Aszimmetrikus tejsav észterezés ionos folyadékban Asymmetric lactic acid esterification in ionic liquid Németh Gergely 1, Bélafiné Bakó Katalin 1, Maja Habulin 2, Nemestóthy Nándor 1, Gubicza László 1 1 Pannon Egyetem, Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet 8200 Veszprém, Egyetem utca 10. 2 University of Maribor, Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, Smetanova ulica 17, 2000 Maribor, Slovenia Summary Biodegradability and environmentally friendly technologies recently came into prominence, this is why our institute deals with this area. Racemic lactic acid (L.A.) mixture produced by chemical industry is hard to handle. The product after esterification with low carbon chain alcohols has increased volatility than L.A. itself therefore it can more effectively be separated. The reactions carried out with bio-catalysers (enzymes) some of them prefer reactions with L(-)-conformations results enantioselective esterification. After L(-)-lactic-acid ester production the hydrolysis leads to separated L(-)-lactic acid, which is the starting material of biodegradable plastics. Esterification of lactic acid is an equilibrium reaction, therefore the maximal yield can be influenced using an excess of one of the substrates (usually the alcohol) or removing the product ester or the side-product water. Water content plays an important role during the reaction. In one hand the enzyme needs a monomolecular water layer, in the other hand the lactic acid undergoes selfesterification when there is no enough water present in the reaction mixture. Ionic liquids (IL) are widely applied in chemistry from the early 80 s play main role in several chemical processes e.g. in coating, energetics, chemical engineering, biochemistry. ILs are molten salts at ambient temperature with a melting point below 100 C. They usually consisting of a large organic cation and a smaller inorganic or organic anion. Compared with conventional organic solvents they have insignificant vapour pressure, they are non-flammable and re-usable after a purification process, furthermore can be tailor made for a certain application. For these reasons they became important solvents in green chemistry. It is not negligible that the structure affects the environmentally features like biodegradability or toxicity. Our aim is to advance enantioselectivity in phosphonium-type (Cyphos) ionic liquid solvent by the optimization of several parameters, like temperature, substrate molar ratio, amount of IL, water content. Experiments were performed with ethanol and lactic acid in an amount of 430 mmol and varied amount of L.A, respectively. Reasonable results were measured with three types (Candida antarctica, Candida rugosa, AMANO PS-IM) of lipases. Bevezetés A poli-l-tejsav (PLLA) egy kristályos szerkezetű polimer, melynek mostanában nagy figyelmet szentelnek. A polilaktidok és származékai hőre lágyuló, biológiailag lebontható és biokompatibilis polimerek, melyek tulajdonságai a polisztirolhoz (PS) vagy polietilén-tereftaláthoz (PET) hasonlóak. Petrolkémiai alapanyag helyett biomasszából nyerik, épp ezért vizsgálják őket széles körben az elmúlt 20 évben. [1] A PLLA kristályossága a polimerben található L-laktát egységek optikai tisztaságától függ. Minél nagyobb az L-laktát egységek optikai tisztasága, annál magasabb a kristályossága, ezért a tiszta PLLA előállításához a kezdeti nyersanyag, az L- tejsav (LLA) magas optikai tisztasága szükséges. Az optikailag tiszta LLA egy speciális mikroorganizmussal vagy racém tejsav rezolválásával állítható elő. [2] Zajlottak arra is kísérletek, hogy nyersanyagként ételmaradékokat használtak fel a tejsav fermentációhoz. Ennek hátulütője, hogy a hulladékban élő vad típusú tejsav baktérium D- tejsavat (DLA) állít elő, tehát a hulladékból termelt LLA DLA-val szennyezett lesz. [3] A PLLA előállítását meg lehet valósítani ciklikus dimer tejsavból gyűrűfelnyitásos polimerizációval, mely anyag egy kereskedelemben kapható vegyület. A különböző molekulatömegű PLLA polimerizációját megvalósíthatják szennyező szervetlen katalizátorokkal, de az előnyös tulajdonságaik miatt használatos biokatalizátorokkal is, melyek enyhébb
