Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 7.7-1 04/2013:0870 VACCINUM PSEUDOPESTIS AVIARIAE INACTIVATUM Baromfipestis (Newcastle betegség) vakcina (inaktivált) 1. DEFINÍCIÓ Az inaktivált baromfipestis vakcina (néhány állatfaj számára készült vakcinák esetében inaktivált 1-es szerotípusú paramyxovírus vakcina néven is ismert) a baromfipestis vírus (1-es szerotípusú paramyxovírus) megfelelő törzsének emulzióját vagy szuszpenzióját tartalmazza, melyet oly módon inaktiváltak, hogy immunizáló képességét megőrizze. Jelen cikkely előírásai a madarak baromfipestis elleni aktív immunizálására szánt vakcinákra vonatkoznak. 2. ELŐÁLLÍTÁS 2-1. A VAKCINA KÉSZÍTÉSE A vírust előkeltetett tyúktojásokban vagy sejttenyészetekben szaporítják. A learatott vírust inaktiválják. A vakcinához adjuváns adható. 2-2. A VÍRUSSZAPORÍTÁSHOZ HASZNÁLT SZUBSZTRÁTUM 2-2-1. Előkeltetett tyúktojás. A vakcinavírus szaporításához használt előkeltetett tyúktojásoknak egészséges állományból kell származniuk. 2-2-2. Sejttenyészetek. A vakcinavírus szaporításához használt sejttenyészeteknek meg kell felelniük az állatgyógyászati vakcinák előállításához használt sejttenyészetekre vonatkozó követelményeknek (5.2.4). 2-3. OLTÓCSÍRA-TÉTELEK 2-3-1. Idegen kórokozók. Az oltócsíra-törzstétel feleljen meg az oltócsíra-tételekben előforduló idegen kórokozókra (2.6.24) vonatkozó vizsgálatok követelményeinek. Ezeknél az oltócsíratörzstételeken elvégzett vizsgálatoknál a vizsgálatok megkezdésekor használt organizmusok passzázsszáma az oltócsíra-törzstételtől számítva legfeljebb öt lehet. 2-4. A VAKCINA ÖSSZETÉTELÉNEK KIVÁLASZTÁSA A vakcina feleljen meg az ártalmatlanságra (5.2.6) és a hatékonyságra (5.2.7) vonatkozó követelményeknek azon madárfajok és kategóriák (korcsoport és tenyésztési irány) esetében, amelyek kezelésére a vakcinát szánták. Az ártalmatlanság és a hatékonyság bizonyítása során az ártalmatlanságra (2-4-1. pont), és immunizáló képességre (2-4-2. pont) vonatkozó alábbi vizsgálatok is alkalmazhatók. 2-4-1. Ártalmatlanság. A vizsgálatot minden egyes ajánlott oltási módon el kell végezni, és minden olyan madárfaj esetében amelyre a vakcinát szánták. A vakcina olyan gyártási tételét használjuk, amely legalább a gyártási tételben várható legnagyobb hatóértéket tartalmazza. Minden egyes, három hétnél nem idősebb madarakon végzett vizsgálathoz, legalább tíz, az oltásra ajánlott legfiatalabb korúnál nem idősebb madarat használunk fel. Minden egyes, három hétnél idősebb madarakon végzett vizsgálathoz, legalább nyolc, az oltásra ajánlott legfiatalabb korúnál nem idősebb madarat használunk fel. Csirkék esetében meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból származó csirkéket (5.2.2) használunk fel és amennyiben a vakcinát más madárfajon
Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 7.7-2 használjuk fel, a korábbiakban nem oltott, baromfipestis (Newcastle betegség) vírus ellenanyagtól mentes madarakat használunk fel. Minden egyes madarat, az ajánlott alkalmazási módon és formában, a vakcina 1 adagjával oltjuk. Az oltás után a madarakat legalább 14 napon át, legalább napi rendszerességgel megfigyelés alatt tartjuk. A vizsgálat nem értékelhető, ha a három hétnél fiatalabb madárfajok több mint 10 %-a abnormális betegség tünetek mutat vagy hullik el a vakcinának tulajdonítható okból. A három hétnél idősebb madárfajok esetében a vizsgálat nem értékelhető, ha nem specifikus elhullás előfordul. