AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN

Átírás

1 Pannon Egyetem Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori Iskola AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette: Major Brigitta okleveles vegyészmérnök Témavezetı: Dr. Gubicza László egyetemi tanár Pannon Egyetem Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet 2013

2 Bevezetés Napjainkban egyre növekvı igény tapasztalható az egészségre ártalmatlan zöld vegyszerek és oldószerek elıállítására és használatára, zöld technológiák kidolgozására a környezet és a gazdaság kímélése céljából. Ez tulajdonképpen azt jelenti, hogy törekedni kell: az emberre és a környezetre ártalmatlan, megújuló forrásból származó alapanyagok használatára; a felhasználás után biológiai hatásra lebomló, ártalmatlan termékek elıállítására; az energiafelhasználás minimalizálására, az energiakihasználtság növelésére; a hulladéktermelés elkerülésére; a segédanyagok, oldószerek használatának csökkentésére, a minél koncentráltabb, kisebb térfogatú elegyekben, katalizátorral történı szintézisekre; a vegyipari balesetek (robbanások, tüzek) lehetıségének minimalizálására [Pereira 2011]. A tejsav jelentısége abból ered, hogy természetes forrásokból, biológiai úton (fermentációval), a kémiai szintézishez képest kisebb költséggel elıállítható optikailag aktív formában is, és számos környezetre ártalmatlan, ipari jelentıségő termék szintézisében felhasználható [Holten 1971]. Többek között akrilsav, politejsav, pentán-2,3-dion, propilénglikol állítható elı belıle, észterezhetı, elıállítható a kalcium- illetve nátriumsója A politejsavból természetben gyorsan lebomló mőanyag állítható elı. [Datta 2006]. Az észterezés a tejsav kinyerése, tisztítása és környezetbarát, nagy értékő termékek elıállítása szempontjából is fontos reakció. Ha az észterezést az ugyancsak természetes forrásból elıállítható etanollal végezzük, egy a természetben is elıforduló aromaanyagot, etillaktátot kapunk, amelyet az élelmiszeriparon kívül a gyógyszeripar és az elektronikai ipar is felhasznál [Pereira 2011]. Ismeretes, hogy a természetes kiindulási anyagokból, enzimatikus átalakítással nyert aromaanyagok természetes minısítést kapnak, ami tovább növeli az elıállított termék értékét. A szerves oldószerek az enzimes észterezési reakciók nem-konvencionális közegei közül a legrégebb óta kutatottak. Ez az oka, hogy a 2-hidroxi savak szerves oldószerekben történı enzimes észterezése témában már születtek publikációk, bár az általam tervezettıl eltérı körülmények között (hosszabb szénláncú alkoholokat és/vagy karbonsavakat, illetve nem Candida antarctica lipáz B enzimet használtak).

