élcsoportok Funkciós csoport Fehérjék zénhidrátok ukleinsavak Lipidek 2 α(), Lys (glikozid) er, etanol amin /P() 2 α(), Glu, Asp 5 er, zsírsavak er, Thr primer, szekunder (glikozid) szekunder 3 glicerin, inozitol, gangliozid Tyr ys Met
Funkciós csoport Fehérjék zénhidrátok ukleinsavak Lipidek Phe 2 Gln, Asn 2 Arg is 2 Trp 3 2 4 1 5 6 4,6 2,3,4(5) E 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2,6,8 1,3,4,7,8 E
Miért hozunk létre funkciós csoportot? 1. incs jelen ami kell pl. 2 2. agyobb reaktivitásra van szükség pl. 3. zelektivitás pl. 2 4. Távolságtartás pl. spacer Taktika: Trial and error 1. 2 csoport kiépítése 2. 2 csoport kiépítése 3. csoport kiépítése 4. csoport kiépítése 5. csoport kiépítése 6. csoport kiépítése
Amino csoport kiépítése I. A) 2 ( 2 ) 2 2 etiléndiamin ( 2 ) 2 2 2 ( 2 ) 3 2 1,3diamino propán 2 ( 2 ) 6 2 1,6diamino hexán 2 ( 2 ) 2 ( 2 ) 2 2 3,3'iminobispropilamin etiléndiamin Fehérje pozitívan töltött aminokkal és negatívan töltött karboxilátokkal Kationizált fehérje blokkolt karboxilátokkal és további pozitívan töltött aminokkal
1. Aktiváláshoz szükséges: = ED; aktív észter;, karbonildiimidazol 2. sökkenti a és növeli a számot pi! pl. BA pi 4.9 pi 9.511 3. Közvetett (spacer) hidrofób kölcsönhatás 4. Alkalmazás: fehérje pl. RP, csak 2 2 van glikoprotein sziálsav B) P 2 ( 2 ) 2 2 P ( 2 ) 2 2 Alkalmazás R, D (5 ) foszforamidát hu, BF et al. ucleic Acid Res 14 5591 (1986)
) 2 a) 3 p 710 chiff bázis a B 3 redukció b) 2 ( 2 ) 2 2 ( 2 ) 2 2 redukció ( 2 ) 2 2 1. pontán, p 710, 10x felesleg 2. öveli a számot, pit 3. Közvetlen: a); közvetett: b) kiterjeszthető 4. Alkalmazás: szénhidrát, glikoprotein
D) Lindley,. ature 178 647 (1956) a) Br ( 2 ) 2 2 p 810 ( 2 ) 2 2 tioéter b) c) I etilénimin ( 2 ) 2 ( 2 ) 2 2 ( 2 ) 2 hidrolízis (spontán) F 3 F 3 1. pontán, p 810, 10x felesleg (DTT), reagens metanolban, 6 M guanidium. l 2. öveli a számot, pit 3. Közvetett védőcsoport jódetiltrifluoracetamid 4. Alkalmazás: fehérje
idrazid csoport kiépítése a) 2 2 2 hidrazin hidrát (Me) 2 2 b) c) 2 2 karbonsav dihidrazid (vízoldékony) 2 2 2 hidrazon 2 adipinsav dihidrazid (vízoldékony) 1. em spontán reakció, előaktiválás (átalakítás reaktív vegyületté) 2 karbodiimid fenol komponens aktív észter szerves oldószer vízoldékony karbodiimid vizes oldószer 2. sökkenti a számot, nő pi 3. a) közvetlen; b) közvetett (spacer) 4. Alkalmazás: fehérjék, mikrotites lemezek (töltés mentesítés is)
a) 2 2 2 hidrazin hidrát (Me) 2 2 redukció pl. ab 4 2 b) c) 2 2 karbonsav dihidrazid (vízoldékony) 2 2 2 2 2 adipinsav dihidrazid (vízoldékony) 1. pontán reakció 2. em változtatja a töltésviszonyokat 3. Alkalmazás: szénhidrátok (dextrán, affinitás krom.) glikoproteinek (ellenanyag, enzim {P})
2 2 Fehérje molekula perjodátoxidált poliszacchariddal (aldehid csoporttal rendelkezik) Adipinsav dihidrazid idrazon kötés terminális hidrazid csoporttal 2
Ghosh, et al. Anal Biochem 178 4351 (1998) P b) a) 2 2 karbonsav dihidrazid ED imidazol, p 6 P foszforamid 2 2 2 P adipinsav dihidrazid 2 Zanocco J. (1993) 1. Előaktiválás 2. sökkenti a számot 3. Alkalmazás: R, D (5 )
A) Karboxil csoport kiépítése 2 savamid borostyánkősav anhidrid Klotz, IM Methods in Enzymol 11 576 (1967) glutár anhidrid maleinsav anhidrid telítetlen 3 citrakonsav anhidrid 3 p 3 2 2metilmaleinsav 3 1. pontán reakció 2. sökkenti, növeli, csökkenti pi 3. Közvetett 4. Alkalmazás: fehérjék, szénhidrát (amino)
B) észter ) l 2 2 éter klórecetsav 1. pontán reakció 2. Közvetett 3. Alkalmazás: szénhidrát, fehérjék Plotz, P Biochemistry 21 301 (1982) p 8.5 (Br)I 2 2 3 tioéter 2 I > Br > l > F
Aldehid csoport kiépítése A) Vicinális diolok oxidációja Bobbit, JM Adv arbohyd hem 11 141 (1956) 10 mm nátrium perjodát 2, p 7 βd mannóz részlet poliszacharid láncban Van Lenten, L J Biol hem 246 1889 (1971) terminális, vicinális, cisz kötés hasadás oxidáció közben (aldehid képződés) sziálsavspecificitás 1 mm nátrium perjodát 0 o 2 2 3 3 acetildneuraminic sav részlet a sziálsav rész szelektív oxidálása