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha egyetlen madár sem mutat abnormális betegség tüneteket vagy hullik el a vakcinának tulajdonítható okból. 2-4-2. Immunizáló képesség. A vizsgálatot minden egyes ajánlott alkalmazási módon és formába el kell végezni; az egyes madaraknak beadott vakcina adag ne tartalmazzon többet a megadott legkisebb hatóértéknél. Csirkék esetében a csirkéken való alkalmazásra szánt vakcinákra előírt vizsgálat (2-4-1-1. pont) alkalmas az immunizáló képesség bizonyítására. Más madárfajok esetében (például galambok vagy pulykák) az egyéb állatfajokon (nem csirkéken) való alkalmazásra szánt vakcinákra előírt vizsgálat (2-4-1-2. pont) alkalmas az immunizáló képesség bizonyítására. 2-4-2-1. Csirkéken való alkalmazásra szánt vakcinák. A vizsgálathoz legalább 70, 21 28 napos, azonos eredetű, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból származó (5.2.2) csirkéket használunk. Az oltáshoz legalább három, egyenként legalább húsz csirkéből álló csoportot használunk. A csoportok számának megfelelően különböző vakcina térfogatokat választunk, például 1/25, 1/50 és 1/100 adag vakcinának megfelelő térfogatokat. Mindegyik csoporthoz más térfogatot rendelünk hozzá. Minden egyes csirkét a csoportjához rendelt mennyiségű vakcinával intramuszkulárisan oltunk. Egy tíz csirkéből álló csoportot kontrollnak hagyunk. 17 21 nappal később mindegyik csirkét a madár paramyxovírus Herts féle (Weybridge 33/56) törzsének 6 log 10 embrió LD 50 -et tartalmazó adagjával intramuszkulárisan felülfertőzünk. A csirkéket 21 napon át, legalább napi gyakorisággal megfigyeljük. A megfigyelési időszak végén a szokásos statisztikai módszerekkel kiszámítjuk a PD 50 értéket az egyes csoportokban a 21 napos megfigyelési időt a baromfipestisre jellemző klinikai tünetek nélkül túlélő csirkék száma alapján. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha ha az összes kontroll madár a felülfertőzést követő 6 napban elhullik. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha a feliraton feltüntetett legkisebb vakcinaadag legalább 50 PD 50 -nek felel meg és a konfidenciaintervallum alsó határa legalább 35 PD 50 adagonként. Ha a konfidenciaintervallum alsó határa kisebb, mint 35 PD 50 adagonként, a vizsgálatot meg kell ismételni; a megismételt vizsgálat alapján a vakcina nem tartalmazhat 50 PD 50 -nél kevesebbet. 2-4-2-2. Egyéb állatfajokon (nem csirkéken) való alkalmazásra szánt vakcinák. Az adott célállatfajból legalább 30, azonos eredetű, azonos korú, a madár paramyxovírus 1 elleni ellenanyagtól mentes madarat használunk a vizsgálathoz. Legalább húsz madarat az ajánlott módon oltunk. Legalább tíz madarat oltatlan kontrollnak hagyunk. Négy héttel az utolsó oltás után minden egyes madarat virulens paramyxovírus 1-es szerotípus elegendő mennyiségével intramuszkulárisan felülfertőzünk. A vizsgálat nem értékelhető, ha az első oltásnál, akár az oltott, akár a kontroll madarakból vett szérummintákban paramyxovírus 1-es szerotípusa elleni ellenanyagok mutathatók ki, illetve ha a felülfertőzéskor elvégezett szerológiai vizsgálatok a kontrollcsoportban ilyen ellenanyagokat mutatnak ki. A vizsgálat nem értékelhető, ha a kontroll madarak közül 70%-nál kevesebb az elhullás, vagy a baromfipestis fertőzés súlyos tüneteit mutató állatok száma. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha az oltott madaraknak legalább 90%-a túlél, és nem mutatja a madár paramyxovírus 1 vírusfertőzés súlyos tüneteit.
Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 7.7-3 2-5. AZ ELŐÁLLÍTÓ ÁLTAL VÉGZETT VIZSGÁLATOK 2-5-1. Maradék élő vírus. A vizsgálatot előkeltetett tojásokon vagy megfelelő sejttenyészeteken (5.2.4) végezzük, aszerint, hogy melyik a legérzékenyebb a vakcinatörzsre. A vizsgálatban használt inaktivált vírusaratás mennyisége nem lehet kevesebb, mint a vakcinadózis 10-szerese. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha élő vírus nem mutatható ki. 2-5-2. A gyártási tétel hatóértékének vizsgálata. A Hatóérték (3-5.) pontban előírt vizsgálatot nem szükséges minden gyártási tétel esetében elvégezni, amennyiben azt egy legkisebb hatóértékű gyártási tételnél előzetesen meghatározták. Ha a vizsgálatot nem végezzük el, más megfelelő validált vizsgálatot kell alkalmazni, amelynek elfogadási követelményeit arra a vakcina gyártási tételre vonatkoztatva kell megállapítani, amely a Hatóérték pontban leírt vizsgálat szerint megfelelő eredményt adott. A következő vizsgálat végezhető el. Amennyiben lehetséges, az antigéntartalom vizsgálatát (2-5-2-1. pont) az adjuváns vizsgálatával (2-5-2-2. pont) együtt végezzük el. Csirkéken való alkalmazásra szánt vakcinák. Az antigéntartalom vizsgálata (2-5-2-1. pont) az adjuváns vizsgálatával (2-5-2-2. pont) együtt elvégezhető; ha a termék tulajdonságai nem teszik lehetővé, hogy ezekben a vizsgálatokban értékelhető eredményeket kapjunk, vagy a gyártási tétel nem felel meg a vizsgálatok követelményeinek, a szerológiai vizsgálatot (2-5-2-3. pont) lehet elvégezni. Amennyiben a vakcina nem felel meg az utóbbi vizsgálat követelményeinek, a csirkéken való alkalmazásra szánt vakcinákra előírt vizsgálat (2-4-2-1. pont) végezhető el. Húsznál kevesebb madárból álló csoportok akkor használhatók, és a felülfertőzést követően akkor alkalmazható rövidebb megfigyelési idő, amennyiben igazolt, hogy a vizsgálat így is értékelhető. Egyéb állatfajokon (nem csirkéken) való alkalmazásra szánt vakcinák. Olyan alkalmas vizsgálatot végezzünk el, ami megfelelő korrelációt mutat az egyéb állatfajokon (nem csirkéken) való alkalmazásra szánt vakcinákra előírt vizsgálattal (2-4-2-2. pont). Az elfogadhatóság követelményeit egy, az utóbbi vizsgálatban megfelelő eredményeket adó gyártási tételre vonatkoztatva állapítják meg. Alkalmazható például egy meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból (5.2.2) származó csirkéken végzett, a vakcina lépcsőzetesen emelkedő mennyiségére adott szerológiai válasz (például 1/25, 1/50 és 1/100 adag, 17 21 nappal későbbi savóminta vétel) méréséből álló vizsgálat. Alternatív módszerként alkalmazható az antigéntartalom (2-5-2-1. pont) és az adjuváns (2-5-2-2. pont) együttes vizsgálata, amennyiben igazolt, hogy a hatóérték így is meghatározható. 2-5-2-1. Antigéntartalom. A relatív antigéntartalmat enzimhez kötött immunoszorbens meghatározással (2.7.1) határozzuk meg olyan módon, hogy összehasonlítjuk az egy adag vakcinában levő hemagglutinin-neuraminidáz antigéntartalmat egy hemagglutinin-neuraminidáz antigén referenciakészítménnyel. Ehhez az összehasonlító vizsgálathoz BRP Baromfipestis (Newcastle betegség) vírus referencia antigén, BRP Baromfipestis (Newcastle betegség) vírus kontroll antigén, BRP Baromfipestis (Newcastle betegség) vírus felszíni antigén elleni ellenanyag és BRP Baromfipestis (Newcastle betegség) kimutatására szánt konjugált ellenanyag alkalmazható. A meghatározást megelőzően az antigént az emulzióból R izopropil-mirisztáttal vagy más alkalmas módon lehet kivonni. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha a mért antigéntartalom nem alacsonyabb szignifikánsan, mint a vakcina egy olyan gyártási tétele esetében, amely az immunizáló képesség (2-4-2.) pontban előírt vizsgálatban megfelelőnek bizonyult. 2-5-2-2. Adjuváns. Amennyiben az immunkémiai meghatározást (2-5-2-1. pont) végezzük el, és a vakcina adjuvánst tartalmaz, az adjuvánst megfelelő fizikai és kémiai módszerekkel vizsgálni kell. Olajos adjuvánst tartalmazó vakcinák esetében az adjuvánst az Állatgyógyászati vakcinák (0062) cikkelyben leírtak szerint vizsgáljuk. Ha az adjuváns nem jellemezhető megfelelően, abban az esetben az antigéntartalom meghatározását nem lehet a gyártási tétel hatóértékének vizsgálatára alkalmazni. 2-5-2-3. Szerológiai vizsgálat. A vizsgálathoz legalább 15, 21 28 napos, azonos eredetű, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból (5.2.2) származó csirkét használunk. Legalább 10 csirkét egyedenként a vakcina adagjának 1/50 részével intramuszkulárisan oltunk. Legalább öt, ugyanolyan korú és eredetű csirkét kontrollnak hagyunk. 17 21 nappal később minden egyes oltott csirkéből vérmintát veszünk. A szérumban hemagglutináció-gátlás (HAG) módszerrel megmérjük az
Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 7.7-4 ellenanyagszintet, az alábbiakban leírt, vagy egy azonos számú hemagglutináló egységgel és vörösvértesttel végzett egyenértékű módszer alkalmazásával. Az alkalmazott vizsgálati elrendezésnek negatív és pozitív kontroll szérumokat is kell tartalmaznia, az utóbbi HAG titerének 5,0 log 2 és 6,0 log 2 között kell lennie. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha az oltott csoport átlagos HAG titere egyenlő vagy nagyobb, mint 4,0 log 2, és a nem oltott csoport átlagos HAG titere kisebb vagy egyenlő, mint 2,0 log 2. Ha a HAG titerek nem megfelelőek, a csirkéken való alkalmazásra szánt vakcinákra előírt vizsgálatot (2-4-2-1. pont) végezzük el. Hemagglutináció-gátlási próba. A szérumokat 56 C-on 30 percig tartó hőkezeléssel inaktiváljuk. Egy mikrotitráló lemez első sorában levő lyukakba 25-25 μl szérumot mérünk. A maradék lyukakba R nátrium-kloridot 9 g/l töménységben tartalmazó, ph 7,2 7,4 kémhatású tompítóoldat 25 μl-ét mérjük. A lemez teljes szélességében kettes léptékű szérumhígítási sorokat készítünk. Minden egyes lyukba az inaktivált baromfipestis vírus 4 hemagglutináló egységet tartalmazó szuszpenziójának 25 μl-ét adjuk. A lemezt 4 C-on 1 órán keresztül inkubáljuk. Ezután 3 4 hetes, baromfipestis elleni ellenanyagtól mentes csirkékből vett, 1 %V/V-os vörösvértest szuszpenzió 25 μl-ét mérjük a lemez lyukaiba. A lemezt 4 C-on 1 órán keresztül inkubáljuk. A HAG titer annak a legnagyobb hígításnak felel meg, amelynél még teljes gátlás figyelhető meg. 3. A GYÁRTÁSI TÉTEL VIZSGÁLATA 3-1. Azonosítás. A vakcina, baromfipestis vírus elleni ellenanyagoktól mentes állatokba oltva, ilyen ellenanyagok termelését váltja ki. 3-2. Baktériumok és gombák. A vakcina, illetve adott esetben a feloldására szánt oldószer is, feleljen meg az Állatgyógyászati vakcinák (0062) cikkelyben előírt sterilitási vizsgálat követelményeinek. 