körülmények között funkcionálnak fém- vagy toxikus szerves szennyezések nélkül. [1] Jól ismert, hogy néhány enzim enantioszelektíven katalizálja a reakciókat. Ma már a kereskedelemben kedvező áron beszerezhetők ilyen immobilizált enzimek, melyek használata lehetővé teszi, hogy újra felhasználjuk őket, ezzel egyszerűbb folyamatot és alacsonyabb előállítási költségeket eredményeznek. Születtek tanulmányok optikailag aktív anyagok szeparációjára enzimek segítségével. A tejsav optikai elválasztásával ez idáig egy cikk foglalkozott, melyben lipáz segítségével szelektíven katalizálták a butil-d-laktát oligomerizációját, ezzel tisztítva a butil-l-laktátot. [2] Vizsgálataink során célunk az volt, hogy a tejsav enantioszeparációját enantioszelektív észterezéssel valósítsuk meg ionos folyadékos közegben. Az első ionos folyadékot 1914-ben állították elő, mely az [EtNH 3 ]NO 3 volt. [5] Az ionos folyadékok, melyek teljes mértékben ionokból épülnek fel szobahőmérsékleten vagy jóval alatta is folyadék halmazállapotúak. Leginkább a toxikus, gyúlékony és erősen illékony szerves oldószerek kiváltására használják. Valóban a sok egyedi és előnyös fizikai-kémiai tulajdonságuk, mint az elhanyagolható illékonyság, sokrétű oldódási kölcsönhatás szerves és szervetlen anyagokkal, kiváló hő- és kémiai stabilitás, nagy ionvezető képesség teszik őket figyelemfelkeltővé. Tulajdonságaik, mint viszkozitás, hidrofóbicitás, sűrűség és oldhatóság, környezeti veszélyességük a kationok és anionok kombinációjának és a csatolt szubsztituensek megválasztásával befolyásolhatók. Ezért nevezik őket méretre szabható oldószereknek. Ezen tulajdonságok kombinálásával nyílik meg az út a széleskörű felhasználhatóság felé, mint az extrakció, a szerves szintézis és katalízis, szeparáció vagy az enzimes reakciók oldószere. [4] Habár a poláris szerves oldószerek inaktiválják az enzimeket, meglepő módon az ionos folyadékok nem. Ez a tulajdonság kiterjeszti az enzimkatalizált reakciók oldószer polaritási mezőjét, mely eddig elérhetetlen volt. Nagyobb polaritású oldószerek használata megnöveli a poláris szubsztrátok oldhatóságát, mely gyorsabb reakciókat és változott szelektivitást eredményez. [4] A hidrolázok és az oxidoreduktázok is megtartották aktivitásukat, mikor ionos folyadékban szuszpendálták őket. Korábbi és későbbi írások összefoglalják, hogy azok az enzimek, melyek működnek szerves oldószerekben, azok ugyanúgy aktívak ionos folyadékokban is. Számos esetben a lipázok és proteázok nagyobb enantioszelektivitást mutattak ionos folyadékban, mint szerves oldószerben. [4] Ezen pozitív tulajdonságok vezéreltek minket, hogy ionos folyadékos reakcióközeget válasszunk a tejsav észterezéséhez. A tejsav a legkisebb aszimmetrikus szénatomot tartalmazó hidroxikarbonsav, mely hidroxil és karboxil csoportot is tartalmaz. Ez teszi lehetővé a különböző reakciókban való részvételét, így a vegyiparban is számos komponens kiinduló anyaga. A tejsavnak különösen értékes származékai az észterek, melyeket kis szénatomszámú alkoholokkal szintetizálva környezetbarát oldószereket kapunk, a tejsav-etilésztert pedig az élelmiszeripar is nagy mennyiségben használja aromaanyagként. Hasznossága ellenére a tejsav felhasználása korlátozott, mivel nehezen nyerhető ki a kis illékonysága miatt. Elválasztásához adszorpció, elektrodialízis, extrakció és észterezés