B) Enzimatikus oxidáció Avigad, E et al. J Biol hem 237 2736 (1962) 6 6 euac euraminadáz v. galaktóz oxidáz βd galaktóz [AcDgalaktóz] 1. pontán reakció 2. Közvetlen 3. Alkalmazás: szénhidrát, glikoprotein
2 pformilbenzoesav hidroxiszukcinimid észter amid UVkromofór glutáraldehid ab 3 redukció szekunder amin p 810 1. pontán reakció 2. Közvetett 3. Alkalmazás: fehérje, nukleinsav, szénhidrát ( 2 ) p 7.2 3 3 100x α,βtelítettlen 4hidroxi nonenal
Miért hozunk létre funkciós csoportot? 1. incs jelen ami kell pl. 2 2. agyobb reaktivitásra van szükség pl. 3. zelektivitás pl. 2 4. Távolságtartás pl. spacer Taktika: Trial and error 1. 2 csoport kiépítése 2. 2 csoport kiépítése 3. csoport kiépítése 4. csoport kiépítése 5. csoport kiépítése 6. csoport kiépítése
idroxil csoport kiépítése ab 3 p 8 szekunder amin 2 etanol amin ED amid 1. Aktiválás/redukció 2. Közvetett 3. Alkalmazás: fehérje, szénhidrát
Tiol csoport kiépítése, stratégiák Előny: vonzó mert viszonylag kevés van a fehérjékben átrány: könnyen oxidálódik ( ) 1. oxigén/nitrogén atmoszféra 2. EDTA alkalmazása (0.01 0.1M) fémkatalízis (pl. BAhoz 0.1M) A) Amino csoportból B) idroxi csoportból ) xo csoportból D) Karboxi csoportból E) Diszulfid kötésből
A) Aminocsoportból R 2 védett c) védett PDP MPT a) egyenes láncú b) gyűrűs ATA 2iminotiolán (Traut reagens) ATP acetil homocisztein tiolakton AMA
a) ATA 3 tioecetsav Duncan et al. Anal Biochem 132 68 (1983) 3 2 2 ATP AMA 3 (2 ) 2 tiopropionsav Fuji et al. hem Pharm Bull 33 362 (1985) 3 merkapto borostyánkősav anhidrid 2 ( 2 ) 2 3 ( 2 ) 2 3 Klotz et al. Arch Biochem Biophys 96 605 (1962) 2 Előny: nincs redukció specificitás lásd: AcoA
b) 2 l λ = 248 nm ε = 8840 M 1 cm 1 2iminotiolan p 710 2 l EDTA! vízoldékony Traut, Biochemistry 12 3266 (1973) 2 3 Achomoszerin tiolakton 1020x p 77.5 Ag 3 segít 3 (IMMBILIZÁLÁ) Eldjarn et al. Acta hem cand 17 2610 (1963)
c) piridilditio ( 2 ) 2 ( 2 ) 2 PDP propionsav (Me) DTT 2 arlsson et al. Biochem J 173 723 (1978) ( 2 ) 2 MPT 3 "benzoesav" (A) DTT 3 λ = 343 nm ε = 8880 M 1 cm 1 Thorpe et al. ancer Res 47 5924 (1987) 3 átrány: redukció! (UV!)
B) idroxi csoportból 2 l 2 l Tarentino et al. Glycobiology 3 279285 (1993) ) xo csoportból hidrazid 2 ( 2 ) 2 acetamido 10x EDTA ( 2 ) 2 AMB 3 "butánsav" (Et) 3 hidrazon kötés Taylor et al. Biochem Int 1 353 (1980)
D) Karboxi csoportból 2 2 2 ciszteamin 2 P ED p 4.77.5 2 2 P redukció (DTT) 1. Előaktiválás (ED) 2. Áttölt 3. Alkalmazás: R, D (5 ), fehérjék
DE: 3 2 isztaminnal módosított fehérje Tiolcsoportot tartalmazó fehérje 2 2merkaptoetilamin 3 Diszulfid kötést tartalmazó fehérje konjugátum Inzulin diftéria toxin A lánc Miskimins et al. 1979 Ellenanyag toxin eltmann et al. 1981
E) Diszulfid kötésből ditiotreitol (DTT, transz) ditioeritrol (DTE, cisz) X vegyes diszulfid leland WW Biochemistry 3 480 (1964) X Y ( 2 ) 2 2merkaptoetanol X Y X Y 3 l 2merkaptoetilamin. l X Y l 3 3 l
incs komponens X Y ( 2 ) 2 P ( 2 ) 2 ( 2 ) 2 X Y Tris(2karboxietil)foszfin ( 2 ) 2 P oxidált foszfin ( 2 ) 2 ( 2 ) 2 ab 4 p 810, puffer Gailit J Anal Biochem 214 334 (1993) 1. pontán 2. Felesleg fontos! (min. 20x) 3. Alkalmazás: fehérjék (szerkezet vizsgálat) kiépített X kötések 4. Denaturáló szerek: urea, guanidin, D 5. Egyebek: ys, 2 (tioglikolsav)
tartalmú redukálószerek X Y R X R Y vegyes diszulfid X R R R R X X Y R R R Y 2 X oxidált redukálószer
Tiol csoport kiépítése immobilizált redukálószerekkel spacer 3 acetilhomocisztein (1975) X Y diamino dipropilamin spacer Előny: nincs melléktermék (oxidált redukálószer) redukálószer immobil regenerálható dihidrolipoamid (1964)
MIBŐL? 2 2 M I T? 2 2