3-3. Idegen kórokozók. Tíz, 14 28 napos, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból (5.2.2) származó csirke mindegyikét kétszeres adag vakcinával, az egyik ajánlott módon oltunk. 3 hét múlva az állatokat ugyanolyan módon egy újabb adag vakcinával oltjuk. Két hét elteltével minden egyes csirkéből szérummintát veszünk, és a mintákat a 5.2.2 Vakcinák előállítására és minőségellenőrzésére szánt, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) csirkeállományok általános fejezetben előírt módszerekkel megvizsgáljuk az alábbi kórokozók elleni ellenanyagokra: madarak fertőző agy- és gerincvelő-gyulladásának vírusa, madár fertőző bronchitis vírus, madár leukózisvírusok, egg drop syndrome (EDS) vírus, madár fertőző bursitis vírus, madárfertőző laryngotracheitis vírus, influenza A vírus, Marek betegség vírusa. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek ha az előbbiekben felsorolt kórokozók elleni ellenanyagok termelését nem idézheti elő. 3-5. Maradék élő vírus. A vizsgálatot a baromfipestis vírus inaktiváltságának igazolására végezzük el. Tíz, 9 11 napos, előkeltetett, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból (5.2.2) származó tyúktojás mindegyikének allantois üregébe a vakcina adagjának kétötöd részét oltjuk és inkubáljuk. A tojásokat 6 napig megfigyelés alatt tartjuk, majd külön összegyűjtjük az élő embriókat és az elhalt embriókat tartalmazó tojások allantois folyadékát, azok kivételével, amelyek az oltást követő 24 órán belül haltak el. Az első 24 óra alatt elhalt embriókat megvizsgáljuk a baromfipestis vírus jelenlétére vonatkozóan. A vakcina nem felel meg a vizsgálat követelményeinek, ha baromfipestis vírus kimutatható. Tíz, 9 11 napos, előkeltetett, meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományból származó tojás mindegyikének allantois üregébe az élő embriókat tartalmazó tojásokból gyűjtött allantois folyadék 0,2 ml-ét, tíz hasonló tojás mindegyikébe az elhalt embriókat tartalmazó tojásokból gyűjtött allantois folyadék 0,2 ml-ét oltjuk, majd a tojásokat 5 6 napig inkubáljuk. Minden egyes tojás allantois folyadékát megvizsgáljuk hemagglutinin jelenlétére vonatkozóan, csirke vörösvértestek alkalmazásával.
Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 7.7-5 A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha hemagglutináló aktivitást nem tapasztalunk, és minden lépésnél az embrióknak legfeljebb 20%-a hullik el. Ha az egyik lépésnél az embriók több mint 20%-a hullik el, az a lépést megismételjük; a vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha hemagglutináló aktivitást nem tapasztalunk, és az illető lépésnél legfeljebb az embriók 20%-a hullik el. A vizsgálat során a külső bakteriális fertőzés megakadályozása érdekében antibiotikum alkalmazható. 3-6. Hatóérték. Az egyik ajánlott alkalmazási módon és formában beadott vakcina feleljen meg az Immunizáló képesség (2-4-2.) pontban előírt vizsgálat követelményeinek.