Kozma Péter Interferometrikus optikai hullámvezetőbioszenzor jelölésmentes érzékeléshez - Tézisfüzet - Pannon Egyetem Molekuláris- és Nanotechnológiák Doktori Iskola 1 valamint Magyar Tudományos Akadémia Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézete 2 Témavezetők: Dr. Horváth Róbert 2 és Dr. Petrik Péter 2 Veszprém, 2011. 0
1. Bevezetés A nanotechnológia területén az évtized egyik főkutatási iránya olyan érzékelők, érzékelőrendszerek megalkotása és fejlesztése, melyek képesek mind nagyobb és nagyobb érzékenységgel, gyors és költséghatékony módon detektálni akár kisebb molekulák, sőt akár önálló atomok valamilyen felismerőelemhez történőkötődését is. Az ilyen irányú törekvések eredményeit főként a gyógyszerkutatásban hasznosítják, ahol fontos szerepet töltenek be a molekuláris kölcsönhatások kutatásában, mint például a gyógyszer, toxicitás és hatékonyság vizsgálatok [1, 2], új orvos-diagnosztikai és terápiás eljárások fejlesztése [3, 4] területén. Az orvosi, biológiai kutatásokon túl az igazságügy (drog, dopping vizsgálatok, stb.) és az ipar (víz- és ételminőség ellenőrzés, stb.) is széles körben alkalmaz ilyen eszközöket [5, 6]. Ezek a vizsgálatok jellemzően rendkívül parányi, 500 Da-nál kisebb molekulatömeggel rendelkező, ~ pg/ml (esetenként ~ fg/ml) koncentrációban jelen lévőcélmolekulák érzékeny és specifikus kimutatását kívánják olyan oldatokban, ahol egy időben és nagy mennyiségben más molekulák is megtalálhatók [7]. Napjainkban a felismerőelem - célmolekula típusú kísérleteket többnyire úgy végezik, hogy a vizsgálandó molekulákat radioaktív, fluoreszcens vagy mágnesezhetőanyagokkal megjelölik, majd a megfelelőeljárással a jelölők által szolgáltatott jelet keresik a vizsgált térfogatban vagy felületen [2, 8]. Az ilyen eljárásokkal érhetőel ma a legnagyobb érzékenység, hiszen a jelölőt követve akár egyetlen apró molekula bekötődése is megfigyelhető. E kétségtelen előnyük mellett azonban számos hátránnyal rendelkeznek. A detektálandó molekulák megjelölése nem csupán rendkívül idő-, laboratórium- és költségigényes, de maga a jelölés is kihatással lehet a vizsgált folyamat mérési eredményeire [1]. Ennek okán az ilyen irányú kutatások az elmúlt években mind inkább a jelölésmentes alkalmazások felé fordultak. A legígéretesebb jelölésmentes mérési eljárások, ún. jelátalakítók közé tartoznak az optikai hullámvezető alapú érzékelők, melyek kihasználva a fény határfelületről való teljes visszaverődés képességét, a terjedőmódus ún. evaneszcens mezejének segítségével vizsgálják a hullámvezető réteg felültén végbemenő folyamatokat [9, 10, 11]. Ilyen eszközök alkalmazásával oldatok törésmutatójának (kivitelezéstől függően) ötödik - hatodik - hetedik tizedesjegyében történőváltozása detektálható, illetve az érzékelő felületre leválasztott fehérjerétegek vastagsága akár nanométer alatti pontossággal meghatározható [7, 12, 13, 14, 15, 16]. Indokolt tehát a felismerőelemeket hullámvezetőstruktúrákra, chipekre rögzíteni. Ekkor lehetőség nyílik arra, hogy az általuk megkötött célmolekulák nem csupán kvalitatív, 1
hanem kvantitatív analízise is megvalósítható legyen. A szenzorchipet folyadékcellával felszerelt mérőkészülékbe helyezve in situ (latin, folyamat közben) és valós időben mérhetjük a célmolekulák kötődését [10, 11, 12, 17]. További előnye a látható tartománybeli optikai módszerek alkalmazásának, hogy az ilyen típusú folyamatokat nagy érzékenységgel követhetjük anélkül, hogy a vizsgált rendszer bármiféle károsodást szenvedne, illetve, hogy jelentékeny módon beavatkoznánk a kísérlet menetébe. 2
