PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN Dr. Frank Schestag Fermentas GmbH PhD in molecular biology/biochemistry product menager at Fermentas Life Sciences head of technical service and customer support Dr. Dorgai László Biocenter Kft Ph.D. molekuláris biológia Molekuláris biológia termékfelelős
PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN A KLÓNOZÁS 3 NAP ALATT KIVITELEZHETŐ! 1. NAP VEKTOR ÉS INZERT PREPARÁLÁS LIGÁLÁS, TRANSZFORMÁLÁS 2. NAP A TRANSZFORMÁNSOK ANALÍZISE (KOLÓNIA PCR, A POZITÍVOK KIKERESÉSE) 3. NAP MINIPREP, RESTRIKCIÓS ANALÍZIS
AZ ELŐADÁS TÉMÁJA: - GYAKRAN FELMERÜLŐ PROBLÉMÁK - EZEK OKAI - LEHETSÉGES MEGOLDÁSOK CÉL: - A KLÓNOZÁSI ELJÁRÁS OPTIMALIZÁLÁSA - 80% POZITÍV ARÁNY!
NEM EMÉSZTŐDIK! NEM LIGÁLÓDIK! NINCS TRANSZFORMÁNS! NEM A KÍVÁNT INZERT VAN A TRANSZFORMÁNSBAN!
VEKTOR ÉS INZERT DNS PREPARÁLÁS - PCR - RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS - DNS MODIFIKÁCIÓ - FRAGMENT IZOLÁLÁS, GÉLEXTRAKCIÓ - KONCENTRÁCIÓ MÉRÉS LIGÁLÁS - A REAKCIÓ ÖSSZEÁLLÍTÁSA - KONTROL!!!! TRANSZFORMÁLÁS - KONTROL!!!!
1. probléma: a PCR termék nem vagy gyatrán emészthető Restrikciós hasító hely bevezetése az amplifikáló primerekbe Az enzimek eltérő mértékben hatékonyak a DNS végéhez közel! Megoldás: megfelelő számú extra nukleotid az oligó 5 végén Fermentas 2010/11 katalógus, 171/74(FD) oldal http:///en/support/troubleshooting-guide Alternatíva: 4-6 extra nukleotid (70%AT) az oligó 5 végén *16h
PCR termékek emésztése közvetlenül a PCR reakcióelegyben PCR reaction mixture 10 µl (0,1-0,5 µg) max 10X buffer (recommended) 2 µl!!! Restriction enzyme 1-2 µl (10-20 units) Water, nuclease free to 30 µl final volume Fermentas 2010/11 katalógus, 160 oldal
Az emésztett PCR termék nem vagy kis hatásfokkal klónozható Troubleshooting: Molecular Cloning A hőstabil DNS polimerázoknak nem nulla az aktivitása 37 C-on!! Az 5' túlnyúló végek részben vagy egészben feltöltődhetnek! EcoRI G^AATTC 5 túlnyúló: + Taq polimeráz: 5 - G 3 - CTTAA- 5 5 - GAATT- 3' 3 - CTTAA- 5 A PCR termék emésztése után minden esetben tisztítsuk meg a terméket (gél-izolálás, ultraszűrés), hogy eltávolítsuk az emésztés után keletkező rövid DNS darabokat, ezek interferálnak a következő ligálási lépéssel!!