3 A nem-konvencionáis közegek közül a szerves oldószerekhez képest az ionos folyadékok rendelkeznek számos elınyös tulajdonsággal, úgymint pl. az elhanyagolható gıznyomás, vagy a nagy szerkezeti változatosság [Keskin 2007], ezért a bennük lejátszatott enzimes reakciók eredménye gyakran eltér a szerves oldószerben tapasztaltaktól. Az ionos folyadékok viszonylag új és még kevéssé megismert családja a foszfónium kationt tartalmazó vegyületek. Rájuk is igazak az ionos folyadékok kedvezı tulajdonságai, melyek lehetıvé teszik enzimes reakciók lejátszatását bennük, és amik alapján zöld oldószernek tekintjük ıket [Keskin 2007]. Az imidazólium és ammónium típusú ionos folyadékokhoz képest azonban számos további elınyös vonással is rendelkeznek. Ilyen sajátosság pl. a nagyobb kémiai [Martinis 2010] és hıstabilitás [Bradaric 2003], az, hogy feltételezhetıleg kedvezıbb környezetet biztosítanak az enzimek számára [Abe 2008], illetve az a tapasztalat, hogy felhasználhatók a tejsav fermentlébıl való kinyerésére [Marták 2007]. A minimális környezeti terhelést jelentı, a zöld kémiai követelményeknek megfelelı reakciók egyik új megvalósítási módja a mikrohullámú sugárzás használata. Ennek a hıforrásnak a zöld volta abban rejlik, hogy egyenletes és a konvencionális hıközlésnél hatékonyabb hıátadási módszer, ami egyes esetekben megnöveli az enzimek szelektivitását, aktivitását és stabilitását [Carrillo-Munoz 1996], bár a lejátszódó folyamatok mechanizmusa legtöbbször nem ismert. A tejsav felhasználása kapcsán az egyik legnagyobb akadály, amitıl a mai gyártástechnológiák szenvednek, a kis konverzió és a tisztaság, amik a termelést technológiai és ökológiai szempontból versenyképtelenné teszik. Ezért hatékony katalizátorok és elválasztási mőveletek alapvetı fontosságúak a tejsav-észterek versenyképes technológiáinak kifejlesztéséhez. Erre nyújthat lehetıséget a tejsav foszfónium típusú ionos folyadékban történı enzimes észterezése, ha a tejsav kinyerését és az észterképzést sikerül ugyanazzal az ionos folyadékkal megvalósítani. A legkedvezıbb technológia kidolgozásához az észterezési reakció jobb megértése is fontos tényezı, mivel a tejsav hajlamos a felhasználás körülményei között dimereket képezni, illetve ezekbıl visszaalakulni. Ez a mellékreakció a limitáló lépés mind a tejsav tisztításánál, mind az észterek elıállításánál [Engin 2003].

4 Célkitőzések és kísérleti módszerek Kutatómunkámnak kettıs célja volt: Az egyik, az etil-laktát enzimatikus elıállításának vizsgálata. Ehhez a kísérleteket etanol és tejsav szubsztrátok alkalmazása mellett, immobilizált Candida antarctica lipáz katalizátorral, két szerves oldószer és 12 ionos folyadék közegben hajtottam végre. Toluolban és Cyphos 104-ben vizsgáltam az egyes paramétereknek a reakcióra gyakorolt hatását, az enzim visszaforgathatóságát és meghatároztam az észterezés legalkalmasabb paramétereit. Kísérleteket végeztem konvencionális hıközlés és mikrohullámú hıközlés alkalmazása mellett is vizsgálva a két különbözı hıforrás reakcióra gyakorolt hatását. A másik célom a tejsav egyedi viselkedésének (dimerizációra és a dimerekbıl történı hidrolízisre való hajlamának) vizsgálata volt víztartalom szabályozása nélkül mikrohullámú, illetve konvencionális hıközlés mellett és pervaporációval illetve zeolitos adszorpcióval kombinált mőveletekben. Új tudományos eredmények A PhD kutatómunkám során elért új tudományos eredményeket az alábbi 5 tézispontban foglaltam össze: 1. Tézis: Megállapítottam, hogy az aromaként, gyógyszer- és élelmiszeripari adalékként egyaránt felhasználásra kerülı természetes etil-laktát (L)-tejsavból és természetes etanolból Candida antarctica lipáz B enzim jelenlétében többféle nem-konvencionális reakcióközegben elıállítható. A szerves oldószerek közül a toluol bizonyult a legalkalmasabb reakcióközegnek. Megállapítottam, hogy a vizsgált összesen 12 ionos folyadék közül több foszfónium típusú, a tejsav oldására is alkalmas. Egyes foszfónium típusú ionos folyadékok, mint pl.: Cyphos 163, Cyphos 166, Cyphos 106, Cyphos 102 maguk is katalizálják az észterezést, vagyis szerepük a reakcióban kettıs: oldószer és egyúttal katalizátor. A Cyphos 104 és a Cyphos 202 ionos folyadékok megfelelı közegei a reakciónak, mivel csak oldószerként viselkednek, a reakciót csak az enzim katalizálja. Kísérleteim alapján megállapítottam, hogy konvencionális hıközlés mellett közel azonos hozam érhetı el Cyphos 104 és toluol közegben, ugyanakkor az ionos

