(L)-tejsav lipáz enzimmel katalizált enantioszelektív transzportja membránon Enzyme-facilitated enantioselective transport of (L)-lactic acid through a membrane Kulcsár Edina, Nagy Endre Pannon Egyetem, MIK, Műszaki Kémiai Kutató Intézet, 82 Veszprém, Egyetem u. 2 Summary A growing interest has been developed for the synthesis and production of environmentally benign solvents and green chemicals. The significance of lactic acid arises from its utility as a monomer for biodegradable solvents and polymers in which the hydroxyl and the carboxyl functional groups permit it to participate in a wide variety of chemical reactions. Lactic acid, whose occurrence in nature is widespread, can be produced in large quantities by fermentation at low cost and esterification is an important step for both lactic acid purification and for the production of the environmentally benign solvents. Lactic acid esters are nontoxic and biodegradable materials having excellent solvent properties and could potentially replace toxic and halogenated solvents for a wide range of industrial and consumer uses. An enzyme often shows a high selectivity for a target substrate; therefore, we can utilize the enzyme as a biocatalyst for the resolution of optically active materials. In an aqueous solution, lipase catalyzes the hydrolysis reaction of ester compounds however, the use of lipase in nonaqueous media enables the reverse reaction that is esterfication. This characteristic can be utilized for the resolution of racemic alcohols or carboxylic acids through the esterification by lipase. Production of ethyl lactate in esterification reaction by candida antarctica lipase was studied. In the first step of the optimization of ethyl lactate production. The influence of ethanol, lactic acid and enzyme concentration, initial water content and reaction time on the all ester yield and enantiomeric excess was studied, too and a different effect was observed. The optimal conditions of the synthesis of ethyl lactate were: 4 μl lactic acid, 32 μl ethanol, 5 mg Novozym 435 lipase enzyme. After shaking the reaction mixture with 15 rpm at 4 C for 24 hours the expected yield is over 9% and enantiomeric exess 2%. This article is reported about enantioselective transport of the (L)-enantiomer from racemic lactic acid through a lipase-facilitated on SLM. Lipase from Candida antarctica (CRL) is good for catalyzing esterification in the feed phase and another lipase from porcine pancreas (PPL) is an ester hydrolysis catalyst in the receiving phase. Lipases are usually known as ester-hydrolysis catalysts, however, some of them, such as CRL are able to catalyse ester synthesis. (L)- lactic acid is selectively esterified by CRL in the feed phase, and the resulting ester dissolves into the ionic liquid phase of the SLM and diffuses across the SLM. At Interface 2 in the receiving phase, PPL catalyses the ester hydrolysis to produce the initial lactic acid and ethanol, which are water soluble. Finally, the (L)-lactic acid is selectively transported through the SLM, based on the enantioselectivity of lipases.
