OLDÓSZERMÉRNÖKSÉG ALKALMAZÁSA IZOAMIL-ACETÁT ENZIMATIKUS ELİÁLLÍTÁSÁRA

Átírás

1 PANNON EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI TUDOMÁNYOK ÉS ANYAGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA OLDÓSZERMÉRNÖKSÉG ALKALMAZÁSA IZOAMIL-ACETÁT ENZIMATIKUS ELİÁLLÍTÁSÁRA DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI KÉSZÍTETTE: FEHÉR ERIKA OKLEVELES VEGYÉSZ TÉMAVEZETİ: DR. GUBICZA LÁSZLÓ TUDOMÁNYOS FİMUNKATÁRS PANNON EGYETEM MŐSZAKI KÉMIAI KUTATÓ INTÉZET 2008

2 BEVEZETÉS, CÉLKITŐZÉS Hosszú évtizedeken keresztül az volt a tudományos álláspont, hogy az enzimek csak természetes környezetükben (híg vizes oldatbaban, atmoszférikus nyomáson és közel testhımérsékleten) képesek mőködni. Ma már tudjuk, hogy az enzimek szerves oldószerben is kiválóan funkcionálnak, sıt gyakran még jobban, mint természetes, vizes közegükben. Megfelelıen mőködnek nem poláris közegekben (log P > 2), azonban hidrofil szerves oldószerekben (log P < 2) denaturálódnak, mert az oldószer elvonja az enzim mikrokörnyezetébıl az aktív forma felvételéhez szükséges monomolekuláris rétegnyi vizet. Mindamellett tehát, hogy számos szerves oldószer egészségre ártalmas és tőzveszélyes, az oldhatósági skála széles spektrumát (poláris, protikus oldószerek) nyitva hagyták az enzimkatalízis számára. Éppen ezért az elmúlt évtizedek egyik intenzív kutatási területe volt az olyan reakcióközegek keresése, amelyek betöltik az oldhatósági skálán található őrt és emellett környezetbarátok, a szerves oldószerekhez képest kevésbé veszélyesek, valamint ipari eljárásokban is elınyösen alkalmazhatóak. Ezeknek a kritériumoknak a reakcióközegek több új csoportja felel meg: az ionos- és a szuperkritikus folyadékok, az egyik szubsztrát feleslegében lejátszódó oldószermentes reakciók ill., egy gyorsan fejlıdı, igen ígéretes új terület, a gázfázisú biokonverzió. Az izoamil-acetát fontos aromaanyag, amelybıl évente több tonnát állítanak elı. Természetes aroma-komponensként történı elıállítása során nagy értékő termék keletkezik, amelyre jelentıs kereskedelmi igény mutatkozik. Az irodalom áttekintése után világossá vált, hogy ezen vegyület enzimatikus szintézisét még nem vizsgálták ionos folyadékban. Található adat szerves oldószerben, oldószermentes közegben és szuperkritikus folyadékban történı biokatalízisére, de nincs átfogó vizsgálati elemzés az egyes reakcióközegek összehasonlítására. Ezért doktori munkám céljaként tőztem ki, az izoamil-acetát enzimatikus szintézisének vizsgálatát ionos folyadékban, valamint biokatalízisének többszempontbeli összehasonlítását egyéb környezetbarát, nem-konvencionális reakcióközegekben. A szubsztrátok kiválasztása során meghatározó szempont volt, hogy mindkét anyagnak legyen természetes forrása, így az enzimatikusan elıállított anyag természetes aromának minısüljön. A sikeres biokatalízist követıen a terméket ki is kell nyerni a reakcióelegybıl. A Mőszaki Kémiai Kutató Intézetben nagy tapasztalatra tettek szert különbözı membrános eljárások alkalmazásának terén. Mivel a pervaporáció ismert membrános eljárás azeotróp elegyek megbontására, ezért elsı módszerként ezt a technikát kívántam megvizsgálni a keletkezı azeotróp reakcióelegy feldolgozására. Az ionos folyadékok alig egy évtizede ismert, alig