2. probléma: a polilinker (MCS) nem emésztődik hatékonyan Közeli hasítóhelyek esetén jelentkezik NEM MINDEGY AZ EMÉSZTÉSI SORREND!! NEM MINDEN PÁROSÍTÁS MŰKÖDIK!! Fermentas 2010/11 katalógus, 172 oldal Troubleshooting: Molecular Cloning
Kettős/többes emésztés: puffer kompatibilitás FastDigest TM enzimek használata Egy puffer, két hőmérséklet, 5-10 perc!!! Troubleshooting: Molecular Cloning Fermentas 2008/09 katalógus, 44 oldal
probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik OK: Az enzim részben, vagy teljesen gátolt a metiláció miatt dam és dcm metiláció, továbbiak: EcoKI, EcoBI, CpG G(m6A)TC C(m5C)AGG Dam Methylase Dcm Methylase BclI: TGATCA teljes gátlás BamHI: GGATCC nincs hatás Bsp143I(Sau3AI): GATC nincs hatás MboI: GATC teljes gátlás DpnI: G(m6)ATC nem vágja a nem metilált DNS-t! Megoldás: E.coli GM2163 használata (dam - dcm - )
probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik Fermentas 2011/12 katalógus, 175-181 oldal + minden egyes enzim leírása
probléma: a DNS szubsztrát nem emésztődik OK: az enzim nem aktív a felhasználó DNS-én MEGOLDÁS: tesztelje az enzimet Lambda DNS-en (Cat No: SD0029)
probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja) 1µg Lambda DNA + EcoRI A star aktivitás nem teljesen aspecifikus! BamHI: GGATCC star activity: NGATCC GGNTCC GPuATCC
probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja) Troubleshooting: Molecular Cloning OK: - A szükségesnél hosszabb inkubáció - A szükségesnél nagyobb enzimkoncentráció -Magas glicerin koncentráció -Szerves oldószerek (EtOH, DMSO) -Alacsony ionerősség -Szuboptimális ph MEGOLDÁS: - Csak a szükséges mennyiségű enzim, rövidebb inkubációs idő - 5%-nál nem több glicerin - Kellően tiszta DNS szubsztrát - Az enzimhez ajánlott puffer - A leggyakoribb ok: hosszú, overnight inkubálás!!! - Mg helyett Mn/Co
A vektor és az inzert is emésztődik, mégsem kapjuk meg a kívánt klónt. (a restrikciós enzim minősége!)
probléma: UV hatás A DNS károsodik UV hatására (fotózás, gélből történő kivágás során Megelőzés: - Hosszú hullámhosszt használni a megvilágításhoz (360 nm) - Rövid hullámhossz használata lehetőleg csak néhány másodpercig - DarkReader és EtBr-alternatív DNS festék használta
DarkReader: látható fényű transzilluminátor
probléma: UV hatás A klónozás hatékonysága az UV kitettség függvényében Kék fény idő
EtBr-alternatív DNS festékek 1% agarose, 1xTAE, GRGreen in-gel staining, gel thickness: ~5 mm, comb: 3 mm wide Loading: Fermentas 1kb Plus (SM1331), 10 μl/slot, a serial 2-fold dillution Exposition: DarkReader, FlashGel camera (LONZA) 500 bp 500 250 125 62 31 16 ng total/10 μl 75 32 16 8 4 2 ~ng of the 500 bp band
8. probléma: DNS mérés/gél-extrakciós kitek Két változat létezik: Spin-column vagy szilika gyöngyös Probléma: a szilika törmelék és a binding puffer maradvány zavarja az OD 260 mérést Megoldás: határozza meg a DNS koncentrációt gélen
DNS meghatározás gélen Mindig azonos loading dye-t használjon a markerhez és mintához Mindig a legközelebbi méretű fragmenteket hasonlítsa össze Lehetőleg használjon hígítási sorokat a mintából és markerből
DNS meghatározás gélen Pl. Mass Ruler Express
probléma: DNS végek nem hatékony blunt-olása Használja a megfelelő blunt-olási stratégiát: 5'- NNN 5'- NNNNNNN -3' 3'- NNNNNNN -5' 3'- NNN X 5' overhang 3' overhang Ajánlott enzimek: T4 DNA Polymerase, Klenow, (S1 nuclease) ne használjon Klenow exo minus-t Kevésbé hatékony: Pfu vagy egyéb exonukleáz aktivitással rendelkező enzimek Mindig tegyen dntp-t reakcióelegybe! Fast End-repair kit (5 perc bluntolás és foszforilálás!
probléma: T4 ligáz inhibítor jelenléte magas sókoncentráció (150 mm NaCl, 200mM KCl), Cs +, Li +, NH 4 + (NH 4+ pl. a Pfu/Taq pufferben!) 1mM Spermidine EDTA, fehérjék, phenol, ethanol silica matrix (spin columns!!) 5%-nál nagyobb glicerin koncentráció datp
probléma: a T4 ligáz nem működik A ligáz aktív volt mikor megkaptuk, de néhány használat után már nem működik Lehetséges ok: a mélyhűtő túlhűt (-30 O C alá)! A T4 ligáz érzékeny a fagyasztási/kiolvasztási ciklusokra!! A kiszerelésben lévő glicerin -30 O C alatt már nem véd fagyás ellen. 3 fagyasztási/kiolvasztási ciklus drámai aktivitáscsökkenéshez vezet!!