Bevezetés Környezetbarát oldószerek és vegyszerek szintézise és gyártása iránt jelentős igény mutatkozik. Tejsavból polimerizációval biológiailag lebontható oldószerek és műanyagok állíthatóak elő, valamint hidroxil és karboxil funkciós csoportjaival széleskörű kémiai reakcióra hajlamos [1]. Tejsav előállítása fermentációval történik a legfontosabb lépés az észterezés, hogy megfelelő tisztaságú termék keletkezzen. Tejsav észter nem toxikus biológiailag lebomló anyag kitűnő oldószer tulajdonságokkal rendelkezik, ezért kiválthatja a toxikus és halogén oldószereket [2]. Enzimek biokémiai reakciókban magas szelektivitást mutatnak a szubsztrátra, ezért tudjuk, mint biokatalizátort használni az optikai izomerek elválasztására. Vizes oldatban a lipáz katalizálja az észter komponensek hidrolízis reakcióját, azonban nemvizes közegben képes ellentétes reakcióra, vagyis észterezésre. A lipázoknak ezt a tulajdonságát használják ki racém alkoholok vagy szerves savak szétválasztásákor. Az enzimek ugyanis a királis molekulák egyik enantiomerjének reakcióját katalizálják csak, így alkoholokkal enantiomer szelektív észterképződés hajtható végre [3]. Alacsony költségű tejsav észter gyártási technológiánál fontos a hatékony szintézis és szeparációs módszer kifejlesztése [4]. Támasztóréteges folyadék membrán széles körben tanulmányozott, mint elválasztási módszer. A membrán belső pórusaiba ionos folyadékot rögzítve stabilabb folyadékmembránt kaphatunk, mivel az ionos folyadéknak elhanyagolható a gőznyomása és gyakorlatilag nem oldódik vizes oldatban [5],[6]. Az enzim katalizált enantioszelektív észterezés és a membrán szeparáció előnyeit ötvözi a racém elegy lipáz enzimmel katalizált enantioszelektív transzportja ionos folyadék alapú támasztóréteges folyadék membránon keresztül [7]. Anyagok és módszerek Enzim: triacilglicerol hidroláz, E.C. 3.1.1.3., Novozym 435, Novo Nordisk (Basvaerd, Dánia). 1U=7 μmol PLU/g, 15 min, 1 atm (PLU: propil-laurát), víztartalom: 1-2%. Egyéb felhasznált anyagok: (D,L)-tejsav 9 %-os (Reanal, Magyarország), etanol abszolút (Spektrum 3D, Magyarország) 1-Ethyl-3- methylimidazoliumbis(trifluoromethylsulfonyl) imide 99% Iolitec Membrán: STERLITECH Polipropilén.2 μm 47mm GC elemzések:acme 61 gázkromatográf. Kolonna típusa LIPODEX E,2 μm. Kolonna méret 25m x,25m, N 2 áramlási sebesség: 12 cm 3 /min, FID detektor. Rázatás, inkubálás: GFL 331 rázó inkubátorral. A reakciók enantioszelektivitását enantiomer feleslegben (e.e. %) fejeztük ki: L D e. e.( L)% = *1, L + D ahol L illetve D a két enantiomer koncentrációja. A rázatott lombikos tejsav-etil-észter előállítás körülményei: 32μl etanol, 4μl D,L-tejsav 5mg Novozym 435 lipáz enzim. A reakcióelegyet 15 min -1 intenzitással rázattuk inkubátorban 4 C-on 24 órán át. Eredmények és értékelésük Munkám során racém tejsavból candida antartica lipázzal tejsav-etil-észter előállítását vizsgáltam meghatároztam az előállítás optimális paramétereit.
Először vizsgáltam az összes észter hozamot 24 órás reakcióidő alatt, ami 9% lett valamint, az L- és a D- enantiomer arányát is, 5 óránál volt a legnagyobb az enantiomer felesleg 3% és 24 óra után közel 2% volt (1. ábra). 1 8 6 4 2 Hozam % 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3 6 9 12 15 18 21 24 Idő (h) Hozam% 1. ábra: Tejsav-etil-észter hozama és enantiomer felesleg Vizsgáltam a reakcióhoz szükséges alkohol mennyiségét a bemért tejsavra vonatkoztatva. 5- ször nagyobb alkohol mennyiség az optimális, ugyanis itt érhető el a legjobb észter hozam amellett, hogy jelentősen csökkenne az enantioszelektivitás (2. ábra). 