Gabonafélék mobilizációs folyamatainak vizsgálata reológiai és közeli infravörös spektroszkópiai módszerekkel

M Ű E G Y E T E M 1 7 8 2 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék PhD értekezés Gabonafélék mobilizációs folyamatainak vizsgálata reológiai és közeli infravörös spektroszkópiai módszerekkel Készítette: Juhász Réka okleveles biomérnök Témavezető: Prof. Salgó András tanszékvezető egyetemi tanár Budapest, 28. 1

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS... 3 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 5 2.1. A csírázás növényfiziológiai folyamatainak áttekintése... 5 2.1.2. A makrokomponensek változásai a csírázás során... 6 2.1.3. Enzimfehérjék változásai a csírázás során... 11 2.2. A csírázás vizsgálati módszerei... 14 2.3. A gyors viszkoanalizátoros technika... 16 2.3.1. A gyors viszkoanalizátoros módszer bemutatása... 16 2.3.2. A gyors viszkoanalizátoros módszer alkalmazása... 18 2.4. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása... 22 2.4.1. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása a gabonavizsgálatokban... 22 2.4.2. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása a csírázás kimutatására... 27 2.4.3. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása reológiai paraméterek becslésére... 28 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 3 3.1. Felhasznált anyagok... 3 3.2. Kísérletek menete... 3 3.2.1. Csíráztatási kísérletek... 3 3.2.2. Az amilóz/amilopektin arány vizsgálata... 31 3.2.3. A gyors viszkoanalizátoros mérések menete... 33 3.2.4. Közeli infravörös spektroszkópiai mérések menete... 35 3.2.5. Deriválási módszerek... 37 4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉS... 39 4.1. A csíráztatási kísérletek eredményei... 39 4.1.1. A csírázás nyomonkövetése RVA módszerrel... 39 4.1.2. A csírázás nyomonkövetlése NIR módszerrel... 5 4.1.3. A reológiai és spektroszkópiai mérések kapcsolatának vizsgálata... 61 4.2. Az amilóz / amilopektin arány vizsgálata RVA módszerrel... 67 4.2.1. Az RVA görbék változásai az amilóz/amilopektin arány függvényében... 67 4.2.2. Az RVA paraméterek változásai az amilóz/amilopektin arány függvényében... 7 4.2.3. Az első derivált RVA görbék változásai az amilóz/amilopektin arány függvényében... 74 5. ÖSSZEFOGLALÁS, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK... 77 6. IRODALOMJEGYZÉK... 81 7. MELLÉKLETEK... 92 2

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A mezőgazdasági és élelmiszeripari célra használt növényi nyersanyagok minőségét és felhasználási lehetőségét azok fiziológiai állapota és a fiziológiai állapotukból eredő funkcionális tulajdonságaik alapvetően meghatározzák. A gabonák aratás előtti vagy tárolás alatt bekövetkező csírázása a tartalék tápanyagként raktározott makromolekulák mobilizációja miatt azok minőségét, technológiai felhasználhatóságát jelentősen lerontja. A csírázás korai - lehetőleg még a vizuálisan érzékelhető változások előtti - felismerése lehetőséget nyújt a gyors beavatkozásra, továbbá kiemelkedő jelentőséggel bír az aratási munkák, a tárolás, a szállítás, illetve a további feldolgozás ütemezése szempontjából. A csírázás kimutatására számos módszer ismeretes (vizuális detektálás, reológiai és enzimes módszerek), melyek azonban a mobilizáció kezdeti lépéseit nem, vagy bizonytalanul képesek detektálni, ezenfelül többségük körülményes és időigényes. Napjaink analitikai módszereinek fejlesztési iránya a megbízhatóság növelése mellett a mérési idő és a mintaigény csökkentése. A néhány perc válaszidejű módszerek megteremtik a technológiai folyamatokba való azonnali beavatkozás, illetve a folyamatos minőségellenőrzés lehetőségét. A gyors viszkoanalizátoros eljárás (Rapid Visco Analyser, RVA) egy egyszerűen kivitelezhető, jól reprodukálható reológiai módszer, amely kevés minta felhasználásával a vizsgált anyag funkcionális tulajdonságait rövid mérési idő mellett széles hőmérséklet tartományban jellemzi. Alkalmazása gabonaminősítésben és kutatásban igen gyorsan terjed világszerte. A roncsolásmentes közeli infravörös spektroszkópiai (Near Infrared Spectroscopy, NIR) módszereket rutinszerűen alkalmazzák biológiai eredetű nyersanyagok alapvető minőségi paramétereinek vizsgálatára a mezőgazdasági minőség-ellenőrzésben. A gabonafélék minősítésében a végtermék minősége szempontjából döntő a sokszor igen összetett funkcionális tulajdonságok (tésztaerősség, -nyújthatóság, vízfelvevőképesség stb.) ismerete, ezért a jelenlegi módszerfejlesztések célkitűzése, hogy a kémiai (beltartalmi) paraméterek mellett a funkcionális tulajdonságokról is tájékozódhassunk a NIR spektrumok segítségével. Dolgozatom célja annak igazolása, hogy a gyors viszkoanalizátoros technika és a közeli infravörös reflexiós spektroszkópia alkalmas a gabonafélék (búza és kukorica) mobilizációs folyamatainak megbízható kimutatására és érzékeny nyomonkövetésére. Célul tűztem ki továbbá a különböző mértékben csírázott növényi anyagok funkcionális 3

ujjlenyomata (RVA görbéje) és kémiai ujjlenyomata (NIR spektruma) közti kapcsolat megteremtését matematikai módszerekkel. Értekezésemben azt vizsgáltam, hogy a gyors viszkoanalizátoros technika a funkcionális tulajdonságok meghatározásán keresztül alkalmas-e a tartaléktápanyag mobilizáció kezdeti lépéseinek kimutatására; a gyors viszkoanalizátoros görbe és annak transzformált alakja alkalmazható-e a keményítő szerkezetének és annak a funkcionális tulajdonságok kialakításában játszott szerepének alaposabb megismerésére; a mobilizáció során bekövetkező biokémiai változások kimutathatók-e közeli infravörös reflexiós spektrumok alapján, különös tekintettel a víz, a szénhidrátok és a fehérjék minőségi és mennyiségi változásaira; milyen matematikai módszerrel lehetséges a közeli infravörös spektrumokban és gyors viszkoanalizátoros görbékben, mint kémiai és funkcionális ujjlenyomatok -ban rejlő információkat összekapcsolni, illetve együttesen elemezni. 4