használható. [7-10] Az elmúlt években számos vizsgálat történt az L-tejsav észterezésére. A tejsavat a reakciókhoz tisztán, lényegében vízmentesen kell alkalmazni, hogy az észterezési reakció egyensúlyát ne tolja el a nem kívánt irányba. A tömény tejsav viszont önmagával is képez észtert dimer vagy oligomer formájában, ha kicsi a víztartalma. Egyrészt ezért szükséges a reakciók során a víztartalom követése, másrészt, hogy az enzim elérje a kívánt aktivitását. [11] Mivel a tejsav királis vegyület, ezért az észterezése során is két azonos összetételű, de különböző formációjú, racém vegyület képződik a vegyipari előállítás során. Az észterezéskor képződött termékben az izomerek aránya erősen függ az enzim működésétől. Ezek
enantioszelektivitását befolyásolják a szubsztrátok, és a reakciókörülmények (vízaktivitás, hőmérséklet, ph, oldószer, adalékok, stb.) Számos kísérletben kis mennyiségű társ-oldószert alkalmazva az enzim működése javult, aktivitása, stabilitása és az enantiomer felesleg értéke (1. egyenlet) nagymértékben növekedett. [12] A víztartalom nemcsak az enzim működése szempontjából fontos, hanem a tejsav és a reakció szempontjából is. Ezen hatások optimalizálásához kb. 3-5 m/m% kezdeti víztartalmat alkalmaztak. Mivel a tejsav észterezése egyensúlyra vezető folyamat, az elérhető maximális hozam befolyásolható valamelyik szubsztrát (általában alkohol) feleslegben való alkalmazásával, vagy termék elvételével. Nagy enzimdezaktiváló hatásuk miatt savakat ritkán használnak feleslegben. 1. egyenlet: Az enantiomer felesleg képlete: [6] ee: enantiomer felesleg értéke R és S a megfelelő enantiomerek mennyisége vagy hányada a keverékben Anyagok és módszerek Enzim: Novozym 435 (immobilizált Candida antarctica lipáz B, triacilglicerol hidroláz, E. C. 3.1.1.3.) Novo Nordisk (Basvaerd, Dánia). (1U=11900 μmol propil-laurát/g, 15 min, 1 atm, víztartalom: 1-2%). Lipase from Candida rugosa (liofilizált, E. C. 3.1.1.3.), Sigma-Aldrich (Buchs, Svájc), 700 u/mg, Amano lipase PS-IM (diatóma földön immobilizált), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) Ionos folyadék: trihexil-tetradecil-foszfóniumbis (2,4,4-trimetil-pentil)-foszfinát (Cyphos 104), Sigma-Aldrich, Németország tributil-tetradecilfoszfóniumdodecilbenzolszulfonát (Cyphos 201), IoLiTec GmbH, Németország Egyéb felhasznált vegyszerek: (DL)-tejsav 90 %-os (Reanal, Magyarország), etanol abszolút (Spektrum 3D, Magyarország), hexán, (Scharlau, Spanyolország) Rázatás, inkubálás: IKA KS 4000i rázó inkubátorral. A reakcióelegyeket 150 min -1 rázatási sebességgel reagáltattuk 24 órán át. Elemzések: Az enantioszelektivitás vizsgálatát HP 5890 típusú gázkromatográffal végeztük. A GC FID detektorral rendelkezik. A mérésekhez használt kolonna LIPODEX-E 30 m x 0,25 mm. A fejnyomás 90 kpa, a hőmérséklet 90 C-os állandó értéken tartva. Injektor 150 C, detektor 250 C. Az injektorbetétbe üvegszál illetve nagy felületű megkötő anyagot helyeztünk, hogy az esetleges ionos folyadékot megkösse. Mintaelőkészítés: 0,1 cm 3 mintát 350 µl hexánnal extraháltunk, hogy ionos folyadékot és enzimet ne injektáljunk a kolonnára. Eredmények és értékelésük A közeg kiválasztása A reakcióknak olyan közeget kerestünk, mely nem csökkenti az enzimek katalitikus hatását. Ezért az enzimes méréseket megelőzően a kiválasztott ionos folyadékok katalitikus hatását mértük anélkül, hogy enzimet használtunk volna. Régebbi mérési adatok szerint [11] a Cyphos 201 és a Cyphos 104 közegében értek el számottevő észterhozamokat enzim használatával, ezért ezeket vizsgáltuk tovább. A mérési elegyekbe 43 mmol etanolt és 6 mmol monomer tejsavat mértünk, az ionos folyadékból pedig 1 cm 3 -nyit. Az 1. ábrán láthatóak a katalizátor hatások eredményei. 1. ábra: Az ionos folyadékok katalitikus hatása
