Klinikai Genomikai és Személyre Szabott Orvoslási Központ 2012 Tudományos Hétf!
Biomarker azonosítás feltételei: eszközök, készségek és kollaboráció Minták, Vizsgálatok, Beteg adatok Klinikus + bioinfo Diagnosztikai kiválóság Klinikus Sikeres biomarker program Minta vizsgálati eszközök Mol biol labor Információs kincs Molekuláris biológiai jártasság Klinikus+mol biol
Biomarkerek használatával Betegbiztonság növekszik Toxicitási Biomarkerek Beteg specifikus Biomarkerek PHC Hatékonysági Biomarkerek Betegség specifikus Biomarkerek Kezelés hatékonyság növekszik
Mi az epigenetika? epi- [!"#] túl, fölött, mellett gennó [$!%%&], nemzeni, életet adni
Mi az epigenetika? Tágan értelmezve: TRANSZKRIPCIÓ SZABÁLYOZÁS DNS nukleotid sorrendjét nem befolyásoló de a génexpressziót befolyásoló tényez'k összessége Sz(ken értelmezve: ÖRÖKL)DÉS DNS bázissorrendjében nem kódolt, sejt vagy él'lény szinten örökl'd' tényez'k összessége
Valódi epigenetikai hatáshoz három generáció nyomonkövetése szükséges
Transzkripció szabályozás szintjei: kromatin szinten szabályozott a fehérjék hozzáférése a DNS-hez DNS metiláció replikáció során propagálódik Módosított hisztonvégek fehérjék kapcsolódását szabályozzák Szabályozó RNS molekulák módosíthatják a transzkripciót
DNS metilációs mintázat örökl'dése
Anyai babusgatás életen át tartó hatása DNS metiláció és hiszton módosítások változnak a babusgatás hatására és a következmények életen át tartanak. Következmény: bátrabbak és jobban tolerálják a stressz szignálokat. HDAC inhibitorral visszafordítható hatás. Nevel'anya cserével a hatás is cserél'dik tehát nem genetikai hatás.
Epi allélek Agouti vy Jirtle NRG 2007
Epi allél eltolódás diétás hatásra
Az epi allélek közös nevez'je a transzpozon jelenléte. A transzpozonok ellen a sejt epigenetikai csendesítéssel védekezik. Az epigenetika módosítások szétterjednek nagy genomi szakaszokon, ezáltal csendesítik a beekel'dött szakaszokat, pl. transzpozonokat.
Transzpozonok és DNS metiláció Fred Gage (Salk Institute): 1. A genom 20% L1 (LINE1) traszpozonból áll 2. A neuronális differenciáció els' fázisában az L1 transzpozonok rövid ideig aktiválódnak 3. Az L1 aktivitás összefügg a neuroplaszticitással (hipokampuszban 8x nagyobb marad) 4. A DNS metiláció a MECP2 Metil DNS köt' fehérjén keresztül csendesíti a transzpozonokat a HDAC1 és SOX2 komplex segítségével. RETT szindrómában nem m(ködik a DNS metiláció függ' gátlás: 1. Általános neuronális differenciációs zavar születés utáni években. 2. Emelkedett L1 transzpozon aktivitás.
Terápiás szerek amelyek epigenetikai útvonalakon keresztül hatnak: DNS metiláció gátlószerek: Azacytidine és deoxyazacytidine (FDA jovahagyas Mielodiszpláziás szindrómában) HDAC inhibítorok: Vorinostat (FDA jóváhagyott T sejt limfomára) Romidepsin (FDA 2009) Valproát egyéb Biomarker térképezések: Epigenom projektek, Methylome projektek
HETEROKROMATIN AZACYTIDINE MBP TSA, BUTYRATE HDAC MBP H3K9 MET Pargyline Met CpG H3K9 MET HDAC MBP H3K9 MET MBP H3K9 MET MBP HP1 HP1 HP1 HP1 H3K9 METH3K9 METH3K9 MET H3K9 MET HP1 MBP MBP MBP MBP
A több nyelven írt genom Tripletek nyelve Kötöhelyek kódja
Három szintje a transzkripciós esemény vizsgálatának Genomi köt'helyek RNS profil Proteom profil
Hisztonvég Módosítások H3 H4 Acetyl K Methyl R Methyl K Phos. S Ubiq. K H2A C-term H3 2 4 9 14 23 18 119 36 H4 5 8 12 16 3 1 79 20 12 5 15 20 5 1 H2B H2A Turner: Cell 2002 (111)285.
ChIP TAQMAN Q-PCR / ABI 7900 300 000 600 000 60 30 NTC
Automatizált CHIP a maximális reprodukálhatóságért IP-Star Magnetic ChIP
Illumina HiScan SQ= 150 Giga bázis/ futás 1 humán genom/ futás 30X lefedettséggel / 48 teljes transzkriptóm RNA-Seq / 24 exom-seq minta
P300 binding to enhancers is detectable by monitoring H3K27 acetylation C57Bl6: MCSF+IL4 Replicate C57Bl6: MCSF+IL4 Adipo PPRE Technical Replicates of Library preparation and sequencing ChIP Seq results of technical replicates show sharp signal on the CORE PROMOTER of ap2, and a widely expanded region on the well described ENHANCER ELEMENT (adipo PPRE).