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A csírázás növényfiziológiai folyamatainak áttekintése A hajtásos növények egyedfejlődésének ciklusa jól megfigyelhető morfológiai változások alapján hat fázisra osztható, melyek táplálkozási mód szempontjából két nagy részre bonthatók: egy autotróf és egy heterotróf jellegű szakaszra. Az autotróf táplálkozási szakaszt a vegetatív fejlődés a virágképzés és a megtermékenyítés fázisai alkotják, míg a heterotróf szakaszba tartozik az embrió- és magképzés, a nyugalmi állapot és a csírázás. A csírázás a már létrejött embrió továbbfejlődésének kezdeti szakasza, amely a nyugalmi (mag) állapotot váltja fel. A csírázás során a raktározott tápanyagok vízoldható vegyületekké alakulnak (mobilizálódnak) és a fejlődő csírába szállítódnak. [1] A csírázás két, élesen nem elválasztható szakaszra osztható: 1. duzzadás és csíra reaktiválódás szakasza 2. tartalék tápanyagok mobilizálásának szakasza A csírázás megindulásának általános feltétele a megfelelő hőmérséklet, a nedvességtartalom és oxigén. Az első szakaszban, az embrió fiziológiai reaktiválódása során a magok jelentős mennyiségű vizet vesznek fel és megduzzadnak, a sejtek megnagyobbodnak, a sejtorganellumok regenerálódnak. Az anyagcsere élénkebbé válik, aktiválódnak a glikolízis, illetve a légzési lánc enzimei, megnövekszik a NAD, UDP, ADP, és ATP termelése, megnő az oxigénfelvétel és a légzés intenzitása. A preformált (nyugvó magban is jelenlevő) mrnsek és riboszómák irányításával intenzív fehérjeszintézis és nukleinsavszintézis indul meg. Megkezdődik a tartaléktápanyagok lebontása is, melynek során, a főleg a csírarészben található szaharóz, raffinóz, szerves savak, szabad aminosavak és lipidek használódnak fel. A második szakaszra a tápanyagok lebontása és felhasználódása jellemző. Ekkor indul meg a keményítő, a tartalékfehérjék, a lipid- és foszfáttartalékok mobilizálása. Ezen komponensek a mag raktározó szöveteiben (aleuron, endosperm) találhatók. A tartaléktápanyagok mobilizációjában résztvevő hidrolitikus enzimek (amilázok, proteázok, ribonukleázok, stb.) az aleuronrétegben termelődnek. Szintézisüket a csírában termelődő fitohormonok (gibberellinek) szabályozzák. A bontástermékek a szkutellumon (pajzsocskán) keresztül a csírába szállítódnak, és így válnak az új növényi részek építőanyagaivá. [2, 3] 5

2.1.2. A makrokomponensek változásai a csírázás során A gabonák raktározó szöveteiben szénhidrátok, tartalékfehérjék, fitinsav és lipidek fordulnak elő nagyobb mennyiségben. Ezen komponensek a csírázás előrehaladásával jelentős változásokon mennek keresztül, melyek a gabonák funkcionális tulajdonságait döntően befolyásolják. A mobilizációs folyamatok megindulásának és fenntartásának elengedhetetlen feltétele a megfelelő mennyiségű víz jelenléte. Az alábbiakban a makrokomponensek közül a szénhidrátok, illetve a tartalékfehérjék változásait mutatom be részletesebben, továbbá röviden összefoglalom a vízfelvétel folyamatát és hatását a csírázás folyamán. 2.1.2.1. A nedvességtartalom változásai és a víz szerepe A csírázáshoz a magoknak folyamatosan megfelelő nedvességű környezetet kell biztosítani. Az életfolyamatok megindulásához a plazma rehidratált, duzzadt állapota szükséges. A víz nélkülözhetetlen az embrió táplálását biztosító hidrolitikus folyamatokhoz is, amelyek során a tartaléktápanyagok mobilizálódnak, azaz a növény által hasznosítható vízoldható vegyületekké alakulnak át. Az enzimek aktiválódása is részben hidrolitikus folyamat. [1] A magvak vízfelvétele viszonylag gyors folyamat, mely a nem életképes magvakra is jellemző. A duzzadás során felvett víz mennyisége fajonként változó, a kukorica és a búza eredeti tömegének mintegy 6%-ával gyarapszik a vízfelvétel következtében. A növényi mag vízforgalmát alapvetően fizikai-kémiai törvények határozzák meg, de az anyagcsere szintén befolyásolja, pl. ionok felvételekor, vagy polimerek (pl. keményítő) hidrolízise során a vízpotenciál csökken. A csírázás kezdetén, az imbibíció során gyors vízfelvétel zajlik, melynek hatására az életfolyamatok már a vízzel való találkozás után néhány perccel megindulnak, ami arra enged következtetni, hogy a metabolikusan aktív részek hidratálódnak először. Ebben a fázisban a légzés intenzitása növekszik, a preformált enzimkészlet aktiválódik, a magban található tápanyagok (szabad cukrok, illetve aminosavak) felhasználódnak. A kezdeti vízfelvételt követően egyensúlyi állapot alakul ki, mivel a mag és a környezet közötti vízpotenciál különbség lecsökken. A mag metabolikusan aktív, előkészül a csíragyököcske megjelenésére. A csírázóképes magok a csíragyököcske megjelenésekor ismét vizet vesznek fel, mely az új növényi sejtekbe kerül. Ebben a szakaszban indul meg a tartalék tápanyagként raktározott 6

makromolekulák hidrolízise, melynek következtében ozmotikusan aktív termékek (mono- és oligoszacharidok, di-és tripeptidek, szabad aminosavak, ionos vegyületek) szabadulnak fel, melyek serkentik a vízfelvételt. [3, 4] 2.1.2.2. A szénhidrátok változásai a csírázás folyamán A gabonaszemekben legnagyobb mennyiségben szénhidrátok fordulnak elő, elsősorban poliszacharidok formájában. Az endoszpermben raktározott keményítő a növények fő tartaléktápanyag-forrását képezi, mely a csírázás során hidrolízis útján hasznosul. A sejtfal legnagyobb hányadát ún. nem keményítő poliszacharidok (főleg arabinoxilánok) alkotják, melyek a csírázás folyamán -a keményítőhöz hasonlóan- vízoldható mono- és oligoszacharidokká bomlanak. A vízoldható szénhidrátok változásai A nyugvó magban az embrióban, a szkutellumban, illetve az aleuronrétegben fordulnak elő vízoldható szénhidrátok, elsősorban szacharóz és raffinóz, melyek azonnal hozzáférhető energiaforrásként hasznosulnak a csírázás kezdetén, lehetővé téve az intenzív légzést és a gyors fehérjeszintézist, amíg a keményítőhidrolízis termékei hozzáférhetővé nem válnak. [4] A keményítő, illetve a sejtfalalkotó poliszacharidok hidrolízise során a csírázás folyamán nagy mennyiségű vízoldható szénhidrát (maltóz, szacharóz, raffinóz, glükóz, maltotrióz, glüko-difruktóz, galaktóz, arabinóz, xilóz) szabadul fel. Ezeket a bomlástermékeket a szkutellum abszorbeálja, szacharózzá alakítja majd az embrióba transzportálja. [5] A sejtfal hidrolízise Az endosperm sejtfalának lebontása megelőzi a keményítő hidrolízisét, így a keményítő jobban hozzáférhetővé válik a hidrolitikus enzimek számára. A sejtfal 75%-át poliszacharidok alkotják, melynek fő komponensei az arabinoxilán (85%) és az (1 3, 1 4) β-glükán. A sejtfalalkotó poliszacharidok hidrolízise során főleg arabinóz, xilóz, galaktóz és glükóz szabadul fel. [6, 7] Az arabinoxilán lebontásának első lépéseként az arabinofuranozidáz lehasítja az arabinóz oldalláncokat, ezt követően az exoxilanáz xilobiózt szabadít fel, melyet a xilobiáz (βxilopiranozidáz) enzim alakít xilózzá. Az endoxilanázok aktivitása csak a csírázás ötödik 7