2. A doktori munkát motiváló tényezők Számos, különféle elven alapuló bioérzékelővált mára hatékony és új eredményekre mutató mérési eljárássá, azonban egyedi hibáikon kívül, főés közös hátrányuk a magas piaci áruk. A jövőbioérzékelőinek azonban költséghatékony módon kell biztosítaniuk a lehetőséget arra, hogy akár analitikai laboratóriumokon kívül is, gyors és megbízható méréseket végezhessünk. A felismerő elemek és jelátalakítók fejlesztői számára a jelen kihívása, hogy e célt megvalósítsák. A veszprémi Pannon Egyetemen (PE) folyó kutatások közül a legígéretesebbek közé tartoznak a Nanotechnológia tanszék, Prof. Vonderviszt Ferenc csoportjának azon kísérletei, melyek módosított baktérium ostorok, ún. flagelláris filamentumok felismerőelemekként történőalkalmazását célozzák. Bíztató eredményeik alapján várható, hogy hamarosan olyan in vivo (latin, az élőszervezetben) sokszorosítható, mutáns filamentumokat hozzanak létre, melyekkel specifikus, jó hatásfokú és olcsó detektálás valósítható meg. E kísérletekkel párhuzamosan, az egyetemmel munkakapcsolatban álló Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet (MFA) Fotonika osztályán végezett kutatások az ún. vad (módosítatlan, detektálásra még képtelen) flagelláris filamentumok felhasználásával a közeli jövőben megvalósításra kerülőfelismerőelemek megfelelőjelátalakítóba történőintegrálását készítik elő. Az ilyen irányú fejlesztések alapvetően két részre, módszer- és műszerfejlesztési egységekre bonthatók. Az előbbi esetében nem csupán a felismerőelemek érzékelőfelületére történőrögzítésének technikáját kell megoldani, hanem egy olyan mérési eljárást is ki kell fejleszteni, mellyel a felületre leválasztott fehérjeréteg minősége, opto-geometriai tulajdonságai meghatározhatók, illetve ellenőrizhetők. Egy ilyen eljárás kifejlesztése a minőségi bioérzékelők gyártásának egyik kulcsa. A sikeresen előállított flagelláris filamentum felismerőelemek kisebb molekulák, vagy akár atomok jelenlétét detektálják majd a kívánt oldatban. Az ilyen apró célmolekulák bekötődése csupán a legérzékenyebb mérési eljárásokkal követhetők nyomon. Az e célra legalkalmasabbnak ígérkezőhullámvezetőalapú módszerek közül, számos előnye miatt, az MFA és a PE közös Nanoszenzorikai laboratóriumában fejlesztés alatt álló rácscsatolt interferométerre esett a választás, hogy az érzékelő felületére immobilizált flagelláris filamentum felismerőelemekkel korszerű, költséghatékony és nagy érzékenységűdetektálást valósítson majd meg. 3
3. Kivonat Doktori munkám elsőrészében javaslatot teszek egy gyors, érzékeny, roncsolásmentes és költséghatékony optikai eljárás, a spektroszkópiai ellipszometria alkalmazására, mellyel az összetett rétegszerkezetű hordozókra leválasztott flagelláris filamentum rétegek optogeometriai paraméterei meghatározhatók. Folyadékcellás kísérletekkel bemutatom, hogy a mérési módszer jól használható e fehérjék felületre történőleválasztásának in situ és valós idejű nyomon követésére, sőt minősítésére is. Megmutatom, hogy spektroszkópiai ellipszométerrel a fehérjeréteg tömegsűrűségének mélységbeli eloszlása is meghatározható, melynek alapján a filamentumokból felépülőréteg háromdimenziós struktúrája kutatható. Doktori munkám második részében, egy olyan jelölésmentes, optikai érzékelő, ún. rácscsatolt interferométer (ang. Grating Coupled Interferometer GCI) jelátalakító prototípus megépítéséről és fejlesztéséről számolok be, mely egyszerű és olcsó optikai elemeket alkalmazva minden tekintetben felveszi a versenyt napjaink csúcskészülékeivel. Egyszerre érvényesíti az interferometria-alapú hullámvezetőmódszerek által biztosított tág mérési tartományokon belüli rendkívüli érzékenységet [18, 19, 20, 21, 22] a rácscsatolók egyszerűségével [9]. Mivel mozgó alkatrészeket nem tartalmaz, potenciális lehetőséget biztosít kézi-műszer gyártásra, továbbá más eljárásokkal való összeházasításra. Amennyiben a készülék érzékelő felületét felismerő elemekkel látjuk el, kitűnően alkalmazható akár bioszenzorikai kutatásokra is. 4