3 vizsgált felhasználási területe az extraktív desztilláció. Ideális szeparáló tulajdonságokkal rendelkeznek azeotróp elegyek elválasztásához, ezért második, alternatív feldolgozási eljárásként az ionos folyadékkal történı extraktív desztilláció vizsgálatát választottam. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Doktori munkámban az izoamil-acetát elıállítását vizsgáltam enzimatikus úton, különbözı reakcióközegekben. A szubsztrátokként alkalmazott ecetsav és izoamil-alkohol reakcióját a Candida antarctica lipáz B enzim katalizálta az általam végrehajtott kísérletekben. Ez egy egyensúlyra vezetı észterezési folyamat: C H 3 O OH + CH 3 HO CH 3 lipáz O CH 3 + H 2 O H 3 C O CH 3 ecetsav izoamil-alkohol izoamil-acetát víz Ezen aroma-komponens elıállítását vizsgáltam több nem-konvencionális, környezetbarát reakcióközegben: ionos folyadékban, szuperkritikus folyadékban, a kettı kombinációjában és oldószermentes közegben. Vizsgáltam az enzim hımérséklettel szembeni stabilitását, valamint ionos folyadékkal történı együttes visszaforgathatóságát. Ezen túl két konkrét megoldási javaslatot mutattam be az elıállított izoamil-acetát kinyerésére az azeotróp reakcióelegybıl. Az elvégzett kísérleti munka eredményeit, a kapott adatokból levont következtetéseimet az alábbi 6 tézispontban foglaltam össze. TÉZISEK 1. Tézis Megállapítottam, hogy a természetes aromaanyagként alkalmazott izoamil-acetát ecetsavból és izoamil-alkoholból Candida antarctica lipáz B enzim jelenlétében többféle nem konvencionális reakcióközegben elıállítható. A kezdeti reakció-sebességet és a hozamot tekintve meghatározó paraméterekként elınyös reakcióközeg a kétfázisú ([bmim]pf 6 /izoamilalkohol) ionos folyadékos rendszer. Kimutattam, hogy a vizsgált ionos folyadékok nem katalizálták a folyamatot, csupán oldószerként szerepeltek. Ugyanolyan reakció körülmények között oldószermentes közegben közel azonos hozam és kezdeti reakció-sebességet értem el, mint ionos folyadékos rendszerben. Szuperkritikus szén-dioxidban és ionos folyadék/szuperkritikus szén-dioxid kombinált közegekben azonban ennek csak mintegy 20%-át lehetett elérni.

4 A fenti biokatalízisre kétfázisú ionos folyadékos közegre a következıket állapítottam meg: alkalmas ionos folyadékok: [bmim]pf 6, [hmim]pf 6, határ enzim-koncentráció: 50 g/dm 3 reakciólegy, munkahımérséklet (megoszlás figyelembevételével): 50 C, optimális izoamil-alkohol és ecetsav mólarány: 7:1, optimális ionos folyadék mennyiség: 2,66 mol [bmim]pf6 /mol ecetsav, optimális kezdeti víztartalom: 1-2 m/m%. A fenti paraméterekkel végrehajtott rázatott lombikos kísérletekben ~95% hozamot értem el 5 h alatt, ~20 mmol acetát /g enzim h kezdeti reakció-sebesség mellett. 2. Tézis A kétfázisú ([bmim]pf 6 /izoamil-alkohol) rendszer megoszlási vizsgálatai során kimutattam, hogy C hımérséklet-tartományban az ionos folyadékos fázis 1 m/m% izoamil-alkoholt és 30 m/m% ecetsavat tartalmazott a hımérséklettıl csak kismértékben függıen. Ugyanebben a tartományban az izoamil-acetát megoszlása erısen függött a hımérséklettıl és egy maximum görbét vett fel. A megoszlások figyelembevételével az izoamil-acetát kinyerése szempontjából [bmim]pf 6 ionos folyadékos rendszerben az optimális hımérséklet 50 C volt, mert a reakcióelegy elválasztása után a felsı fázis ezen a hımérsékleten tartalmazta a legtöbb terméket (96 m/m%). 3. Tézis Hımérséklet stabilitási vizsgálatok alapján megállapítottam, hogy az alkalmazott immobilizált Candida antarctica lipáz B enzim kétlépéses mechanizmus szerint inaktiválódik oldószermentes és [bmim]pf 6 ionos folyadékos közegekben 60 és 80 C között. A Lumry- Eyring inaktiválódási modellel kapott felezési idıkbıl (t 1/2 ) kiszámítottam, hogy oldószermentes közegben az enzim inaktiválódása négyszer gyorsabban ment végbe, mint [bmim]pf 6 -ban, tehát a termostabilitási faktor (F): t F = t 1/ 2ionosfolyadék 1/ 2oldószermentes Következésképpen, a [bmim]pf 6 stabilizáló hatása nem csak az eddig vizsgált homogén, hanem heterogén rendszerekben is érvényesült. = 4.