napján növekszik meg [8], azonban az xilóz/arabinóz arány állandósága arra enged következtetni, hogy ezen enzimek a sejtfal lebontásának kezdeti lépéseiben is résztvesznek.[5] Az (1 3, 1 4) β-glükánt búzában elsősorban az (1 3, 1 4) β-glükanáz: (EC 3.2.1.73.) enzim bontja glükózzá [9], de teljes lebontásában az (1 4) β-glükán-4-glükanohidroláz és az (1 3) β-glükán-3-glükanohidroláz enzimek is szerepet játszanak [5]. A keményítő változásai A keményítő a búza, illetve kukorica szárazanyagának legfontosabb poliszacharidja, a szemtömeg 7%-át alkotja, az endoszpermben keményítőszemcsék formájában raktározódik. A csírázás során energianyerés céljára használódik fel. Lebontása két úton valósul meg: a csírázás korai szakaszában foszforiláz enzimek segítségével (foszforilitikus út), majd a későbbi szakaszban amiláz enzimek közreműködésével (hidrolitikus út). A keményítő lebontásában a fő szerepet a hidrolitikus út játssza. A folyamatban résztvevő enzimeket a későbbiekben részletesen ismertetem.[2] A foszforilitikus út: Keményítő foszforiláz Glükóz-1-foszfát Glükóz-1-foszfát + UTP UDPG-pirofoszforiláz UDPG + pirofoszfát UDPG + Fruktóz-6-foszfát szacharóz -szintetáz Szacharóz-6-foszfát + UDP Szacharóz-6-foszfát foszfatáz Szacharóz Szacharóz β - fruktofuranozidáz Glükóz + Fruktóz A hidrolitikus bontás: Amilóz Amilopektin α - amiláz α - amiláz Glükóz + α - Maltóz + α - Maltotrióz Glükóz + α- Maltóz + α- Maltotrióz + α- Határdextrin α- Maltotrióz α - amiláz α- Maltóz α - glükozidáz Glükóz /maltáz/ β - amiláz Amilóz β- Maltóz β - amiláz Amilopektin β- Maltóz + β- Határdextrin ágbontó enzimek, α - gükozidáz Határdextrinek határdextrináz Glükóz 8

2.1.2.3. A fehérjék változásai a csírázás folyamán A búzaszem fehérjetartalma kb. 12%, a fehérjék főleg az aleuron rétegben és az endospermben fordulnak elő. A búza fehérjéi oldhatóság szerint csoportosíthatók: víz-, illetve sóoldható albuminok és globulinok a teljes fehérjetartalom kb. 15%-át teszik ki, míg az alkoholban, illetve lúgos közegben oldódó gliadinok és gluteninek kb. 85%-ot képviselnek.[4] Az albuminok és globulinok főleg enzimek, míg a gliadinok és gluteninek főleg tartalékfehérjék. [1] A búzamag tartalékfehérjéinek 8%-az endospermben található.[11] A búza nitrogéntartalmának nagy része gliadin fehérjék formájában tárolódik, melyek az endospermben helyezkednek el és a teljes fehérjetartalom 5%-át teszik ki. [12] A búza tartalékfehérjéi alkoholban oldhatók, három nagy csoportjuk az S-szegény gliadinok, az S- gazdag gliadinok és a nagy móltömegű (HMW)-gluteninek. A tartalékfehérjék membránnal körülvett fehérjetestekben helyezkednek el a magban. A HMW-gluteninek a tartalékfehérjék 5%-át teszik ki, nagy oldhatatlan komplexeket képeznek és nagysűrűségű fehérjetestekben raktározódnak. [13] A fehérjék mennyiségi és minőségi változásai a vízfelvétel után nem közvetlenül tapasztalhatók, mert bizonyos előfeltételeknek teljesülnie kell: endoproteázok (ciszteinproteáz) de novo szintézise aminosavakból [14], a tartalékfehérjék kémiai módosítása (redukálás thioredoxinnal [1], deamidálás, módosítás cisztein proteázzal) [15]. A teljes nitrogéntartalom búzánál 3 nap alatt kismértékben csökkent (kb.92%-ra), míg kukoricánál nem változott. A szárazanyagra vonatkoztatott fehérjetartalom búzánál 3 nap alatt (72 óra) néhány százalékkal csökkent [16]. A teljes fehérjetartalom a csírázás elején (-24 h) csökkent, majd közel állandó maradt (24-96 h) [1] Az albuminok és globulinok mennyisége a csírázás kezdetén erőteljesen lecsökken, majd 24-96 óra között növekszik. [1] Az albuminok mennyiségének mérése alkalmas lehet a növényfiziológiai állapot, így a csírázás előrehaladottságának becslésére, ezért ipari mezőgazdasági célokra jól alkalmazható. [2] A tartalékfehérjék mennyisége (a glutenin és gliadin együtt) az imbibíciótól számított 72 óráig alig változott, utána csökkent. [1] A glutenin, illetve gliadin fehérjék mennyiségének változásairól ellentmondásos eredmények születtek. Hartmann és mtsai (26) [17] azt találták, hogy a gluteninek hamarabb hidrolizálódnak, mint a gliadinok. A lebontás intenzív szakasza glutenin esetén 54 óra, míg gliadin esetén 96 óra után kezdődött. 9

Kobrehel és mtsai (1992) [1] kísérletei során a gliadinok mennyisége 96 óra alatt folyamatosan a felére csökkent, míg a glutenin mennyisége 72 óráig állandó maradt, majd csökkent. Bottari és mtsai (1996) [12] szerint a gliadinok in vitro hidrolízise a 24. óra után kezdődött. Shimoni és Galili (1996) [13] megállapították, hogy a csírázás folyamán a monomer gliadinok hidratálódnak először, így gyorsan mobilizálódnak, majd miután elbomlottak, akkor válnak hozzáférhetővé a fehérjebontó enzimek számára a HMWgluteninek. 2.1.2.4. Lipid mobilizáció A lipidek a magon belül a szkutellumban (pajzsocskában) találhatóak. A lipidek bontásának célja egyrészt az energiaszolgáltatás, másrészt a membránok felépítéséhez szükséges építőkövek előállítása. A bontás többféle mechanizmussal zajlik, úgymint lipázos hidrolízissel, β-oxidációval, illetve a glioxilát ciklus révén. [2, 4] 2.1.2.5. Fitinsav mobilizáció A búzában az összes foszfor 7-75%-a fitinsav (hexamioinozit.-hexafoszfát) formájában van jelen, amely vegyület azonban nem transzportképes. A fitinsavból az aleuron rétegben található fitáz enzimek szabadítják fel a szervetlen foszfátokat. A csírázás kezdetén az imbibíciót (duzzadást) követően megindul a szervetlen foszfátok transzportja a raktározó szövetek (aleuron, endoszperm) felől a növekvő régiók (szár, gyökérrészek) felé. [2, 4] 1

2.1.3. Enzimfehérjék változásai a csírázás során A tartalék tápanyagként raktározott makromolekulák nagy energiatartalmú monomerekből épülnek fel, melyek az új növény szöveteinek felépítéséhez szükséges építőköveket is szolgáltatják. A makrokomponensek mag raktározó szöveteiben (aleuron réteg, endosperm) helyezkednek el, és enzimes bontás útján hasznosulnak. Az enzimek az aleuron rétegben aktiválódnak (preformált enzim készlet), illetve képződnek (de novo szintézis), majd az endoszpermbe jutva fejtik ki hatásukat. Az enzimek aktiválódását a csírában képződő gibberellinek szabályozzák. A gabonák csírázása során a szénhidrátbontó enzimek (keményítőhidrolizáló és sejtfalbontó enzimek), pirofoszforilázok, proteázok, lipázok, észterázok, fitázok és foszfatázok változásai a legnagyobb jelentőségűek. [2] Az alábbiakban a gabonák funkcionális tulajdonságait leginkább befolyásoló, szénhidrát-illetve fehérjebontó enzimeket mutatom be részletesebben. 2.1.3.1. Szénhidrátbontó enzimek Sejtfalbontó enzimek Az arabinoxilánok bontásában arabinofuranozidáz, exoxilanáz, endoxilanázok, és xilobiáz vagy β-xilopiranozidáz enzimek vesznek részt, arányuk a csírázás során változó. Az arabinofuranozidázok arabinózt szabadítanak fel és már a csírázás korai fázisában megkezdik a sejtfal lebontását. [8] Az endoxilanázok a csírázás 3.-5. napjára szintetizálódnak, majd ezt követően aktivitásuk folyamatosan növekszik. [9] Az (1 3, 1 4) β-glükán lebontásában fő szerepet játszó (1 3, 1 4) β-glükanáz enzim (EC 3.2.1.73.) glükózt szabadít fel, aktivitása folyamatosan nő a csírázás során. [9] Keményítőbontó enzimek A keményítő hidrolitikus bontásában α- és β-amilázok, ágbontó enzimek (határdextrinázok) és α-glükozidázok vesznek részt. [2, 4, 5] Az α- és β-amilázok a keményítőmolekula α-d-(1 4) glikozidos kötéseinek hasításával α-, illetve β-maltózt állítanak elő. Az α-amilázok (α-1,4-glükán glükanohidrolázok, E.C.3.2.1.1.) endogén hatásuk révén az keményítőlánc belső kötéseit hasítják. Az amilózból a hidrolízis kezdetén 6-8 glükózból álló 11