4. Tézispontok I. Megmutattam, hogy a spektroszkópiai ellipszometria, mint roncsolásmentes optikai mérési módszer, alkalmas összetett szerkezetű flagelláris filamentum (FF) fehérjerétegek nagyérzékenységű, ex situ és in situ minősítésére. I.a. Optikai modellt alkottam a hullámvezetőszenzorikában is használatos multirétegszerkezetek, s a felületükhöz kovalensen rögzített FF vékonyrétegek opto-geometriai tulajdonságainak ex situ meghatározására. [T1, T5] I.b. A rácscsatolt interferométer - spektroszkópiai ellipszométer kombinált mérőberendezés megépítésének előkészítéseként megmutattam, hogy az eljárás alkalmazható átlátszó hordozók esetén is. Folyadékcellás kísérletekkel igazoltam, hogy a megfelelőoptikai modell kifejlesztésével nyomon követhetőaz épülőff rétegek tömegsűrűségének időbeli változása, sőt e paraméter mélységbeli eloszlása is meghatározható in situ. Mint lehetséges megoldást, egy matematikai modellt javasoltam, mellyel a spektrum kiértékelésből nyert adatok alapján becslés adható a FF vékonyrétegek várható háromdimenziós szerkezetére. [T2, T6, T11] II. Először valósítottam meg a jelölésmentes, optikai érzékelésre alkalmas ún. rácscsatolt interferométer jelátalakító prototípust, majd ezt elsőként alkalmaztam refraktometriai mérések céljára. Ehhez egy rezgésmentesített optikai asztalon összeállítottam a műszerelrendezést, továbbá eljárást dolgoztam ki az eszköz optikai útjainak, valamint mérőés vezérlőelektronikáinak beállítására. Számítógépes vezérlőalgoritmusokat fejlesztettem a jelátalakító válaszjelének rögzítésére és kiértékelésére. Az első, működést igazoló kísérlettel megmutattam, hogy a műszer érzékenyen reagál az érzékelőfelületen végbemenőtörésmutató változásra, majd egy refraktometriai mérési sorozattal meghatároztam, hogy a jelátalakító ezen elsőprototípusa is már ~10-5 -es érzékenységgel képes a törésmutató változását nyomon követni. A válaszjel fázisának meghatározásával igazoltam az érzékelés linearitását is. [T3, T7, T8, T9] 5
III. Megmutattam, hogy a II. tézispontban megvalósított rácscsatolt interferométer jelátalakító válaszjelének fázisát egy általam fejlesztett modell illesztésével ~10-4 radian pontossággal hatékonyan és stabilan határozhatjuk meg. Valós idejű vezérlő és kiértékelő algoritmust fejlesztettem, mellyel a vizsgált folyamatról azonnali képet kaphatunk a monitoron. Megmutattam, hogy plánparalel üveglemezzel referencia interferencia válaszjel kelthető, mely egyidejű kiértékelésével a műszer szabad fényterjedési egységéből eredőzaj hatékonyan kiszűrhető, így az eszköz érzékenysége javítható. Biológiai teszt kísérletekkel igazoltam, hogy a rácscsatolt interferométer jelátalakító az irodalommal összecsengőeredményekre mutat, illetve bebizonyítottam, hogy akár hozzávetőlegesen 0,5 pg/mm 2 -es, illetve néhány 10 Da-os érzékenységgel képes a felületre leválasztott molekulák detektálásra. Összehasonlítva napjaink legnépszerűbb és legelterjedtebb jelátalakítóival, e műszer kiváló teljesítőképességével azok nagy többségét felülmúlja. [T4, T11] IV. Először terveztem és építettem kombinált mérőberendezést rácscsatolt interferométer és spektroszkópiai ellipszométer integrálásával. A kisebb érzékenységűspektroszkópiai ellipszométer folyadékfázison (folyadékcellán) keresztül, széles hullámhossztartományon