1. ábra: Szürkeség-szárazanyag kalibráció. Anyagok és Módszerek

Átírás

1 Kísérletek D-tejsav fermentációs előállítására Experiments for D-lactic acid production with fermentation Németh Áron, Kiss Ádám, Sevella Béla Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék H-1111 Budapest, Műegyetem rkp. 3. Summary Lactic acid is one of the oldest known chiral chemicals. Its L-enantiomer is widely produced and used both in the nature and in the human society. The renaissance of the L-lactic acid production was forced by the biodegradable plastic production on lactic acid basis, which produces PLA. This polymer has good biodegradiblity, but pure mechanic properties, thus its characteristic is under strong improvements. During this investigations it was established, that the stereocomplex polymers from L and D enantiomers has higher melting point, resulting in more widely application. Unfortunately, the production of D-lactic acid was not solved, since it is not the natural form of lactic acid. For this reason, we wanted to examine the possibilities for D-lactic acid fermentation with Lactobacillus coryniformis. We adapted a new technique for cultivation in microtiterplates. First we successfully optimized the media composition in term of carbon source (glucose) and nitrogen source (yeast extract), and obtained by Gauss-surface fitting an optimal Glucose=67,5g/L and YE=27g/L concentration. Next we noticed (on the observation that the final product titer never surpassed 65g/L, but a lot of glucose remained) that this fermentation is under strong product inhibition,. We also examined the inhibitory effect of different form of the product lactate (i.e. with Na +, Ca 2+, and NH 4 + ). We obtained that all the examined products cause total inhibition on cell growth at g/L concentration, but they differ in their effect between level of 30-60g/L: the stongest inhibition occured at NH-LA (both at 30 and 60g/L), the Na-LA has lower inhibition range, but its effect is also equal at 30 and 60 g/l, and finally Ca-LA showed hardly inhibition at 30 g/l, but strong inhibition at 60g/L. Bevezetés A tejsav a királis kémia egyik alapvegyülete. Középső szénatomjához 4 különböző ligandum kapcsolódik, amelyek különböző térbeli elrendeződése két egymással tükörszimmetrikus izomert eredményeznek. A természetben az L- izomer előfordulása az alacsonyabb rendű élőszervezetektől (pl.: prokarióták) a magasabb rendűekig (pl.: főemlősök) általános, és az emberiség iparszerűen is gyártja illetve nagy mennyiségben főleg az élelmiszeriparban felhasználja. Az igazi tömegtermelésre igény a kőolajárak 90-es évekbeli megugrásakor jelentkezett, mert a kőolaj alapú műanyagok ára a nyersanyaggal együtt emelkedett, és környezetkárosító hatásuk is előtérbe került. Noha a tejsavat szintetikusan is elő lehet állítani ipari méretekben, az emelkedő kőolaj ár és a termék racém (D és L izomer keveréke) volta miatt a fermentációs (biológiai) előállítás terjedt el. Az L- tejsav polimerizációjával kapott homopolimer biodegradálható, de mechanikai tulajdonságai kedvezőtlenek a felhasználás szempontjából (rideg, törik). Hasonló volt a helyzet a D-izomer polimerizációjakor is. A kedvezőtlen polimertulajdonságokon különböző adalékokkal sikerült javítani, ám eközben kiderült, hogy megfelelő polimerizációs körülmények mellett a két izomerből előállított sztereokomplex polimer magasabb olvasásponttal rendelkezik, így a felhasználási lehetőségek kiszélesedtek [1]. Ugyanakkor a D-tejsav előállítására még nincs nagyipari technológia, ezért a biodegradálható ám mégis széles felhasználással rendelkező politejsav előállítás és alkalmazás kerékkötője ezen izomer előállítása. A természetben túlnyomó többségben az L- izomer terjedt el, de a mikroorganizmusok között akadnak D-, illetve racém (D,L-) termelők is. A mikrobiológiailag előállított tejsav térszerkezete a termelő mikroba laktát-dehidrogenáz (LDH, EC ) enzimének sztereospecifitásától függ. Kutató csoportunkban nagy múltja van az L- tejsav fermentációs előállítását célzó kutatásoknak