probléma: a T4 ligáz nem működik Lehetséges ok: túl sok ligáz használta, autoinhibíció! - Ne használjon az ajánlottnál több ligázt!! 20-100 ng vektor 1.0-1.5 Weiss Units T4 DNS ligáz (sticky ends) 1.5-5 Weiss Units T4 DNA Ligáz (blunt ends) végtérfogat 20µl
T4 DNS Ligáz reakció Példa egy ligálási reakcióra: 1. Nuclease free water final volume 20 µl 2. 20-100 ng Plasmid 3. Molar Ratio of Vector: Insert = 1:3/1:5 4. 2 µl 10x ligation buffer for T4 DNA Ligase 5. 2 µl PEG 4000 50% for blunt end ligations 1.0-1.5 Weiss Units T4 DNA Ligase (sticky ends) 1.5-5 Weiss Units T4 DNA Ligase (blunt ends) Incubate 10 min-2h at 22 C. Very seldom overnight incubation gives better results
T4 DNS Ligáz reakció Hogyan számoljuk ki a moláris arányát a ligálható végeknek (pmol) Példa: Vektor: 6kb (20ng); Inzert : 1kb; Vektor: Inzert arány 1:3 20ng Vektor x 1kb inzert x 3 6kb vektor 1 = 10ng Inzert
Ligálási hatékonyság vizsgálata Használjon SDS tartalmú loading dye-t Melegítse a mintát 65 O C-on 10 percig Analysis of ligation reaction products on agarose gel. M - GeneRuler DNA Ladder Mix. 1 mixture of DNA insert and vector. 2 after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye Solution 1 2 3 M 3 mixture of DNA insert and vector after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye & SDS Solution. (R1151) 1%SDS in a 6x loading dye
A ligáz aktivitásának ellenőrzése 1 2 1. Lambda Hind III Marker digested 0.5 µg 2. Lambda Hind III Marker ligated 0.5 µg 20 µl from ligation reaction 500ng Lambda Hind III digested DNA 1 Unit T4 DNA Ligase 2 µl 10x T4 DNA Ligase buffer 20 µl reaction volume 30 min 22 C (RT)
probléma: kevés a transzformáns Tesztelje a kompetens sejtek hatékonyságát: 0.1 ng supercoiled vektor (pl. puc19) 100 kolóniát kell eredményezzen! A hatékonyság legalább 1x10 6 /µg kell legyen
probléma: kevés a transzformáns A ligáz DNS kötő fehérje!! Olyan nagy DNS/fehérje komplexek jöhetnek létre, amik nem transzformálhatók! Transzformálás előtt inaktiválja a ligázt hővel (10 perc, 65 O C) Ne hőinaktiváljon, ha PEG van a pufferben (pl. gyorsligáló kitek)
14. probléma: kevés a transzformáns Lehetséges ok: túl sok ligálási elegyet használt Ne használjon a kompetens sejtek térfogata 10%-ánál több ligálási elegyet kémiai kompetens sejtek esetében Ne használjon 0.1-1 µl ligálási elegynál többet 50 µl elektrokompetens sejthez
Direkt-szelekciós vektorok használata
Megfelelő kontrolok használta Nincs vektor, de minden más van Nincs transzformáns Működik az antibiotikum, nincs fertőzés
Megfelelő kontrolok használta Emésztett vektor transzformálása Nincs vagy kevés a transzformáns A vektor megfelelően volt emésztve
Megfelelő kontrolok használta Az emésztett és ligált vektor transzformálása Kompatibilis végek esetében van transzformáns: a végek intaktak, működik a ligáz Nem komptibilis végek esetén nincs vagy kevés a transzformáns
Megfelelő kontrolok használta P P A foszfatáz htékonyságának tesztelése Nincs vagy kevés trnszformáns 1. pl. FastAP kezelés 2. ligálás
Általános probláma Jelenség: kevés transzformáns, nincs vagy sérült az inzert OK: az inzertet nem tolerálja az E. coli pl. túl erős promóter, toxikus géntermék, invert repeat Nincs áltlános megoldás, de segíthet: Jól szabályozható promóter hsználta Alacsony kópiaszámú vektor használta Alacsony inkubációs hőmérséklet
Köszönöm a figyelmet
Focus Restriction Digest LO tested enzymes and exclude any possibility of endo-, exonuclease and phosphatase contamination in enzyme preparations