Citogenetika Affymetrix Rendszereken
Traditional Cytogenetics Traditional Cytogenetic Techniques Excellent and robust techniques Their limitations are well recognised (resolution, variability in sample preparation)
Microarrays revolutionizing Cytogenetics "increased resolution of microarray technology over conventional cytogenetic analysis allows for identification of chromosomal imbalances with greater precision, accuracy, and technical sensitivity. Within the last 3 years, the cytogenetics community has refined: Array design and content requirements Consensus of clinically important regions and genes Resolution requirements: " Clinical regions " Other genes " Genomic backbone The value of heterozygosity data The value of SNP genotypes
Classical Cytogenetics and Microarrays Whole Genome Low Res Targeted Hi Res + Dx Yield = 3% Karyotype FISH =Confirmatory Microarray-Based Cytogenetics Simpler & more reliable Standardized workflow More information per test Quicker time to result 3 days versus 7 days Quantitative vs subjective Less expensive High earning potential for labs Dx Yield = 20%
Guidelines are available! All CNVs detected, regarding of size shall be reported! Most relevant CNVs, regions are rich in gene content! Small unknown CNVS should be reported including all the RefSeq genes in the region " Microarrays should detect gains & losses >400kb "Desirable to have good coverage along the genome and in clinical relevant genes " SNPs are important to detect regions of homozygocity, UPD and mosaicism.
The targeted plus genome-wide design Schematic of genomic region Known pathological variant Gene Known pathological variant Gene Microarray marker density
Simple chromosome visualisation Data types Files list
Fejlesztéseink UPL alapú mérési rendszerek (QPCR és mirns) Nagy átereszt! képesség# új generációs szekvenálási techonlógiák (DNS metilációs és epigenetikai profilírozás) Fehérje/ antitest el!állítási szolgáltatás (Keresztessy Zsolt)
UPL alapú oligó tervezés mirns detektálásra http://mirnadesigntool.astridresearch.com Astrid Research
Assay tervez' eredmény oldala http://mirnadesigntool.astridresearch.com
UPL alapú oligó tervezés mirns detektálásra Hsa-mir-181a: AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU Hsa-mir-181b: AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU Hsa-mir-181c: AACAUUCAAC*CUGUCGGUGAGU Czimmerer Zsolt, UDGenomed
UPL alapú oligó tervezés mirns detektálásra http://mirnadesigntool.astridresearch.com (egér szív) Czimmerer Zsolt
Vállalásaink Mit tudunk vállalni: 1. Gyakorlati segítség a kísérlet megtervezéséhez 2. Gyakorlati segítség az els!dleges adat elemzéshez 3. Speciális protokolok ismertetése 4. M#szerhasználat, hozzáférés 5. Közös projekt esetén biobankolási rendszer megtervezése felállítása 6. Közös pályázat kofinanszirozásra Beteg Klinikai minta Minta feldolgozás, Mérés Statiszt ika Ellátási kérdések Kutatási kérdések Eredmények értelmezése Publikáció
Vállalásaink Mit NEM tudunk vállalni: 1. Nagy érték# reagensek finanszirozása 2. Méréseken túli kísérletek végrehajtása 3. Eredmények másodlagos és harmadlagos analízise és értelmezése 4. Biobank felállítása pályázati vagy más finanszirozási háttér nélkül Beteg Klinikai minta Minta feldolgozás, Mérés Statiszt ika Ellátási kérdések Kutatási kérdések Eredmények értelmezése Publikáció
Finanszirozás/Kollaboráció Minden készülékünk használati díja csak a karbantartást és fogyóeszközök árát fedezi (Roche QPCR üzembérleti díja csökkent) Szekvenálási díj nagyobb volumennél csökkenthet! Affymetrix szolgáltatás díja nagyrészt a reagensek díját fedezik Kifizetett szolgáltatásnál nem javasoljuk a társ szerz!séget, de kérjük az anyagok, módszereknél való megemlítést Kollaboratív projekteknél el!re írásban meghatározandó: finanszírozási forrás, résztvev!k feladatai, projekt vezet! személye és a projekt befejezésének a várható id!pontja Finanszirozási nehézségek esetén lehetséges megoldás a közös pályázás
Összefoglalás 2 Általános információk: " http://genomics.med.unideb.hu (fejlesztés alatt) M#szer naptár: " http://nlab.med.unideb.hu/~calendar/ Elérhet!ség: " lbalint@med.unideb.hu
Scholtz Beáta (Biobanking) Keresztessy Zsolt (Citokin/Antitest) Póliska Szilárd (kapilláris szekvenálás, Affymetrix) Gyuris Tibor (Illumina szekvenálás) Zahuczky Gábor (UDGenomed)
Köszönet Debreceni Egyetem Barta Endre Gyuris Tibor Pap Attila Dániel Bence Balogh Marika Pallér Ádám Astrid Research: Steiner Laszló Laczik Miklós Nagy Otto DIAGENODE SA: Ignacio Mazon Dominique Poncelet Dider Allaer Nagy László EMBL Genomics Core Facility Vladimir Benes
Köszönöm a figyelmet!!!