oligomerek képződnek, amelyek csökkent sebességgel maltózzá és maltotriózzá hasadnak. Végül a maltotrióz még kisebb sebességgel tovább hidrolizálódik maltózra és glükózra. Az amilopektint két elágazás között az α-amiláz csak akkor képes bontani, ha legalább 6 glükózegységből álló lineáris szakasz áll rendelkezésére. Egyedül α-amilázzal kezelve az amilopektint az α-maltóz és a glükóz mellett 5-15 glükózegységből álló, 1-2 elágazást tartalmazó oligomerek, ún. α-határdextrinek keletkeznek. [18] A csírázás folyamán az α-amilázok játszák a fő szerepet a keményítő lebontásában, azonban hatékonyságukat a β-amilázok jelenléte fokozza.[19] Az α-amilázok az aleuron rétegben de novo szintetizálódnak a csírázás során. Működési optimum alapján magas (pi=6,3-7,5), illetve alacsony (pi=4,9-6,) ph optimummal jellemezhető α-amilázokat különböztetünk meg. [2] Előbbiek a csírázás korai szakaszában termelődnek, míg az utóbbiak a későbbi szakaszban fejtik ki hatásukat, amikor a keményítőbontásból származó cukrok mennyisége megnövekszik. [21] Az α-amiláz aktivitás az imbibíciót követően igen alacsony, majd búza esetében 24 óra után [9], míg kukorica esetében 48 óra után [22] gyors növekedésnek indul. A β-amiláz (α-1,4-glükán maltohidrolázok, E.C. 3.2.1.2.) exoenzimek β-maltózt hasítanak le a keményítő nem redukáló végéről. Amilóz és malto-oligoszacharidok hidrolízisénél attól függően, hogy a lánc páros vagy páratlan számú glükózegységből áll, maltóz vagy maltotrióz képződik. Az amilopektin hidrolízise is a nem redukáló láncvégeken kezdődik, de a β-amiláz az α-d-(1 6) elágazásokat sem bontani, sem átugrani nem képes, ezért egy nagy molekulatömegű β-határdextrin marad vissza, amely az összes eredeti α-d-(1 6) glükozidos kötést tartalmazza. [18] A β-amiláz már a csírázás megindulása előtt jelen van érett magban, kétféle formában: oldható (vagy szabad), illetve látens (vagy kötött) állapotban. A szabad β-amiláz bontja a keményítőt mialatt az α-amiláz de novo szintetizálódik az aleuron rétegben. [23] A kötött β- amiláz a gluteninfehérjékhez diszulfid-hidakkal kapcsolódik, így a S-S kötések elbontásával, vagy a glutenin elbontásával aktiválható. [4] A β-amiláz már a csírázás kezdetén, az α-amiláz de novo szintézise folyamán kifejti hatását [23], aktivitása a későbbiekben kismértékű növekedést mutat. [9] Az α-glükozidázok (α-1,4-glükán glükohidrolázok, glükoamilázok E.C.3.2.1.3.) exoenzimek, közvetlen glükóz lehasítást végeznek a poliszacharidokról, illetve a maltózt képesek glükózzá bontani. A keményítőt a nem redukáló láncvégeken kezdik hidrolizálni, 12

béta konfigurációjú glükózegységeket hasítanak le. [18] Ezek az enzimek a nem csírázott mag külső héjában (pericarpjában) is megtalálhatók, csírázás során aktivitásuk gyorsan nő [5]. Az ágbontó enzimek vagy határdextrinázok (R-enzim, amilopektin-1,6-glükozidáz, E.C. 3.2.1.142.) az amilopektinben, illetve dextrinekben található α-1,6 kötéseket bontják. A csírázás folyamán a határdextrinázok de novo szintetizálódnak, aktivitásuk hosszú idő (néhány nap) után éri el a maximumot [5, 24]. 2.1.3.2. Fehérjebontó enzimek A tartalékfehérjék lebontásában háromféle enzimcsoport vesz részt: endopeptidázok, exopeptidázok és peptid hidrolázok. Az endopeptidázok az aleuronrétegben termelődnek és kisebb peptidekre bontják a tartalékfehérjéket, melyekről az exopeptidázok aminosavakat hasítanak le. A peptidek és aminosavak a szkutellumba kerülnek, ahonnan az exopeptidázok és peptid hidrolázok működésének hatására már kizárólag szabad aminosavak jutnak az embrióba. [4, 5] A tartalékfehérjék lebontásában a legnagyobb szerepe az endoproteázoknak van, melyeket az aktív centrumban található aminosav alapján csoportosítunk. Legjelentősebb képviselőik az aszparaginsav proteáz és a cisztein proteáz. Az aszparaginsav proteáz a nyugvó magban is jelen van [11, 15], elsősorban a ω- és γ-gliadinokat bontja, cisztein proteáz, ill. karboxipeptidáz jelenlétében hatékonysága megnő. [15] A cisztein proteázok felelősek a tartalékfehérjék lebontásának 9%-áért. [12] A csírázás kezdetén de novo szintetizálódnak, aktivitásuk növekszik a csírázás során, és a negyedik napon éri el a maximumot. Először a ω- gliadinokat [15], majd a HMW glutenineket hidrolizálják [11]. Az endoproteázok által felszabadított polipeptideket az exopeptidázok bontják tovább az endospermben, illetve szkutellumban. [4]. A szkutellum gyorsan felveszi a kisebb peptideket, így a fehérjebontás utolsó lépései nem az endospermben zajlanak. [5, 15] Búzában és árpában ötféle karboxipeptidázt azonosítottak. A szerin-karboxipeptidáz 36 órával az imbibíció után jelenik meg a szkutellumban, aktivitása 48-72 óra között maximális, majd 96 óra után mennyisége erősen lecsökken. [25] Az aminopeptidázok közül a bázikus aminopeptidáz mutat nagy aktivitást a szkutellumban. [15] A di-és tripeptideket az exopeptidázok igen kis aktivitással hasítják, ezeket a peptid hidrolázok bontják aminosavakra.[4, 5] 13