mérve meghatározza a hordozó felületén épülő vékonyréteg optogeometriai paramétereit, míg a kiemelkedő felbontással jellemezhető rácscsatolt interferométer hordozó felől egyetlen meghatározott hullámhosszon detektálva feltárja a vizsgált folyamat apró változásait. E két eszköz együttese tehát érzékenyebb és információban gazdagabb eredményeket szolgáltat, mint tennék azt külön-külön. Egy egyszerűfehérjeadszorpciós kísérlettel demonstráltam, hogy e műszeregyüttes alkalmas azonos pontban való párhuzamos mérésekre. Bemutattam, hogy már ez az első prototípus is 5 pg/mm 2 -es felületi és néhány 10 pg/mm 2 mélységbeli érzékenységgel képes a detektálásra úgy, hogy közben mindkét mérési eljárás előnyeit megtartja. [T10, T11] 6
A tézispontokhoz szigorúan kapcsolódó publikációk [T1] P. Kozma, N. Nagy, S. Kurunczi, P. Petrik, A. Hamori, A. Muskotal, F. Vonderviszt, M. Fried, I. Barsony, Ellipsometric characterization of flagellin films for biosensor applications, Physica Status Solidi (C), vol. 5, pp. 1427-1430, 2008. [T2] P. Kozma, D. Kozma, A. Nemeth, H. Jankovics, S. Kurunczi, R. Horvath, F. Vonderviszt, M. Fried, P. Petrik, In-depth characterization of biosensor protein layer deposition by in-situ spectroscopic ellipsometry, Applied Surface Science, doi: 10.1016/j.apsusc.2011.03.081, 2011. [T3] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, Grating Coupled Interferometry for Optical Sensing, Applied Physics B, vol. 97, pp. 5-8, 2009. [T4] P. Kozma, A. Hamori, S. Kurunczi, K. Cottier, R. Horvath, Grating Coupled Optical Waveguide Interferometrer for label-free Biosensing, Sensors and Actuators B, doi: 10.1016/j.snb.2010.12.045, 2011. A tézispontokhoz szigorúan kapcsolódó konferencia előadások és poszterek [T5] P. Kozma, N. Nagy, S. Kurunczi, P. Petrik, A. Hamori, A. Muskotal, F. Vonderviszt, M. Fried, Ellipsometric characterization of flagellin films for biosensor applications, 4 th International Conference on Spectroscopic Ellipsometry, Stockholm (Svédország), 2007. június 11. - 15. Poszter bemutatás. [T6] P. Kozma, T. Hulber, A. Nemeth, A. Hamori, R. Horvath, S. Kurunczi, P. Petrik, M. Fried, F. Vonderviszt, I. Barsony, Protein layers for biosensor applications characterized by ellipsometry and atomic force microscopy, E-MRS 2009 Spring Meeting, Strasbourg (Franciaország), 2009. június 8. - 12. Szóbeli előadás. 7
[T7] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, Biosensing using Planar Mode Interference, E-MRS 2009 Spring Meeting, Strasbourg (Franciaország), 2009. június 8. - 12. Szóbeli előadás. [T8] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, Biosensing using Planar Mode Interference, Ukrainian-Hungarian Days, Ungvár (Ukrajna), 2009. november 3. - 4. Szóbeli előadás. [T9] P. Kozma, A. Hamori, K. Cottier, S. Kurunczi, R. Horvath, Integrated Optical Interference Sensor, Conference of Chemical Engineering 2010, Veszprém (Magyarország), 2010. április 27. - 29. Szóbeli előadás. [T10] P. Kozma, R. Horvath, A. Hamori, S. Kurunczi, K. Cottier, P. Petrik and M. Fried, A Combined Tool for Simultaneous Measurements by Spectroscopic Ellipsometry and Grating Coupled Interferometry, 5 th International Conference on Spectroscopic Ellipsometry, Albany (Amerikai Egyesült Államok), 2010. május 23. - 28. Poszter bemutatás. [T11] P. Kozma, F. Fodor, A. Nemeth, D. Kozma, A. Hámori, S. Kurunczi, K. Cottier, H. Jankovics, F. Vonderviszt, R. Horvath, P. Petrik, M. Fried, In depth characterization of flagellar filament protein layers using spectroscopic ellipsometry, 3 rd Nanocharm workshop, Berlin (Németország), 2010. október 13. - 15. Szóbeli előadás. Az I. és II. tézispontokkal az European Materials Research Society (E-MRS) Fiatal Kutató Díját (Young Scientist Award) nyertem a strasbourgi E-MRS konferencia L szekciójában 2009. júniusában. 8