Megfigyelhető, hogy Cyphos 201-gyel számottevő konverzió érhető el enzim használata nélkül. Ennek értéke megközelítette a 100%-ot 24 óra reakcióidő után. Cyphos 104-gyel és ionos folyadék nélkül mintegy 10% körüli konverziót értünk el, az autokatalízishez képest kissé vissza is fogja a 104-es ionos folyadék a reakciót. Ezekre a mérésekre alapoztuk, hogy az enzimek hatását nem nyomja el a Cyphos 104, ezért ez lett a későbbi reakciók oldószere. A további kísérletek célja az volt, hogy meghatározzuk a legjobb paraméterkombinációt a legnagyobb enantioszelektivitáshoz az egyes enzimek esetében. 3. ábra: A mólarány és a hőmérséklet hatása Az enzimek enantioszelektivitásának vizsgálata Elsőként meghatároztunk két szélső vizsgálandó értéket a tejsav : etanol mólarányhoz, az ionos folyadék mennyiségéhez és ezek középponti értékét. Ezek alapján kaptunk öt mérési pontot. Majd a hőmérséklethez és az elegy kezdeti víztartalmához is meghatároztuk a pontokat. Az így kapott mérési pontokat rendeltük hozzá a három enzimhez. A Candida antarcticával kapott eredményeket a 2-4. ábra mutatja. Az ábrákról leolvasható, hogy a legnagyobb enantiomer felesleg értékeket akkor értük el, ha az alkohol felesleg nagyobb, az ionos folyadék mennyisége magasabb, a víztartalom kisebb, és a hőmérséklet is alacsonyabb. A legnagyobb érték 35% körüli érték. A kisebb víztartalom érthető is, mivel több víz visszafogja az észterezési reakciót. 4. ábra: A mólarány és az ionos folyadék Candida rugosá-val végzett mérések eredményei az 5-7. ábrán láthatók. Ebben az esetben ugyanazok az értékek kedveztek a szelektivitásnak, mint az előző esetben, kivételt képez a mólarány, mivel itt az alacsonyabb etanol feleslegnél figyeltünk meg magasabb értékeket. 2. ábra: A mólarány és az ionos folyadék 5. ábra: A mólarány és az ionos folyadék
Irodalomjegyzék 6. ábra: A mólarány és a kezdeti víztartalom hatása 7. ábra: A mólarány és a kezdeti víztartalom hatása Összefoglaló Három fajta enzimmel valósítottuk meg a tejsav etanollal történő enantioszelektív észterezésének vizsgálatait ionos folyadékos közegben. A három enzim közül a Novozym 435 mutatta bizonyos körülmények között a legnagyobb enantiomer felesleg értéket. Ezektől az értékektől kissé elmaradt a Candida rugosa katalizálta reakciósor, az Amano PS-IM-mel végzet kísérletek esetében pedig nem figyeltünk meg enantioszelektivitást. A feltűntetett szelektív értékek az első óra utáni időpontra vonatkoznak. Ahol nagy enantiomer felesleg értéket figyeltünk meg, ott az idő múlásával ezek kiegyenlítődtek a reakció előrehaladásával. [1] Chanfreau, S. et al, Bioprocess Biosyst Eng (2010) 33:629 638 [2] Hitomi, O. et al, Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 111 No. 1, 19 21 (2011) [3] Sakai, K. et al, J. Ind. Ecology, 7, 63 74 (2004). [4] Moniruzzaman, M. et al, Biochemical Engineering Journal 48 (2010) 295 314 [5] Seongsoon, P et al, Biotechnology 2003, 14:432 437 [6] Zhang, D. et al, Food Chemistry 109 (2008) 72 80 [7] Datta, R. et al, J Chem Technol Biot, 81, 1119-1129 (2006) [8] Lipinsky, E. S. et al, Chem Eng Process, 82, 26-32 (1986) [9] Joglekar, H. G. et al, Sep Purif Technol, 52, 1-17 (2006) [10] Sun, X. et al, Sep Purif Technol, 49, 43-48 (2006) [11] Major, B. et al, Chem Pap 64 (2) 261 264 (2010) [12] Gotor, V. et al, Asymetric Organic Synthesis with Enzymes, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim (2008) Köszönetnyilvánítás A kutatómunkát a TÁMOP-4.2.2-08/1/2008-0018 azonosító számú Élhetőbb környezet, egészségesebb ember Bioinnováció és zöld technológiák kutatása a Pannon Egyetemen című pályázat Az ionos folyadékok, mint zöld oldószerek alkalmazása biokatalitikus átalakításokban és szeparációkban című alprojekt és az SI-13/2009 számú szlovén-magyar TéT pályázat támogatásával végeztük.