2.2. A csírázás vizsgálati módszerei A gabonák csírázása során a szemek összetétele, minősége alapvetően megváltozik. A tartaléktápanyagok lebomlása illetve átalakulása a búza és a kukorica sütőipari, közvetlen fogyasztási vagy takarmányozási célú felhasználhatóságát számottevően csökkenti, így jelentős gazdasági károkat okozhat. Ennek megelőzése érdekében a kutatók minél egyszerűbben kivitelezhető vizsgáló módszereket igyekeznek kifejleszteni, melyek segítségével a fiziológiai folyamatok megindulását már a korai fázisban ki lehet mutatni, lehetőleg még azelőtt, hogy annak szemmel látható jelei, illetve minőségrontó hatásai mutatkoznának. Az alábbiakban a csírázottság kimutatására korábban kidolgozott módszereket tekintem át. Egyszerűen kivitelezhető, szabványos eljárás a szemrevételezés, melynek során a vizsgált mintában a csírázás jeleit mutató szemek arányát statisztikai módszerekkel kiértékelve minősítik a gabonatételt. [26] A csírázás kimutatására, illetve a csírázottság mértékének megállapítására objektív módszer az α-amiláz aktivitás meghatározása, melynek lehetséges módszerei: - az enzimreakció bontástermékeinek meghatározása színreakció segítségével, - az aktív α-amiláz jelenlétének kimutatása immunkémiai módszerekkel, illetve - az amiláz aktivitás okozta keményítőbomlás hatására bekövetkező funkcionális, reológiai tulajdonságok változásainak kimutatása. Az α-amiláz aktivitás mérésére klasszikus módszer keményítőszubsztrát bomlásának követése jódreakcióval [27], illetve a maltózszám meghatározás. [28] Az enzimaktivitás detektálása lehetséges fényszórás mérésével is, mely azon alapul, hogy a szubsztrátként alkalmazott β-határdextrin szuszpenzió turbiditása az amiláz mennyiségével arányos mértékben csökken. [29, 3, 31] A β-határdextrin szubsztrát mennyiségének csökkenése festékkötéses [32], illetve fluorimetriás [33] módszerrel is kimutatható. A festékfelszabadításon alapuló módszerek esetén a keményítőről (Phadebas-teszt [34]) vagy modellszubsztrátról (Ceralpha-módszer [35]) lehasadó festékanyagok mennyisége arányos az amilázaktivitással. Az aktív α-amiláz jelenlétének kimutatását szolgáló immunkémiai módszerek közül az ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) módszert egyszerűen kivitelezhető gyorstesztek formájában széleskörűen alkalmazzák gabonák csírázottságának ellenőrzésére. [36] 14

A viszkozimetriás eljárások során a liszt-víz szuszpenzió, esetleg tészta viszkozitásának változását elemezzük, melyből a hidrolitikus hatásokra (pl. keményítő bomlás) és ezen keresztül a csírázottságra lehet következtetni. Napjainkban is elterjedt, szabványos eljárás a Hagberg-Perten-féle esésszám meghatározás [37] és az amilográfos méréstechnika [38]. További lehetőség a penetrométeres vizsgálat, amely azonban lassú, pontatlan módszer, ezenfelül készülékigényes [39]. A jelenlegi egyik leggyorsabb, egyszerűen kivitelezhető, szabványos viszkozimetriás módszer [4] a gyors viszkoanalizátoros technika (Rapid Visco Analyser, RVA), melynek működési elvét, alkalmazhatóságát külön fejezetben ismertetem. A funkcionális mérési eljárások lényege, hogy a vizsgálandó gabonamintából próbasütést végeznek, majd a próbacipót tesztelik: meghatározzák térfogatát, alaki hányadosát, vizsgálják gázképző tulajdonságát, illetve a bélzet ragacsosságát, rugalmasságát. A módszer előnye, hogy a végfelhasználást imitálja, hátránya a lassúság és a pontatlanság. Az RVA technikával egy objektíven értékelhető gyors teszt alapján lehetőségünk nyílik a sütés utáni tulajdonságok becslésére. [41] A közeli infravörös spektroszkópia (Near Infrared Spectroscopy, NIR) gyorsan kivitelezhető, roncsolásmentes minősítő módszereket kínál, emiatt régóta próbálják alkalmazni gabonafélék csírázottságának kimutatására. A NIR módszereket és alkalmazási lehetőségeit egy későbbi fejezetben részletesen ismertetem, ezért itt csak röviden említem a főbb megközelítési módokat. Klasszikus módszer a csírázottság mértékének jellemzése különféle referenciaadatok használatával, és azok becslése a NIR spektrumok alapján. Referenciaadatként szerepelhetnek az α-amiláz aktivitás értékek, a viszkozimetriás módszerek eredményei (Hagberg-féle esési szám, RVA keverési szám), illetve a csírázottság biológiai módszerrel mért adatai. [26] Megfelelő matematikai módszerek alkalmazásával a csírázása során bekövetkező változások kizárólag a közeli infravörös spektrumok alapján is nyomon követhetők [42], míg közeli infravörös spektroszkópiai képalkotó módszerekkel a biokémiai változások morfológiai háttere is feltérképezhető. [43] 15

2.3. A gyors viszkoanalizátoros technika A gyors viszkoanalizátoros (Rapid Visco Analyser, RVA) technika egy egyszerű, jól reprodukálható, könnyen kivitelezhető reológiai módszer, amely a keményítőtartalmú minták fiziko-kémiai, technológiai, funkcionális tulajdonságairól nyújt felvilágosítást. A készüléket 1987-ben egy ausztrál kutatócsoport fejlesztette ki [44], alkalmazása igen gyorsan terjed világszerte. 2.3.1. A gyors viszkoanalizátoros módszer bemutatása A módszer lényege, hogy a kis mennyiségű (néhány gramm) vízzel kevert mintát egy fűthető fémtégelybe helyezzük, amelybe egy speciálisan kialakított formájú keverőt illesztünk. A vékony alumínium lemezből készült henger alakú mintatartó tégelyt egy szabályozható hőmérsékletű egységbe tesszük. A mintatartó tökéletesen illeszkedik a hőszabályozó egységbe, így megfelelő hőátadási körülmények alakulnak ki. A mérés során egy előre megadott időprogram szerint változtatjuk a hőmérsékletet. A mintatartóhoz tartozik a keverő, amelyet a motor hajt. A motor forgatónyomatékát egy tachométer méri. A keverési sebesség a mérés kezdetekor magasabb (9/perc), majd a minta homogenizálása után lecsökken (16/perc), és a mérés végéig állandó értéken marad. Mivel a folyamat során a minta viszkozitása változik, az állandó keverési sebesség fenntartásához a motor változó erősségű áramot igényel. Az áramerősség (I) arányos a keverési számmal ( Stirring Number, SN) amely arányos a minta viszkozitásával (1) [44]. ( 1I 2 + I ) SN = 3 1 SN~1cP (1) A minta jellegétől, illetve a mérés céljától függően különböző idő-hőmérséklet profilokat alkalmazhatunk. [45] Gabonalisztek, illetve keményítők vizsgálata során legszélesebb körben az ún. Standard 1 profilt alkalmazzák (ICC Standard Method No. 162). A Standard 1 profil lefutása az 1. ábrán látható. A mérés kezdetén 6 másodpercen keresztül 5 C-os a hőmérséklet, majd a minta termosztálása után 222 mp alatt 95 C-ig emelkedik. A hőntartási szakaszban 95 C-on kevertetjük a mintát 15 mp-en keresztül, majd 228 mp alatt visszahűtjük 5 C-ra, majd ezen a hőmérsékleten tartjuk a mérés végéig. A teljes mérés 78 másodpercet vesz igénybe. [46] 16