5. Irodalomjegyzék [1] M. A. Cooper, Optical biosensors in drug discovery, Nature Reviews on Drug Discovery, vol. 1, pp. 515 528, 2002. [2] K. K. Jain, Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics, Clinica Chimica Acta, vol. 358, pp. 37 54, 2005. [3] K. Y. Kim, Nanotechnology platforms and physiological challanges for cancer therapeutics, Nanomedicine, vol. 3, pp. 103 110, 2007. [4] J. P. Chambers, B. P. Arulanandam, L. L. Matta, A. Weis, and J. J. Valdes, Biosensor recognition elements, Current Issues in Molecular Biology, vol. 10, pp. 1 12, 2008. [5] G. Klenkar and B. Liedberg, A microarray chip for label-free detection of narcotics, Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 391, pp. 1679 1688, 2008. [6] E. C. Alocilja and S. M. Radke, Market analysis of biosensors for food safety, Biosensors and Bioelectronics, vol. 18, pp. 841 846, 2003. [7] M. A. Cooper, Label-free Biosensors Techniques and Applications. Camebridge University Press, New York, 2009. [8] A. P. Alivisatos, Less is more in medicine, Scientific American, vol. September, pp. 67 73, 2001. [9] K. Tiefenthaler and W. Lukosz, Grating couplers as integrated optical humidity and gas sensors, Thin Solid Films, vol. 126, pp. 205 211, 1985. [10] W. Lukosz, Integrated optical chemical and direct biochemical sensors, Sensors and Actuators, vol. 29, pp. 37 50, 1995. [11] R. Kunz, Miniature integrated optical modules for chemical and biochemical sensing, Sensors and Actuators B, vol. 38-39, pp. 13 28, 1997. [12] J. Vörös, J. Ramsden, G. Csúcs, I. Szendrő, S. D. Paul, M. Textor, and N. Spencer, Optical grating coupler biosensors, Biomaterials, vol. 23, pp. 3699 3710, 2002. [13] H. H. K. Nagata, Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions: Applications of BIACORE. Springer, Verlag, 2000. [14] J. Homola, S. S. Yee, and G. Guaglitz, Surface plasmon resonance sensors: review, Sensors and Actuators B, vol. 54, pp. 3 15, 1999. 9
[15] www.farfield-sensors.com. [16] P. Westphal and A. Bornmann, Biomolecular detection by surface plasmon enhanced ellipsometry, Sensors and Actuators B, vol. 84, pp. 278 282, 2002. [17] R. Horvath, H. Pedersen, N. Skivesen, D. Selmeczi, and N. Larsen, Optical waveguide sensor for on-line monitoring of bacteria, Optics Letters, vol. 28, pp. 1233 1235, 2003. [18] K. Schmitt, B. Schirmer, C. Hoffmann, A. Brandenburg, and P. Meyrueis, Interferometric biosensor based on planar optical waveguide sensor chips for label-free detection of surface bound bioreactions, Biosensors and Bioelectronics, vol. 22, pp. 2591 2597, 2007. [19] R. Heideman and P. Lambeck, Remote opto-chemical sensing with extreme sensitivity: design, fabrication and performance of a pigtailed integrated optical phase-modulated mach zehnder interferometer system, Sensors and Actuators B, vol. 61, pp. 100 127, 1999. [20] W. Lukosz and C. Stamm, Integrated optical interferometeras relative humidity sensor and differential refractometer, Sensors and Actuators A, vol. 25, pp. 185 188, 1991. [21] G. Cross, A. Brand, J. Popplewell, L. Peel, M. Swann, and N. Freeman, A new quantitative optical biosensor for protein characterisation, Biosensors and Bioelectronics, vol. 19, p. 383, 2003. [22] O. Gliko, N. Booth, and P. Vekilov, Step bunching in a diffusion-controlled system: phase-shifting interferometry investigation of ferritin, Acta Crystallographica Section D, vol. 58, p. 1622, 2002. 10
Veszprém, 2011. 11