5 Ezek alapján megállapítottam, hogy a [bmim]pf 6 ionos folyadékot tartalmazó kétfázisú rendszer enzimstabilitási szempontból nézve alkalmasabb reakcióközeg, mint az oldószermentes rendszer. 4. Tézis Megállapítottam, hogy az izoamil-acetát ecetsavból és izoamil-alkoholból történı biokatalízise során az oldószerként alkalmazott [bmim]pf 6 ionos folyadék és a Novozym 435 enzim legalább tízszer együttesen újrahasznosítható, miközben a hozam és a kezdeti reakciósebesség értéke állandó marad, mert az ionos folyadék stabilizálja az enzimet. A kétfázisú rendszer alkalmazása azzal az elınnyel is járt, hogy az alsó ionos folyadékos fázis és a határfelületén lévı enzim tömegében nem lépett fel veszteség a visszaforgatás során. 5. Tézis Integrált eljárást dolgoztam ki az izoamil-acetát elıállítására és kinyerésére az izoamilalkoholt, ecetsavat, vizet, [bmim]pf 6 -ot és a célterméket tartalmazó kétfázisú reakcióelegybıl. Az eljárásban a biokatalízist zeolitos adszorpcióval és pervaporációval kapcsoltam össze. A bioreakció ~90%-ot hozamot ért el 5 h alatt, amit ~100%-ra növeltem 12 h alatt zeolitos adszorpcióval történı vízeltávolítással. Ezután fázis-szeparációval az izoamilacetát/izoamil-alkohol/víz alkotta azeotróp elegyekhez jutottam (felsı fázis), amelyet pervaporáció alkalmazásával megbontottam. Sulzer Pervap 2256 síkmembránnal 42 h üzemeltetési idı után 96,4% tisztaságú izoamil-acetátot állítottam elı, ami szennyezıként csak vizet tartalmazott. 6. Tézis A reakcióelegy feldolgozásának másik módjaként bebizonyítottam, hogy több olyan ionos folyadék is van, amely extraktív desztillációban szeparáló anyagként alkalmazva alkalmas az izoamil-acetát/izoamil-alkohol/víz azeotróp elegyek megtörésére. Erre a célra elınyösnek bizonyultak a kompaktabb, ionosabb jellegő ionos folyadékok, a másodlagos szerkezetükben H-kötés hálózattal rendelkezıkkel szemben. Elıbb szakaszos, majd folyamatos extraktív desztillációs berendezésben a kiindulási 16 m/m% izoamil-acetátot és 84 m/m% izoamilalkoholt tartalmazó elegyet két lépésben 80 m/m% izoamil-acetátot és 20 m/m% izoamilalkoholt tartalmazó oldattá dúsítottam [ppy]br-dal. Az alkalmazott ionos folyadékot regeneráció után többször újrahasznosítottam.