5 folyadék több szempontból (pl. nagyobb alkalmazható savkoncentráció, kisebb mennyiségő enzim, a lipáz jobb újrafelhasználhatósága) kedvezıbb közegnek bizonyult, mint a szerves oldószer. A kétféle oldószerrel végzett kísérletek paramétereit és eredményeit táblázatban foglaltam össze (1). Az etil-laktát elıállítás legmegfelelıbb paraméterei és eredményei toluolban és Cyphos 104-ionos folyadékban. Reakcióközeg Toluol Cyphos 104 Savkoncentráció (a legkedvezıbb reakciótérfogat alapján) 0,2-0,5 mmol/ ml 0,8-1 mmol/ml Alkohol : sav mólarány 5 : 1 7 : 1 Kiindulási víztartalom 4,5 tömeg % 2,0 tömeg % Reakcióidı 8 óra 24 óra Enzimmennyiség 250 mg/ mmol tejsav 12,5 mg/mmol tejsav Elért maximális hozam 94 % 95 % Reakcióhımérséklet 40 C 40 C Visszaforgathatóság Gyenge Megnövekedett 2. Tézis: Kísérleteim bizonyították, hogy a Cyphos ionos folyadék család több tagja többes funkciót képes ellátni a tejsav elıállítás és feldolgozás során. Nemcsak alkalmasak az irodalom szerint ismert módon a tejsav extrakciójára a fermentlébıl, de kinyerés nélkül felhasználhatók a további enzimkatalitikus észterezési reakció közegeként. Ezzel lehetıség nyílik egy olyan kombinált természetes etil-laktát elıállítási eljárás kidolgozására, ahol kiküszöbölhetı egy költséges kinyerési lépés. (1) 3. Tézis: Bebizonyítottam, hogy a mikrohullámú hıközlés pozitív hatással van az etil-laktát szintézisére 4 ionos folyadék közeg esetén, melyek közül Cyphos 202-ben csak enzimkatalizált folyamat megy végbe. A tapasztalt pozitív hatás magasabb hozamban és 2-3- szor rövidebb reakcióidıben nyilvánul meg a konvencionális hıközlés mellett tapasztaltakhoz képest. Cyphos 202 ionos folyadék esetében a konvencionális hıközlésnél szükséges 24 órás reakcióidı 8 órára csökken, miközben növekszik az elért etil-laktát hozam. (2)

6 Mikrohullámú sugárzás hatása az észterezési reakcióra különbözı ionos folyadékok esetén. IL neve Konvencionális hıközlés Mikrohullámú hıközlés hozam / reakcióidı hozam / reakcióidı Cyphos % / 24 óra 106 % / 8 óra Cyphos % / 8 óra 104 % / 4 óra Cyphos % / 24 óra 93 % / 7 óra Cyphos % / 24 óra 65 % / 7 óra Cyphos 104 Nincs hatás Cyphos 110 Nincs hatás Cyphos 106 Nincs hatás 4. Tézis Cyphos 202 ionos folyadék esetén a mikrohullámú hıközlés egy újabb, eddig nem ismert elınyös hatását is igazolták mérési eredményeim. A reakcióelegyben jelen levı víz és észter mennyiségekre fölállított anyagmérleg alapján a reakcióban keletkezı észter mennyisége nagyobb, mint a keletkezı vízé. Eszerint a mikrohullámú sugárzás a reakcióelegyben lévı tejsav dimereinek hidrolízisét meggyorsítja, és ezáltal megnı a szabad (az enzim számára hozzáférhetı) tejsav mennyisége. Mivel a hıközlésen kívül minden egyéb körülmény azonos a két reakcióban, a fönt leírt jelenség a mikrohullámú sugárzás (nem-hı) hatásának tulajdonítható. A hidrolízis sebességének megnövekedése lehetıvé teszi a dimerekben kötött tejsav szubsztrátként történı felhasználását és a szabad tejsavra számolt hozam akár 100 % fölé történı emelkedését. (2) 5. Tézis Vízelvonás, így az általam alkalmazott pervaporáció, illetve zeolitos adszorpció hatására laktilsav keletkezik a reakcióelegyben, ami növeli a reakcióelegy víztartalmát, és közben csökkenti az elérhetı észter hozamot azáltal, hogy a fogyasztja a rendelkezésre álló szabad tejsavat. Így, ellentétben például az etil-acetát, vagy izoamil-acetát szintézisével (ahol nem játszódnak le dimerizációs folyamatok), amikor a vízelvonás jelentıs hozamnövekedéssel járt együtt, ebben az esetben a víztartalom szabályozása (a keletkezı víz elvonása) a hozam csökkenését eredményezi. (3)