2 [2,3,4,5], amelyek az utóbbi években egy magyarországon megvalósuló biofinomító technológiáját is hivatottak fejleszteni. A biofinomítóban (komplex nyersanyaghasznosító biokombinát) különböző nyersanyagokból (élelmiszer és takarmánycélra nem megfelelő minőségű (pl.:fuzáriumos) búzából, kukoricából, cukorcirokból stb.) lehetne az L-tejsav mellett a D- izomert is előállítani, amelynek jelenlegi magasabb piaci ára kedvezne a biofinomító beruházásnak is. Mindezek alapján célul tűztük ki előkísérletek megvalósítását a D-tejsav fermentációjára, és ezek eredményeinek összehasonlítását az L-izomer fermentációjával. A kísérletek során egy új módszert adaptáltunk, amelynek során nagyszámú kísérletet lehet elvégezni párhuzamosan mikrotiter lemezeken. Anyagok és Módszerek Az irodalmban [ ] D-tejsav termelőként leírt Lactobacillus coryniformis DSM20007 tejsavbaktériumot szereztük be vizsgálatainkhoz. A törzs fenntartására a tejsavbaktériumokra kifejlesztett MRS agart használtuk, a fermentációk végzéséhez pedig különböző élesztőkivonat (YE) és glükóz tartalmú MRS tápleveket használtunk rázatott lombikban és kör alapterületű 24db alacsonycellát tartalmazó mikrotiter lemezen. Az alkalmazott hőmérséklet 37 C, a rázatás 150rpm volt, a ph-t 12%-os NH 4 OH hozzáadásával naponta kétszer állítottuk 5,8-ra a lombikok esetében ph mérő a mikrotiter cellák esetében ph papír segítségével. A mikrotiter lemezek rázógépbe történő helyezéséhez az EnzyScreen SystemDuetz rendszerét használtuk, amely egy leszorító adapterből és az aerob fermentációknál kulcsfontosságú sandwich fedélből áll. Ez utóbbi légszűrőkkel és gázcserenyílásokkal van felszerelve, amelyek a cellák közötti keresztfertőzéseket illetve a levegőből történő fertőzéseket akadályozzák meg, miközben szabad gázcserét biztosítanak [6]. A fermentlevek glükóz és tejsavtartalmát Waters Breeze HPLC-vel mértük BioRad Aminex HPX-87H kolonnán 65 C-on 0,5ml 5mM H 2 SO 4 eluens áram mellett RI detektorral. A rázatott lombikok esetében a biomassza növekedést OD 600 fotometriás méréssel követtük, a mikrotiter lemezek celláiban pedig az átlátszó lemez szkennelésével és a fényképek szürkeségének mérésével határoztuk meg a sejkoncentrációt az alábbi (1.ábra) kalibráció segítségével. Szárazanyag (g/l) y = 0,1568x 1 R² = 0, Szürkeség 1. ábra: Szürkeség-szárazanyag kalibráció A kalibráció elkészítéséhez rázatott lombikban azonos körülmények (tápközeg, ph, hőmérséklet) mellett végzett fermentációból különböző időpillanatban levett minták OD 600 értékét valamint szárazanyagtartalmát (0,2mikronos szűrőn 2ml-t leszűrve) határoztuk meg, majd a mintákat a mikrotiter lemezre pipettázva a szürkeség méréshez szkenneléssel (Epson Stylus SX-600FW) fényképet készítettünk. A kiértékeléshez a Bel MicroImage Analyzer software-t használtuk, amellyel a skálán nyert megállapítást a minta szürkesége (fényvisszaverése, 0-fekete, telejesen üres cella; 256-fehér, teljes fény visszaveréssel) Eredmények és értékelésük A liofilezett törzs felélesztése utáni első rázatott lombikos előkísérletekben 20g/L glükóz mellett 24h alatt jól növekedett a tenyészet és a ph csökkenése is a tejsav termelésre utalt. Ezért az első mikrotiter lemezen végzett kísérletben az iparilag célszerű magasabb, ám esetlegesen szubsztrát vagy termékinhibíciós tartományt kívántuk vizsgálni, ezért a glükóz koncentrációt g/L-re állítottuk, és a hozzátartozó élesztőkivonat (Nforrás) koncentrációt g/l- re állítottuk,