Az RVA-mérés eredményeképpen egy idő-viszkozitás görbét kapunk (1. ábra). Az adott idő-hőfok profilhoz tartozó görbe lefutása jellemző a minta típusára, így pl. a keményítőtartalmú minták hasonló jellegű görbével rendelkeznek. A mérések kiértékelése ezen görbe nevezetes pontjainak meghatározásából áll. A görbe paraméterei mögött jól meghatározható fizikai-kémiai jelenségek állnak [46]. Az RVA-görbe alakját, lefutását számos körülmény befolyásolja, úgymint a minta típusa [47], nedvességtartalom [46], szemcseméret [48], az alkalmazott hőmérséklet-program [49]. A különböző lefutású görbéket számos paraméterrel jellemezhetjük. A keményítőtartalmú minták jellemző RVA-görbéje alapján leggyakrabban a következő paramétereket határozzuk meg (1. ábra): 35 1 viszkozitás (cp) 3 25 2 15 1 5 csúcsviszkozitás forró tészta vis zkozitás csirizesedési idő végső viszkozitás visszaesés dermedés 9 8 7 6 5 4 3 2 1 hőmérséklet ( C) 1 2 3 4 5 6 7 8 idő (sec) 1. ábra Az RVA-görbe nevezetes paraméterei 1. Csirizesedési hőmérséklet [ C] ( pasting temperature ): az a hőmérséklet, amelynél a viszkozitás legalább 25cP-zal növekszik 2 másodperc alatt, amennyiben a Standard 1 profilt alkalmazzuk. 2. Csúcsviszkozitás [cp] ( peak viscosity ): a felfűtési szakaszban, vagy rögtön azt követően mért maximális viszkozitás 3. Csirizesedési idő [min] ( peak time ): az az időpont, amikor a csúcsviszkozitás megjelenik 4. Forró tészta viszkozitás [cp] ( trough ): a csúcsviszkozitás után, a hőntartási szakaszban megjelenő lokális minimum 5. Végső viszkozitás [cp] ( final viscosity ): a mérés végén mérhető viszkozitás 17

6. Dermedés [cp] ( setback ): a végső viszkozitás és a forró tészta viszkozitás különbsége 7. Visszaesés [cp] ( breakdown ): a csúcsviszkozitás és a forró tészta viszkozitás különbsége [46]. Az RVA hasonló elven alapul, mint a korábban standardként alkalmazott Brabender Amylograph. Összehasonlító vizsgálatokkal megállapították, hogy azonos hőfok-profil esetén a két készülék nagyon hasonló lefutású görbét szolgáltat [5-52]. A gyors viszkoanalizátoros módszer előnye abban áll, hogy ugyanazt az eredményt rövidebb idő alatt, kevesebb minta felhasználásával éri el, mint a hagyományos reológiai módszerek. A gyors viszkoanalizátoros technika eredményei jól reprodukálhatóak. Az 1. táblázatban BL55 búzaliszt mintával végzett öt párhuzamos mérés RVA paramétereinek átlageredményeit és statisztikai adatait tüntettem fel. Az egyes paraméterek relatív szórása,5-4,2% között található. Legkisebb hibával a csirizesedési idő határozható meg, amely a minta típusától függ. A viszkozitásértékek valamivel nagyobb hibával mérhetők, azonban a relatív szórás minden esetben 5% alatt marad, ami ezen reológiai módszer megbízhatóságát bizonyítja. RVA paraméter átlag szórás relatív hiba (%) Csúcsviszkozitás [cp] 3114 97 3,1 Forró tészta viszkozitás [cp] 2243 62 2,8 Visszaesés [cp] 871 37 4,2 Végső viszkozitás [cp] 3683 84 2,3 Dermedés [cp] 144 23 1,6 Csirizesedési idő [min] 6,4,3,5 Csirizesedési hőmérséklet [ C] 65,9,46,7 1.táblázat Az RVA paraméterek pontossága Az alábbiakban az RVA módszer főbb alkalmazási lehetőségeit mutatom be, különös tekintettel az amilóz / amilopektin arány meghatározás és a csírázás kimutatása területén elért eredményekre. 2.3.2. A gyors viszkoanalizátoros módszer alkalmazása Az RVA módszer széleskörűen használható gabonafélék feldolgozás utáni és alatti reológiai tulajdonságainak gyors, pontos becslésére. A megfelelő hőmérséklet profil mellett liszttel végzett mérések objektív adatokat szolgáltatnak különféle késztermékek bizonyos tulajdonságairól, pl. metélt tészta főzés utáni lágyságáról [47], a főtt rizs texturájáról [53], 18

vagy a kész kenyér, illetve sütemény szerkezetéről, alaktartási képességéről, anélkül, hogy sütési próbát kellene végezni [41]. A viszkozitásgörbe a minta összetételére igen érzékeny, ennélfogva a módszer igen alkalmas különböző eredetű lisztek közötti különbségek kimutatására [47], illetve adalékanyagok [54], vagy kémiai módosítások [55] reológiai hatásának vizsgálatára. A búzaliszt egyes komponenseinek a csirizesedésre gyakorolt hatását vizsgálva megállapították, hogy a csúcsviszkozitást legnagyobb mértékében a keményítő határozza meg, de értékét a sikérfehérjék, lipidek és pentozánok jelenléte is befolyásolja. [56]. A fehérjék hidratálódásuk és keményítővel való kölcsönhatásuk révén növelik a csúcsviszkozitást és mérséklik a tixotróp jelleget, míg a lipidek akadályozzák a vízfelvételt csökkentve a viszkozitást. [57]. Kukoricakeményítők viszkozitás-görbéjén a nehezen szolubilizálható amilóz-lipid komplex kialakulása miatt lipidek jelenlétében két csúcs jelenik meg. [58] A nem keményítő eredetű poliszacharidok (elsősorban arabinoxilánok) erős vízkötőképességüknek köszönhetően növelik a csúcsviszkozitást és javítják a búzaliszt sütési tulajdonságait. [54] A foszfáttal kezelt keményítőben kialakuló amilopektin-aggregátumok szintén fokozzák a vízfelvevőképességet növelve a csúcsviszkozitást. [55] A szemcseméret RVA-görbét befolyásoló hatása kukoricaszem keménységének becslésére adott lehetőséget. [59] Reológiai módszerrel a gabonafélék raktározott tápanyagait (keményítőt, fehérjét) bontó hidrolitikus enzimek aktivitása meghatározható. α-amiláz aktivitás alapján a különböző helyekről származó édesburgonyák [6], illetve búzák [61] technológiai felhasználhatóságát, tárolás alatti stabilitását becsülték. Az endoproteolitikus aktivitás mérése a sikér-hidrolizáló enzimek kimutatásában és működési optimumának meghatározásában nyújt segítséget. [62] 2.3.2.1. Keményítő szerkezetének vizsgálata A keményítő két különböző szerkezetű komponense: a lineáris amilóz és az elágazó láncú amilopektin eltérő funkcionális tulajdonságokkal jellemezhető. Az amilóz/amilopektin arány a gabonák genetikailag kódolt jellemzője; a keményítő fizikai tulajdonságait (szemcseméret, és szerkezet, kristályosság, vízfelvevőképesség stb.) és ezáltal a gabonaalapú nyersanyagok technológiai felhasználhatóságát erősen befolyásolja. Az amilóz / amilopektin arány meghatározására, illetve a keményítő szerkezetének vizsgálatára számos módszer ismeretes. Az amilóztartalom mérésére kolorimetriás [63], enzimes [64], és gélkromatográfiás [65] módszerek használatosak. A keményítőszemcsék 19