6 PUBLIKÁCIÓK 1. E. Fehér, B. Major, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza On the background of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids, Biochem. Soc. Trans., 2007, 35, (Impakt faktor: 3,447) 2. E. Fehér, V. Illeova, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, M. Polakovic, L. Gubicza Enzymatic production of isoamyl acetate in an ionic liquid alcohol biphasic system, J. Mol. Catal. B-Enzym., 2008, 50, (Impakt faktor: 1,973) 3. E. Fehér, B. Major, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol - ionic liquid biphasic system, Desalination, 2009, 240, nyomtatás alatt, (Impakt faktor: 0,875) 4. N. Nemestóthy, L. Gubicza, E. Fehér, K. Bélafi-Bakó Biotechnological utilization of a food industrial by-product: fusel oil. A kinetic model on enzymatic esterification of i-amyl-alcohol and oleic acid by Candida antarctica lipase B, Food Technol. Biotechnol., 2008, 46, (Impakt faktor: 0,789) 5. Fehér E., Kelemenné Horváth I., Forgó K., Bélafiné Bakó K., Gubicza L. Új membrántechnikai eljárások alkalmazása izoamil-acetát enzimatikus elıállítására és szeparálására ionos folyadékban, Membrántechnika, 2007, 11, PROCEEDINGEK 1. Fráter T., Fehér E., Kelemenné Horváth I., Bélafiné Bakó K., Gubicza L.: Aromaészterek elıállítása ionos folyadékokban, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 25-27, elıadás, pp E. Fehér, T. Fráter, L. Gubicza, V. Stefuca, V. Illeová, M. Polakovic: Enzymatic Production of Short Chain Alkyl Esters in Ionic Liquids, 33rd International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , elıadás, pp. 209 és proceedings CD-ROM 3. E. Fehér, T. Fráter, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Enzymatic Reactions in Green Solvents: Production of Natural Flavour Esters in Ionic Liquids, 3 rd International Congress on Biocatalysis, Hamburg, Németország, szeptember 3-7., elıadás, pp E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, B. Major, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Continuous Enzymatic Production of Isoamyl Acetate in Ionic Liquid Alcoholic Biphasic System, 7th International conference on Protein Stabilisation, Exeter, Anglia, április , elıadás, pp Fehér E., Forgó K., Kelemenné Horváth I., Gubicza L.: Izoamil-acetát enzimatikus elıállítása ionos folyadékban és szeparálása membrántechnikai eljárásokkal, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 25-27, elıadás, pp

7 6. Major B., Fehér E., Vass A., Gubicza L.: Tejsav enantiszelektív észterezése Candida antarctica lipáz enzimmel ionos folyadék közegben, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 25-27, elıadás, pp E. Fehér, K. Forgó, I. Kelemenné Horváth, K. Bélafiné Bakó, L. Gubicza: Biphasic Enzymatic Production of Isoamyl Acetate in Ionic Liquid and Separation of the Reaction Mixture, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , elıadás, pp. 226 és proceedings CD-ROM 8. B. Major, E. Fehér, A. Vass, K. Bélafiné Bakó, L. Gubicza: Enzymatic Production of Lactates in Ionic Liquids, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , elıadás, pp. 126 és proceedings CD-ROM 9. V. Illeová, E. Fehér, M. Polakovič, Gubicza L.: Thermal Stability of Lipase in Ionic Liquids, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , poszter, pp. 70 és proceedings CD-ROM 10. L. Gubicza, E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, T. Fráter: Enzymatic Flavour Ester Production in Organic Solvents, Solvent-free System and Ionic Liquids, 6 th European Symposium on Biochemical Engineering Science (ESBES), Salzburg, Ausztria, augusztus , poszter, pp L. Gubicza, E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, T. Fráter: Continuous Enzymatic Esterification in an Integrated System Using Ionic Liquids as Solvent, Green Solvents for Processes (DECHEMA), Lake Constance, Friedrichshafen, Németország, október 8-11., poszter, pp L. Gubicza, E. Fehér, K. Bélafi-Bakó, N. Nemestóthy, T. Fráter: Continuous Enzymatic Esterification in an Integrated System Using Ionic Liquids as Solvent, European Bioprospectives, Cologne, Németország, május 30 - június 1., poszter, pp E. Fehér, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Biphasic Enzymatic Esterification of a Natural Flavour in a Continuous System, 8th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations, Oviedo, Spanyolország, július 8-13., poszter, pp E. Fehér, T. Fráter, I. Kelemen-Horváth, B. Major, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Continuous Enzymatic Production of Natural Flavours in One- and Biphasic Systems with Different Membrane Separation Technics, PERMEA, Siófok, 2007 szeptember 2-6, poszter, pp. 225 és proceedings CD-ROM 15. E. Fehér, Z. Findrik, I. Kelemen-Horváth, K. Bélafi-Bakó, L. Gubicza: Application of solvent engineering in the enzymatic production of isoamyl acetate, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 22-24, elıadás, pp

8 16. Vincze R., Fehér E., Kovács S., Gubicza L.: Ionos folyadékokkal segített extraktív desztilláció alkalmazása izoamil-alkohol és izoamil-acetát azeotróp elegy elválasztására, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 22-24, elıadás, pp E. Fehér, V. Illeová, R. Vincze, S. Kovács, L. Gubicza: Enzymatic production of isoamyl acetate. Separation of the reaction mixture by membrane processes and extractive distillation, 35th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , poszter, pp. 80. és proceedings CD-ROM