3 ami összesen 16 beállítást jelentett. Emellett egy centrumpontot is terveztünk 75g/L glükóz és 20g/L YE mellett, amelyből 3 párhuzamos fermentációt is indítottunk, illetve ugyanilyen összetétellel 3db be nem oltott centrum pontot is alkalmaztunk a kereszt-, és befertőződések ellenőrzésére. A kiértékelés során létrehoztunk egy maximalizálandó Q paramétert az legkedvezőbb tápközeg beállítás megtalálásához, mivel egyszerre kerestük azon legjobb beállításokat, amelyek a legkevesebb maradék cukor koncentráció mellett a legnagyobb tejsav hozamot eredményezték. A hozam helyett a tejsav végtiter nem lett volna releváns faktor, mivel a különböző induló glükóz koncentrációkkal korrelált volna, és nem lehetett volna őket összehasonlítani. A 2. ábra mutatja a kapott Q=Y LA /Glü maradék értékeket a különböző beállított élesztőkivonat és glükóz koncentrációk függvényeként. magasabb hozamok a 90 és 120g/L-es cukorkoncentrációkból sokkal magasabb termék végtitert jósoltak. A problémát jól demonstrálja a 3. ábra, amelyen a termék inhibíció látszik: az induló glükóz koncentráció növekedésével ~60g/L-ig nő a termékkoncentráció, majd a maradék cukor mennyisége nő meg. Maradék cukor (g/l) LA koncentráció (g/l) 3. ábra: A termékinhibíció felvetődése A termékinhibíció megvizsgálására újabb kísérletet terveztünk mikrotiter lemezen: g/L koncentrációban a beoltás előtt a tápközeghez mértünk Na-,Ca-, és ammóniumlaktátot 2-2 párhuzamos cellával dolgozva, mivel a különböző ipari technológiák során különböző ph szabályozó ágenseket alkalmaznak (NaOH, NH 4 OH, CaCO 3 ). A 90 és 120g/L-es beállítások egyikében sem tapasztaltunk növekedést, azaz teljes volt az inhibíció. A két alacsonyabb koncentrációjú beállítást lehet összehasonlítani a 4. és 5. ábrán. 2. ábra: Tápközeg optimálás A kísérleti beállításokhoz tartozó számított Q értékekre Sigma Plot programmal Gauss felületet illesztettünk (R 2 =0,98), amelyből a maximumhoz tartozó beállításnak a centrum ponthoz közeli 67,5g/L-es glükóz és 27g/L-es YE koncentrációt kaptuk. A kísérlet során szembetűnő volt, hogy egyetlen beállításnál sem sikerült 65g/L tejsavnál többet elérni, noha az alacsony (30g/L) glükózkoncentrációknál tapasztalt 90%-nál is 4. ábra 30g/L-es induló termékkoncentrációk inhibíciójának összehasonlítása

4 Irodalomjegyzék 5. ábra 60g/L-es induló termékkoncentrációk inhibíciójának összehasonlítása A két profil összehasonlításából megállapítható, hogy legerősebben az ammónium-laktát (NH-LA) gátol és esetében a 30 és 60 g/l-es szintek között nincs különbség, tehát már a 30 g/l is radikálisan csökkenti a L. coryniformis növekedését. A nátrium-laktát (Na-LA) inhibíciója kisebb mértékű, és szintén azonos volt a két különböző koncentrációban. A kálcium-laktát (Ca-LA) 30 g/l esetén alig gátol, viszont 60 g/l-nél nagyon erős inhibíciós hatást fejt ki. [1] Lee, C., Fibers and Polymers, The Korean Fiber Society: 2007; 'Vol.' 8, p^pp [2] Hetényi, K., Németh, Áron., Sevella, Béla,. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2010, 85, [3] Hetényi, K., Németh, Áron., Sevella, Béla, Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 2010, 24(2), [4] Tábi, T.; Németh, Á.; Selmeczy, A.; Szalay, F., Biohulladék [5] Hetényi, K.; Németh, Á.; Sevella, B.; Kovács, P.; Bodnár, Zs., P [6] Growth in Microtiter plates: ( ) Összefoglalás Előkísérleteink azt mutatták, hogy a L. coryniformis tejsav fermentációja kis glükóz koncentráció mellett nagy hozammal (>90%) végezhető, ám az iparban megszokott koncentráció-tartományban termékinhibíció miatt nem működik. A kísérleteink alapján kinetikai modellezéssel és esetleg további kísérletek segítségével az inhibíciós konstansok megállapíthatóak lesznek, ám a technológiába való bevonása előtt a Lactobacillus coryniformis törzsfejlesztésre szorul. Köszönetnyilvánítás A munka szakmai tartalma kapcsolódik a "Minőségorientált, összehangolt oktatási és K+F+I stratégia, valamint működési modell kidolgozása a Műegyetemen" c. projekt szakmai célkitűzéseinek megvalósításához. A projekt megvalósítását az ÚMFT TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR programja támogatja.

5 Kérjük, hogy az előadások írott anyagát március 18-ig beküldeni szíveskedjék. A nyomdai munkák miatt kérjük a határidő betartását.