kristályos szerkezete röntgen diffrakciós [66, 67], termikus tulajdonságai differenciális pásztázó kalorimetriás (differential scanning calorimetry, DSC) módszerrel tanulmányozhatók [68-72]. A csirizesedést követően kialakuló keményítőgél szerkezetének felderítésére fénymikroszkópos [73], illetve pásztázó elektron mikroszkópos módszerek [74] alkalmasak; míg a gél mechanikai tulajdonságait (szilárdság, stabilitás stb.) állományvizsgáló berendezéssel (Texture Profile Analyzer, TPA) határozzák meg [75, 76]. A különböző összetételű keményítők csirizesedési tulajdonságai gyors viszkoanalizátoros technikával vizsgálhatók. Az amilopektin pl. viaszos kukoricakeményítő- igen gyorsan nagymennyiségű vizet képes felvenni, ezért magas csúcsviszkozitás érték jellemezi [7], mely kémiai módosítással, pl. foszforilálással tovább növelhető [55]. A duzzadt szemcsék azonban az intenzív keverés hatására könnyen felbomlanak, a víz kiáramlik belőlük, így a viszkozitás hirtelen jelentősen lecsökken. A csökkenés (visszaesés) mértéke függ az amilopektin szerkezetétől: a hosszabb láncok elősegítik a szemcsék közti kölcsönhatások kialakulását ezáltal ellenállóbbá teszik a gélt a környezeti hatásokkal szemben [77]. A nagy amilóztartalmú keményítő magas hőmérsékleten nehezen veszi fel a vizet, ezért alacsony viszkozitás [72, 78] és magas - 1 C feletti - csirizesedési hőmérséklet [7] jellemzi. Az amiláz enzimekkel nem, vagy alig emészthető ún. rezisztens keményítők általában nagy amilóztartalmúak [79], ezért viszkozitásuk kisebb, mint a normál keményítőké, így jelenlétük RVA mérésekkel igazolható [8]. A keményítő csirizesedése során a kezdeti vízfelvételt az amilopektin elősegíti, míg az amilóz hátráltatja azt [81], ezért különböző őrlemények, lisztek, keményítők és keményítőkeverékek esetén az amilóztartalom növelésével nő a csirizesedési hőmérséklet [69], és csökken a csúcsviszkozitás [82]. A hosszú, lineáris amilózmolekulák egyúttal elősegítik a duzzadt szemcsék integritásának fenntartását, ami a viszkozitás csökkenést (breakdown) mérsékli [72]. Az RVA mérés végén, a hűtés hatására fellépő viszkozitásnövekedés mértéke függ a kialakuló gél szerkezetétől, melyet a kiáramlott amilóz erősít [68], ezért a végső viszkozitás pozitív korrelációt mutat az amilóztartalommal [76]. 2

2.3.2.2. A csírázás kimutatása gyors viszkoanalizátoros technikával A csírázás hatására a tartaléktápanyagok mobilizációja miatt a gabonák fiziko-kémiai, reológiai tulajdonságai megváltoznak. A kalászban csírázás (preharvest sprouting, PHS) kimutatására alkalmas, könnyen kivitelezhető, jól reprodukálható reológiai méréstechnika kidolgozására irányuló kutatások eredménye a gyors viszkoanalizátor és a keverési szám mérési módszer ( Stirring Number Method ) kifejlesztése. [44] Az RVA keverési szám (Stirring Number, SN) meghatározás abban áll, hogy a vízzel elkevert mintát 3 percig 95 C-on kevertetik, majd a végső viszkozitást olvassák le. A csírázás következtében a viszkozitás kisebb értéket vesz fel, mint az érintetlen minták esetén. A keverési szám fordított arányban áll az α-amiláz aktivitással [83], és szorosan korrelál az esésszámmal (Falling Number, FN) [84]. Árpa esetén SN alapján a korai csírázásnak indult és intakt minták megkülönböztetésére alkalmas határértéket próbáltak meghatározni, mely az átvételi minőségellenőrzés területén nyújt segítséget. Bason és mtsai (1993) [85] szerint fajtától függően a 144-18 cp alatti SN-nel jellemezhető minták csírázottnak tekinthetők. Schwarz és mtsai (24) [86] eredményei alapján az 156 cp alatti SN, illetve 25 sec feletti FN arra utal, hogy a mintában számottevő az α-amiláz aktivitás, tehát megkezdődött a mobilizáció. Bueckert és mtsai (27) [83] legfrissebb közleménye általános határértékként 12 cp-t javasol. A búza korai csírázásának hatásai standard hőmérsékletprofil alkalmazásával is vizsgálhatók. A paraméterek közül a csúcsviszkozitás bizonyult a legérzékenyebbnek a keményítő szerkezeti és mennyiségi változásaira, mely a csírázás előrehaladásával csökkent.[87] Hareland vizsgálatai szerint a nagy amilázaktivitású búzaminták csúcsviszkozitása és esésszáma a korpa őrlés előtti eltávolításával növelhető. [88] 21

2.4. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása A közeli infravörös spektroszkópiai (near infrared spectroscopy, NIR) módszerek körébe gyors, roncsolásmentesen elvégezhető vizsgálati módszerek tartoznak, melyeket egyre szélesebb körben alkalmaznak mezőgazdasági és élelmiszeripari alapanyagok, illetve termékek minősítésére. A fejlődő adatfeldolgozási eljárások lehetővé teszik összetett biológiai rendszerek minőségi paramétereinek rutinszerű vizsgálatát. A közeli infravörös hullámhossz tartomány 8-25 nm között helyezkedik el. A közeli infravörös spektroszkópiai technika a minta és az infravörös fotonok kölcsönhatását használja fel: a fénykvantum hatására a molekulák rezgési állapotai gerjesztődnek, eközben a fotonok egy része elnyelődik (abszorpció), reflektálódik (visszaverődik), más része áthalad a mintán (transzmisszió), és bizonyos része más utat jár be (pl. szóródik, elhajlást szenved). A közeli infravörös spektroszkópiai módszerek két alapelvű, és mérési elrendezésű csoportra oszthatók: a transzmissziós (Near Infrared Transmittance, NIT) és a reflexiós (Near Infrared Reflectance, NIR) módszerekre. Transzmissziós mérési elrendezésnél a fény áthatol a mintán, és az áteresztett fény intenzitását detektálják, ezért a méréseket a nagyobb frekvenciájú tartományban (8-11 nm) végzik. Reflexiós mérési elrendezés esetén a mintáról visszaverődő fény intenzitását mérik az 11-25 nm hullámhossztartományban. A közeli infravörös spektroszkópiai módszerek elméleti alapjait, a készülékek felépítését, és a spektrumok értelmezésének módszereit a Handbook of Near-Infrared Analysis című kézikönyv foglalja össze [89], a továbbiakban a munkámhoz kapcsolódó gyakorlati eredményeket mutatom be. 2.4.1. Közeli infravörös spektroszkópiai módszerek alkalmazása a gabonavizsgálatokban A közeli infravörös spektroszkópia ipari alkalmazása a gabonaátvétel és -feldolgozás területén valósult meg elsőként. A reflexiós és transzmissziós módszerek egyaránt alkalmasak szemes gabona (búza, kukorica, árpa, rozs, zab, rizs) és gabonaipari termékek (liszt, dara, teljes őrlemény, korpa) minőségi paramétereinek meghatározására. [9, 91] 22