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 1 Alkohol (mg)/tejsav (mg) Hozam % 2. ábra: Alkohol/tejsav aránya a hozamra és enantiomer feleslegre Az Enzim mennyiségének növelésével jelentősen változik a tejsav-etil-észter hozam miközben az enantioszelektivítás szinte változatlan (3. ábra). 2 4 6 8 Enzim mg 3. ábra: Enzim mennyiség hatása a hozamra és az enantiomer feleslegre A nemvizes közegű enzimes reakcióknál, különösen az egyensúlyi reakcióknál (észterezés-hidrolízis) vizsgálni kell a reakcióelegy kezdeti víztartalmára, mivel az enzim működéséhez a minimális víz szükséges, de a víz, mint termék jelenléte az egyensúlyi reakciót gátolja. A kapott eredmények alapján elmondható, hogy az összes észter hozam szempontjából minimális víztartalom az ideális. A víztartalomnak az enantioszelektivításra gyakorolt hatása viszont ettől eltérő volt. A víztartalom növekedésével az enantioszelektivítás nőtt (4. ábra). 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 Víztartalom (m/m%) Hozam% 4. ábra: Víztartalom hatása a hozamra és enantiomer feleslegre Candida antarctica (CRL) lipáz jól katalizálja az észterképződést a betáplálási fázisban, míg a sertés hasnyálmirigy (PPL) katalizálja az észter hidrolízis reakciót a permeátum fázisban. (L)- tejsav szelektíven észtereződik a canadida antarctica által, a keletkező észter
oldódik az ionos folyadék fázisban és átdiffundál a támasztóréteges folyadék membránon. A permeátum fázisban a sertés hasnyálmirigy katalizálja az észter hidrolízist és keletkezik tejsav illetve etanol, amelyek vízoldhatóak. A végeredmény (L)-tejsav szelektív transzportja a támasztóréteges folyadékmembránon. A rázatott lombikos tejsav-etil-észter előállítás optimális körülményeit, és tapasztalatait felhasználva végeztük el a membrán szeparációt. Kezdetben csak D,L tejsav candida antarctica (CRL) lipáz általt katalizált észterképződést valamint membrán szeparációt vizsgáltuk 1-Ethyl-3-methylimidazolium bis- (trifluoro- methylsulfonyl)imide ionos folyadék alkalmazva. tejsav-etil észter mg/ml 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 Idő (nap) L-tejsav etil észter betáplálás D-tejsav ertil észter betáplálás L-tejsav etil észter permeátum D-tejsav etil észter permeátum 5. ábra D,L tejsav enzimes észterezése és membránnal történő elválasztása D- és L-tejsav optikai izomerek elválasztását kitozán membránnal, valamint szilárd, optikailagaktív membránnal (kerámia membránlappal) vizsgáljuk meg. Optikailag aktív szelektorkent N-3,5-dinitrobenzoil-Lalanin-oktilesztert választottuk. Köszönetnyilvánítás A kutatómunka az OTKA 63615/26 projekt keretében készült. Irodalomjegyzék [1]C. H. Holten, Lactic Acid; Properties and Chemistry of Lactic Acid and Derivatives, 1971, Verlag Chemie, Weinheim. [2] J. J. Jafar, P. M. Budd and R. Hughes, J. Membr. Sci., 22, 199, 117 1213. [3] Gubicza, L; Bodnár, J. Magy. Kém.Lapja, 1991, 46, 2-6. [4] A. Engin, H. Haluk, K. Gurkan, Green Chemistry, 23, 5, 46 466. [5] L. C. Branco, J. G. Crespo and C. A. M. Afonso, Angew. Chem., Int. Ed.,23, 41, 2771. [6] E. Miyako, T. Maruyama, N. Kamiya and M. Goto, Biotechnol. Lett.,23, 2, 85. [7] E. Miyako, T. Mayurama, N. Kamiya and M. Goto, Chem Commun (23), 2926-2927 Az egy lépésben elért észter hozam közel 9%-os. Optikai tisztaság 15%. Az enzimes észterezési eljárások ígéretes, technológiai lehetőséget nyújtanak az optikailag aktív enantiomerek gazdaságos és környezetbarát elválasztására Az enzim katalizált eljárást és a membrán szeparációt lehet ötvözni racém szerves savak rezolválására. Hatékonyság növelés érdekében szükség van kapható membránok szelektivitásának növelésére, valamint különböző membrán típusok tesztelésére.