SEMMELWEIS EGYETEM Orvosi Biokémiai Intézet 1094 Budapest, Tűzoltó u. 37-47. SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS című gyakorlat előkészítése Készítette: 2011.02.21. A dokumentáció kódja: SE-OBI-OKT- MU-16 Dr. Bauer Pál egyetemi docens Dátum Változat száma: 01 Jóváhagyta: 2011.02.21. Érvénybelépés időpontja: 2011.02.21 Dr. Kolev Kraszimir tanulmányi felelős Dátum Oldalak száma: 6 MIR szempontból ellenőrizte: 2011.02.21. Mellékletek száma: 0 Dr. Kolev Kraszimir minőségirányítási megbízott Dátum Nyilvántartott példány: Munkapéldány: A példány sorszáma: Ezen Szabványműveleti előírás a Semmelweis Egyetem szellemi tulajdona. Továbbadása, sokszorosítása írásos engedélyhez kötött. A Munkautasításban szereplő információt csak a minőség- és környezetirányítási rendszer működtetéséhez lehet felhasználni.
MÓDOSÍTÁSOK JEGYZÉKE Módosította Dátum/Aláírás Módosított oldalszám Jóváhagyta Dátum/Aláírás Ellenőrizte Dátum/Aláírás Kibocsátás időpontja Oldal:2/6
TARTALOMJEGYZÉK A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS CÉLJA... 4 A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS ÉRVÉNYESÉGI TERÜLETE... 4 ILLETÉKESÉG ÉS FELELŐSSÉG MEGHATÁROZÁSA... 4 A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS LEÍRÁSA... 4 Oldal:3/6
A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS CÉLJA Összefoglalja a rutinszerűen alkalmazott technológiai eljárás részleteit. A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS ÉRVÉNYESÉGI TERÜLETE Orvosi Biokémiai Intézet oktatási előkészítő laboratóriuma. ILLETÉKESÉG ÉS FELELŐSSÉG MEGHATÁROZÁSA A dokumentum kidolgozásáért felelős: Tanulmányi felelős A dokumentum alkalmazásáért felelős: Vezető laborasszisztens A dokumentumban foglaltak végrehajtásáért felelős: Beosztott laborasszisztensek. A dokumentumban szabályozott tevékenység rendszer felülvizsgálat alkalmával történő felülvizsgálatáért felelős: A Minőségirányítási megbízott A SZABVÁNYMŰVELETI ELŐÍRÁS LEÍRÁSA I. Szubsztrátspecificitás mérés spektrofotometriával I./1 Szükséges oldatok 3 L foszfátpuffer, 50 mm, ph 7.5 20 ml NADH (0.76 g / 20 ml foszfát puffer), napi adagokban -20 C 0 on tartva 50 ml piruvát oldat, 10 mm ( 55 mg/ 50 ml foszfát puffer) 50 ml 2-ketobutirát, 250 mm (1.78 g/50 ml foszfát puffer) LDH1 (H enzim) Sigma termék, 10 ul szuszpenzió / 990 ul foszfát puffer, két naponta Készítve, gyakorlatok előtt 20szorosra higítva LDH5 (M enzim), Sigma, 100 szorosra higítva foszfátpufferrel két naponta, gyakorlatok előtt 40szeresre higítva Oldal:4/6
I/2 Bekészített eszközök Fotométerek, mérés 340 nm. 3 x 30 ml foszfátpuffer (szobahőn) 3 x 300 ul 10 mm NAD 3 x 200 ul piruvát 3 x 200 ul ketobutirát 3 x 200 ul LDH H 3 x 200 ul LDH M (fentiekkel együtt jégen) 3 x 4 db szükített műanyag küvetta keverőbotokkal Mm papír Pipetta hegyek Időmérő I /3 Gyakorlat kivitelezése Fotométer küvettájába bemérünk: 910 ul foszfát puffer, LDH1 vagy LDH5 30 ul, piruvát vagy 2-ketobutirát 30 ul, a küvettát a műszerbe helyezzük. A NAD hozzáadásával indítunk, leolvasás percenként, vagy a fotométertől függően folyamatosan, adatok ábrázolása, iránytangens meghatározása I/4 Gyakorlat kiértékelése a gyakorlatvezetővel közösen II: Laktát dehidrogenáz izoenzimek natív gélelektroforetikus vizsgálata II./1 Szükséges oldatok 500 ml foszfát puffer, 50 mm, ph 7.5 Fehérje higító: 23 ml glicerin, 25 ml Tris-HCl, 0.4 M, ph 8.5, 50 mg Brómfenolkék NAD 10 mm előhíváshoz, higítás naponta 50 mm törzsoldatból ( 1.83 g / 55 ml víz), napi adagokban 20 C 0 ) TRIS-HCl 50 ml,0.4m, ph 8.5 TRIS-HCl, 5 L, 0.2M, ph 8.0 1 l Tejsav, 0.5 M, ph 8.0 Tankpuffer 99 g TRIS, 475 g glicin / 3L (15 ször tömény) Előregyártott nativ poliakrilamid gelek (7.5%) II/2 Bekészített eszközök Tápegység és futtató kád Előre elkészített gél kazettában Szervkivonatok Szűrőpapír Vízfürdő 45C 0, tetővel Pipetta hegyek Oldal:5/6
gumikesztyű II/3 Szervkivonat készítése Patkányból: máj 15g/30 ml víz, szív 7.5g/ 30 ml víz, Izom 12g/30 ml víz, vese 12g/ 30 ml víz Leölt állatból kivett szerveket ollóval feldaraboljuk, homogenizáljuk foszfát pufferben és centrifugáljuk (400 rpm / 0 perc / 4C 0 ). Felülúszót használjuk, végső higítás kipróbálandó II/4 Előhívó 1 gélre számítva/ 3 gyakorlat: 15 ml tejsav, 70 ml TRIS-HCL, 0.2 M, ph 8.0, 3.3 ml NAD 10 mm, 10 ml nintrotetrazoliumkék (1 mg/ml), 10 ml 1.6 mg/ml fenazinmetaszulfát II/5 II/6 A géleket a készülékbe helyezzük, mintafelvitel a gyakorlatvezető utasítása szerint, elektroforézis a gyakorlatvezető által megadott körülmények között, ügyelve, hogy a hőmérséklet túl magas ne legyen. Gélek kivétele és előhívó kádba helyezése. Előhívás sötétben. Kiértékelés a gyakorlatvezetővel együtt. Oldal:6/6