzáférhetőségében rejlik. Hátránya az időigényesség, ami az erek megfelelő, csavarodásmentes pozicionálásához szükséges. Intraoperativ megfigyelhető volt, hogy a máj, vékonybél és vese felszínén mért mikrokeringési értékek nem egyforma mértékben rendeződtek a műtét végére. A shunt-ök elkészítését követően kialakuló komplikációk következtében számos májat érintő kórfolyamat tanulmányozható. A májtól elvezetett vena portae rendszer része a szisztémás keringésbe kerül és hepaticus 17
encephalopathiát okoz a máj morphologiai, illetve funkciójának deprivációja mellett. A postoperativ követéses vizsgálatok során az első napon vett vérmintákban jelentős eltéréseket találtunk a kontroll értékekhez képest, amelyek ugyan a 14. napon bizonyos paraméterek estén (vörösvérsejtszám, Htc, MCV, M1 5 sec és 10 sec aggregatio index, valamint EI 3 Pa-nál) megközelítették a kontroll értékeket, de még mindig rosszabb eredményeket kaptunk. Két hét elteltével az állat viselkedése is megváltozott, kevés táplálékot fogyasztott, amely súlyos súlyveszteséggel járt. Mindezt a shunt jelenlétéből következő metabolikus zavar magyarázhatja, következményes encephalopathiával, amely további vizsgálatokat igényel. Összefoglalva, egy olyan szelektív porto-cavalis shunt modellt alakítottunk ki laboratóriumi patkányban, ahol a vena mesenterica rostralis és a vena cava caudalis között egy end-to-side anastomosist készítettünk mikrosebészeti technika alkalmazásával, stabil és könnyen kivitelezhető geometriával. A modell alkalmas lehet a hepaticus encephalopathia tanulmányozására amellett, hogy a máj atrophiája feltehetően kisebb mértékű lehet a részben megtartott perfusio révén. Az intraoperativ laser Doppleres mérések kiértékelése hasznos információt adott a műtéti technika optimalizálásához (leszorítási idők, feszülésmentesség). 18
5. FONTOSABB EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1. Először írtuk le patkányokban az aorto-porto-cavalis micro-rheologiai alap különbségeket. A legalacsonyabb elongatiós index értékeket az artériás vérmintákban mértük, a legmagasabbat a szisztémás vérmintákban. A portalis vérminták értékei e kettő közé estek. Az aggregatiós folyamat 10. másodpercében mért M index paraméter szignifikánsan alacsonyabb volt a szisztémás vénás vérmintákban, mint az artériásban és a portalis mintákban. Az aggregatio 5. másodpercében a legmagasabb M1 index értékeket a portalis vénás vérmintákban mértük. Az adatok a mintavételi hely standardizálásának fontosságára hívhatják fel a figyelmet, és hozzájárulhatnak az ischaemia-reperfusio, illetve különféle arterio-venosus és porto-cavalis shunt-ök készítése révén kialakuló rheologiai eltérések jobb megértéséhez. 2. Kialakítottunk egy új, mikrosebészeti módszerekkel biztonságosan elkészíthető meso-cavalis lokalizációjú end-to-side porto-cavalis shunt modellt patkányon, a shunt-ök morphologiai, intraoperativ microcirculatiós és postoperativ haemorheologiai változások tanulmányozására. 3. Az intraoperativ többszervi microcirculatiós változások vizsgálatakor megállapítottuk, hogy a vénák (vena cava caudalis és vena mesenterica rostralis) szükségszerű atraumatikus leszorítása különböző mértékű microcirculatiós zavart hoz létre: a legnagyobb mértékű romlást a vékonybél, valamint a máj paraméterei mutatták. A reperfusiót követően az érintett szervek értékei normalizálódtak az alapértékeikhez viszonyítva, de nem egyforma mértékben. Az erek intraoperativ morphologiai változásainak vizsgálata során a vena cava caudalis shunt alatti és feletti szakaszának külső átmérője jelentősen tágultabbá vált. Az intraoperativ laser Doppleres 19
mérések kiértékelése hasznos információt adhat a műtéti technika további optimalizálásához (leszorítási idők, feszülésmentesség). 4. A postoperativ követéses laboratóriumi vizsgálatok előzetes eredményei szerint a haematologiai és haemorheologiai értékek a porto-cavalis shunt jelenlétében romlottak (1. és 14. postoperativ napok között). Összegzésképp az eredmények adatokat szolgáltattak a porto-cavalis shunt-ök intraoperativ morphologiai, microcirculatiós és haemorheologiai változásainak jobb megítéléséhez, a shunt-ök átjárhatósága, geometriája és hosszú távú hatékonysága szempontjából. 20
21
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Németh Norbert egyetemi docens, Tanszékvezető Úrnak, aki a kezdetektől fogva biztató szavaival támogatta és segítette kutatómunkámat, valamint oktatói tevékenységemet. Köszönöm segítőkész tanácsait és dolgozatom alapos és kritikus átnézését. Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Furka Istvánnak, aki kimagasló szakmai tapasztalatával segítette kutatásomat és személyesen vezetett be a mikrosebészet világának rejtelmeibe. Külön köszönet illeti Prof. Dr. Mikó Irén egyetemi tanár Úrnőt, akinek a tanszékvezetői tevékenysége alatt csatlakoztam a tanszékhez és így megteremtette számomra a lehetőséget, hogy elkezdhessem a kutatásomat és szakmai támogatásával segítette oktató munkámat. Köszönet illeti Dr. Pető Katalin adjunktusnőt, aki munkám során szakmaibaráti segítséget nyújtott. Köszönetet mondok Dr. Tóth Enikő egyetemi gyakornoknak és Dr. Kiss Ferenc tanársegéd Úrnak, akik nagyon sokat segítettek a laboratóriumi mérésekben és a műtétek előkészítésében. Nem lehet szavakba foglalni azt a rengeteg segítséget, amelyet a Tanszék valamennyi munkatársától kaptam kutatásom során, kiemelve Gödényné Rozáliát, aki türelmességével és kedvességével segítette munkámat. Nem utolsósorban szeretném megköszönni Szüleimnek, Testvéreimnek, Keresztanyámnak és egész Családomnak, hogy áldozatos szeretetükkel, segítségükkel lehetővé tették a tanulmányaimhoz a nyugodt hátteret. Valamint hálás köszönettel tartozom Kedvesemnek, aki a mindennapok során kísérte végig PhD éveimet.