A spektrumok a minta fizikai és kémiai tulajdonságairól egyaránt hordoznak információt. A fizikai tulajdonságok közül a malomiparban szemcseméret-eloszlás on-line ellenőrzésére reflexiós NIR módszereket alkalmaznak. [92] A szemkeménység becslésére szemes kukorica mintára transzmissziós módszereket dolgoztak ki [93, 94], míg teljes kiőrlésű búzaliszt esetén Fourier-transzformációs technikát alkalmaztak [95]. A NIR technikával búza sütőipari minőségének prediktálását is megkísérelték [96], azonban a minősítő paraméterek (pl. gázképzési és -visszatartási kapacitás, szemkeménység- és sűrűség) komplex jellegéből adódóan gyenge korrelációt találtak. A sütőipari termékek minőségét az alapanyagokon kívül az alkalmazott technológia is befolyásolja. Az egyik legfontosabb technológiai lépés a tészta dagasztása, amely roncsolásmentes közeli infravörös technikával on-line ellenőrizhető. [97] A kukorica takarmányozási célú felhasználása során lényeges minősítő paraméter annak emészthető energia -tartalma, amely NIR spektrumok alapján becsülhető. [98] A gabonák kémiai összetétele NIR módszerekkel elsősorban a nedvesség, szénhidrátilletve fehérjetartalom meghatározásán keresztül térképezhető fel. Az alábbiakban ezen makrokomponensek mennyiségének és szerkezetének meghatározására irányuló NIR vizsgálatok lehetőségeit mutatom be, majd összefoglalom a csírázás kimutatása és nyomon követése terén eddig elért eredményeket. 2.4.1.1. Nedvességtartalom mérése Gabonák nedvességtartalmának meghatározása a közeli infravörös spektroszkópia egyik legelterjedtebb alkalmazási területe. Kukorica [99, 1] és búza [11, 12] nedvességtartalmának egész szemből való meghatározására már a 7-es évek óta léteznek kidolgozott módszerek. A közeli infravörös spektrumok alapján a nedvességtartalom mennyiségi meghatározásán túl a víz állapotának jellemzésére is lehetőség nyílik. A vízcsúcsok hullámhosszát és intenzitását befolyásolja, hogy a nedvesség mennyire kötött állapotban van jelen, azaz a vízmolekulák hány H-híd kialakításában vesznek részt [13], illetve milyen erősségű kötéseket alakítanak ki [14]. Az elnyelési sávok maximumhelye szintén függ attól, hogy a vízmolekulák keményítővel [15, 16] vagy fehérjével [17] lépnek kölcsönhatásba. Búza érésdinamikai vizsgálatai rávilágítottak arra, hogy a víz állapotváltozásai, a makromolekulák hidratáltsági fokának átalakulásai a növényfiziológiai 23

folyamatokban kulcsszerepet játszanak, és közeli infravörös spektroszkópiai mérésekkel érzékenyen követhetők. [18] A tiszta víznek számos jellemző elnyelési sávja van: 145 nm-nél az OH kötés vegyértékrezgésének első felharmonikusa jelenik meg, míg az 119 és 194 nm-en az OH kötés vegyérték- és deformációs rezgéseinek kombinációs sávja figyelhető meg. [91] A gabonák spektrumain [12] ezen elnyelési maximumok hullámhossza az egyéb komponensekkel való kölcsönhatás miatt eltolódhat, illetve egyéb hullámhosszakon is megfigyelhetők a nedvességtartalommal összefüggésbe hozható csúcsok. A búza közeli infravörös spektrumán a legnagyobb intenzitású vízcsúcs az 189-195 nm-es régióban jelenik meg 189-192 nm között [18-111], illetve egyes szerzők szerint 1932 nm-nél [12, 112]. Elméleti megfontolások alapján nedvességtartalom mérésére az 194 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciát is javasolják. [89, 91] Az 14-145 nm-es régióban a H-hidas kölcsönhatást nem létesítő szabad víz egyes szerzők szerint 1412 nm-nél [89, 13, 18-11], míg mások szerint 145 nm-nél [15, 113] mutat elnyelési maximumot. 11-12 nm között gabonában és keményítő-víz modellkeverékben egyaránt 116 nm-nél találunk vízcsúcsot, amely a víz mobilitásának változásait érzékenyen képes kimutatni. [18, 113-115] 2.4.1.2. Szénhidráttartalom mérése A gabonák szárazanyagának legnagyobb hányadát szénhidrátok teszik ki, melyek közül jelentősek a keményítő, a vízoldható szénhidrátok (mono- és oligoszacharidok), illetve a rostok (cellulóz, hemicellulóz) és a sejtfalalkotó poliszacharidok (arabinoxilánok). Mivel valamennyi szénhidrát az OH, illetve CH kötések rezgései alapján határozható meg közeli infravörös spektroszkópiai módszerekkel, az egyes molekulatípusok megkülönböztetése a spektrumon belül igen nehéz. Teljes szem, illetve őrlemény vizsgálata esetén további korlátozó tényező a nedvesség, illetve fehérjék jelenléte, melyek abszorpciós csúcsai átlapolhatnak a szénhidrátok sávjaival. [91] A vízoldható szénhidrátok közül a szacharóztartalom meghatározása annak szabad hidroxil-csoportjai alapján lehetéges, 1434 [11], vagy 144 nm-en [15]. Búza érésdinamikai vizsgálatai során a mono- illetve oligoszacharidok mennyiségének változásait 2282 nm-en követték nyomon reflexiós mérések segítségével. [116] 24

Gabonaalapú élelmiszerek (pl. műzliszelet) oldhatatlan rosttartalma NIR mérések segítségével egyaránt becsülhető átlagos [19], illetve nagy szacharóztartalom [11] esetén. A keményítő mennyiségén túl szerkezetének változásai, illetve vízzel való kölcsönhatásai is nyomon követhetők a közeli infravörös spektrumok alapján. A keményítőtartalom (kihozatal) becslésére kukoricában reflexiós és transzmissziós módszert is kidolgoztak. [117] A keményítő finomszerkezetét, vagyis az amilóz/amilopektin arányt, is megkísérelték NIR módszerrel meghatározni, de a búzára kidolgozott kalibrációk csak közelítő becslésre alkalmasak, mert a jódreakción alapuló spektrofotometriás referenciamódszer pontossága korlátozott, az amilóz/amilopektin arány szűk tartományban változik, és a két komponens spektruma igen hasonló. [118] Kukorica amilóztartalmát keményítőben [119] és egész szemben [12] transzmissziós (NIT) módszerrel sikerült meghatározni. A keményítő szerkezeti módosításai során az OH csoportok száma, valamint deformációs- illetve vegyrétékrezgéseinek jellemző elnyelési hullámhossza megváltozhat, illetve átalakulhat a H-hidak száma és erőssége, így NIR technikával tanulmányozhatók a különböző feldolgozási technológiák molekuláris hatásai. A keményítő savas hidrolízisét Fourier-transzformációs technikával a 2128, 2272 és 2326 nmes csúcsok abszorbancia-növekedése alapján követték nyomon. [111] A keményítő őrlés során bekövetkező mechanikai sérülése ( starch damage ) meggyorsítja a hidratáció folymatát, ezért kismértékű előfordulása (5-8%) esetén kedvezően befolyásolja a sütési tulajdonságokat. A sérült keményítő arányának növelése azonban a túlzott vízfelvétel miatt a végtermék minősége szempontjából hátrányos. A sérült és nem sérült keményítő spektrumait egymásból kivonva 1442, 158, 26 és 2258 nm-nél tapasztalták a legnagyobb eltérést, tehát ezek a hullámhosszak lehetnek alkalmasak a keményítőszerkezet változásainak kimutatására. [121] A keményítő-víz kölcsönhatások a csirizesedés, tésztakialakulás és gélképzés során kulcsszerepet játszanak. A tésztakialakulás optimális feltételeit a víz mobilitása alapján határozták meg különböző keverők alkalmazásával, reflexiós módszerrel, és azt tapasztalták, hogy 116 nm-es hullámhossz a legmegfelelőbb a keményítő-víz kölcsönhatások kimutatására. [113] Az extrudálás [15], a keményítő mechanikai sérülése, illetve kenyér tárolása során [13] a keményítő molekuláris, illetve kristályos szerkezetében bekövetkező átalakulásokat 1416, 144, 152 és 158 nm-nél található csúcsok abszorbancia- és hullámhosszváltozásai alapján mutatták ki, melyek a víz, illetve keményítő OH csoportjaira jellemzőek [89-91]. Az 25