7 Publikációs lista Publikációk: 1. Major B., Nemestóthy N., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic esterification of lactic acid under microwave conditions in ionic liquids, Hungarian J. Ind. Chem., 36 (1-2) (2008) 2. Major B., Kelemen-Horváth I., Csanádi Zs., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid and ethanol in phosphonium type ionic liquids as co-solvents, Green Chem. 11 (5) (2009) (IF: 5,836, hivatkozás: 7) 3. Major B., Németh G., Bélafi-Bakó K., and Gubicza L.: Unique role of water content in enzymatic synthesis of ethyl lactate using ionic liquid as solvent, Chem. Pap., 64 (2) (2010) (IF: 0,754, hivatkozás: 2) A témához kapcsolódó egyéb publikációk 4. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K. and Gubicza L.: On the background of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids, Biochem. Soc. Trans., 35, (2007) (IF: 3,447, hivatkozás: 37) 5. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K.and Gubicza L.: Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol - ionic liquid biphasic system, Desalination, (2009), (IF: 2,034, hivatkozás: 6) Proceedingek, elıadások, poszterek: 1. Major B., Fehér E., Vass A., Gubicza L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Candida antarctica lipáz enzimmel ionos folyadék közegben, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 25-27, elıadás pp Major B., Vrsalović Presečki A., Kelemenné Horváth I., Vass A., Gubicza L.: A mikrohullámú hıközlés hatása tejsav enzimes észterezésére ionos folyadékban, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 22-24, elıadás pp Major B., Kelemenné Horváth I., Bélafiné Bakó K., Gubicza L.: A víztartalom szerepe a tejsav enzimkatalitikus észterezése során, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 21-23, elıadás pp

8 4. Dobaj A.; Bányai T.; Major B.; Gubicza L.: Tejsav észterek elıállítása ionos folyadékban végzett enzimkatalitikus észterezéssel, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 21-23, elıadás pp Hunorfi A., Kelemenné Horváth I., Major B., Gubicza L.: Ionos folyadékok alkalmazása észterezési reakciókban oldószerként és katalizátorként, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 21-23, elıadás pp Major B., Fehér E., Vass A., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic production of lactates in ionic liquids, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, május , elıadás, pp. 126 és proceedings CD-ROM 7. Major B., Bányai T., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: The effect of water content on the enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid as co-solvent, 36 th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Szlovákia, május elıadás p. 56 és proceedings CD-ROM 8. Major B., Marták J., Gubicza L., Bélafiné Bakó K., Schlosser S.: Tejsav kinyerése és észterezése ionos folyadékok segítségével, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, április 22-24, poszter, pp Major B., Nemestóthy N., Kelemen-Horváth I., Gubicza L.: Ethyl Lactate Production in Non-Conventional Media under Normal and Microwave Conditions, EUCHEM 2008 Conference on Molten Salts and Ionic Liquids, Koppenhága, Dánia, augusztus 24-29, poszter p Major B., Kelemen-Horváth I., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic Production of Ethyl Lactate in Non-Conventional Solvents under Normal and Microwave Heating, 4 th International Congress on Biocatalysis 2008, Hamburg, Németország, augusztus 31 szeptember 4, poszter p Gubicza L., Bélafi-Bakó K., Bányai T, Major B.: Effect of Ionic Liquids on the Stability and Reusability of Immobilized Candida antarctica lipase B, 8th International Conference on Protein Stabilisation, Graz, Ausztria, április , poszter p. 61