Fehérjekromatográfia Bobály Balázs BME VBK, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék, HPLC csoport 2015
Tematika 1. Bevezető 2. Molekulaszerkezetből adódó, eltérő kromatográfiás alapjelenségek 3. Heterogenitás jellemzésére szolgáló kromatográfiás módszerek Sok empirikus adat lesz, csak az alapelveket kell megtanulni!
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? - Biológiai rendszerek működésének megértése koncentráció/szerkezet/aktivitás időbeli/térbeli változása - Hatásos fehérjealapú gyógyszerek előállítása szerkezet-funkció-aktivitás kapcsolat megértése, hatóanyag/termék minőségének ismerete: hatásosság/immunogenitás
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? 2012-ben a TOP 10 forgalmú gyógyszerből 7 fehérje alapú! Autoimmun betegségek, arthritis, rák, diabetes, stb Market 2012 Sales ($ billion) Active ingredient Small molecule/ Biologics Indication(s) 01 Humira 9.5 Adalimumab Monoclonal Antibody Rheumatoid arthritis 02 Enbrel 8.4 Etanercept Fusion protein Autoimmune disease 03 Seretide 8.0 Salméterol Small molecule Asthma 04 Remicade 7.7 Infliximab Monoclonal Antibody Rheumatoid arthritis 05 Mabthera 6.9 Rituximab Monoclonal Antibody Leukemias 06 Crestor 6.7 Rosuvastatine Small molecule Hypercholesterolemia 07 Lantus 6.1 Insuline Protein Diabetes 08 Herceptin 6.1 Trastuzumab Monoclonal Antibody Breast cancer 09 Avastin 6.0 Bevacizumab Monoclonal Antibody Various cancers 10 Sortis 5.6 Atorvastatine Small molecule Hypercholesterolemia TOTAL 71.0 (+ 33% vs 2004) 4
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? Nehézségek: -A minták általában összetettek: szövetek, testfolyadékok, sejtkultúra szükség van a mátrix egyszerűsítésére -Adott szekvenciával definiált fehérjemolekulák is nagymértékű heterogenitást mutatnak: mutációk (pl. aminosavcsere a láncban) transzlációs módosítások (pl. foszforiláció, glikoziláció) környezeti hatások (pl. oxidáció, aggregáció) - A nagyfokú variabilitás miatt nem érhetőek el homogén analitikai standardek Kismolekula szalicilsav 138 Da Peptid triptorelin 1311 Da Fehérje HGH 22125 Da mab Cetuximab 150 kda ADC Brentuximab vedotin 150 kda összetettség 5
1. Mit is jelent a variabilitás esetünkben? - Egy aspektus, a glikoziláció Egy mab fő glikoformái. PNGase-F: cukrok hasítása a fehérjéről Jelölés 2-aminobenzamiddal HILIC-UV-MS 6
1. Mit is jelent a variabilitás esetünkben? - És a többiek Óra óra anyaga óra megemlítjük 7
1. Miben segítenek az elválasztástechnikai módszerek? - Mátrix egyszerűsítése: analitikai (pl. MS vizsgálatok)/preparatív céllal (további vizsgálatok) - Heterogenitás jellemzése: megfelelő módszer megválasztása - Mennyiségi meghatározás: referenciaanyag megválasztása alapvető Technikák: - elektroforézis (2D-gél, CGE, cief, CEC, CZE) - folyadékkromatográfia 1. (SEC, IEC, RP, HIC, HILIC): analitikai módszerek - folyadékkromatográfia 2. (HIC, AC, IEC): preparatív módszerek - tömegspektrometria (ionok elválasztása) - GC: NEM!! SFC: NEM!!
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió kismolekula közepes méretű molekula (peptid) makromolekula (fehérje) MW [Da] <1000 1000-5000 >5000 D h (Å) 5-10 10-15 >10-15 D m [cm 2 /s] 10-5 5*10-6 5*10-7 konformáció jól definiált rugalmas molekula statisztikus eloszlású (környezet) J. Pharm. Biomed. Anal. 54 (2011) 482. A diffúziós állandó csökken a molekulamérettel: Meghatározza a mérés sebességét az anyagátadási ellenállás növekedése miatt A hidrodinamikai átmérő nő a molekulasúllyal: Meghatározza a töltet pórusméretét
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió Kismolekula közepes méretű molekula (peptid) d p (Å) 60-100 100-150 makromolekula (fehérje) 150-500 (ált. 200-300) C tag nagyon megnő (D m miatt) Kompromisszum: R s vs. mérési idő
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió B tag kisebb: diffúziós úthossz (kék nyilak) ~5% C tag kisebb: diffúziós úthossz (piros vonalak) ~5% A tag kisebb: találgatások ~30 40% R szemcse R mag C tag csökkentése=hatékonyság növelése B tag: elhanyagolható Nemporózus töletetek: Nagy hatékonyság Kis terhelhetőség Kis visszatartás Csak indokolt esetben: ha a felületi kölcsönhatás kinetikája lassú és így kisebb a hatékonyság Kis szemcseméret, héjszerű, nagyobb pórusméretű töltetek, magasabb hőmérséklet
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió Halo Kinetex 12
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió 13
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól méret és diffúzió Molekulaméret csökkentése: (bővebben fehérje MS) Nagyobb hatékonyság Variabilitás jobban elemezhető kis különbsége relatíve nagyobbak lesznek
Peptid térképezés (peptide mapping) Fehérje emésztése (proteolízis) pl. tripszinnel 0.5 2kDa peptidek RP, vagy HILIC kromatográfia, UV+MS detektálás Szekvenálás, peptidek azonosítása, fehérje azonosítása, általános minőségi ellenőrzés Hátrány: hosszas minatelőkészítés (automatizálható), összetett kromatogram Előny: kis molekulaméret miatt jobb elválasztás, több információ 15
Limitált proteolízis Fehérje emésztése (proteolízis) pl. papainnal Fc+Fab fragmensek RP, IEX, HIC, vagy HILIC kromatográfia, UV(FL)+MS detektálás Variánsok azonosítása, általános minőségi ellenőrzés Hátrány: nagyobb molekulaméret, mint triptikus peptidek esetén Előny: gyors mintaelőkészítés, egyszerűbb kromatogram C term. lizin variánsok: Fc + nk (n=0 2) N term. glutamin (Q) piroglutamát (pe) variánsok: Fc + nk (n=0 2) 16
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - visszatartás kismolekula: a megoszlás (visszatartás) jól szabályozható a mozgófázis összetétellel: alkalmazható izokratikus elúció (nagyobb szelektivitás hasonló vegyületek esetén). fehérje: sztöchiometrikus kiszorítás - Z számú szolvens molekula szükséges az elúcióhoz: I/O viselkedés ~1% változás φ-ben eldöntheti, hogy k 0, vagy k gradiens elúció szükséges!
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - adszorpció, csúcsterület, kinetikai hatékonyság, visszatartás Intakt mab 1200 1000 50mM formate ph3 25mM formate ph3 10mM formate ph3 0.1% TFA Intakt mab LC HC 800 EU 600 400 200 0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 Time (min)
Nagyon eltérő viselkedés lehet, ami nem jelezhető előre! T; P együtt, egyes esetekben hektikusan változtatják a krom. viselkedést konformáció változás 19
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól adszorpció, M, pi, hidrofóbicitás Adszorpció mértéke: - Mérési körülmények oldaláról: T, C additív, P, kolonna, stb - Molekula oldaláról:??? Valószínűleg a kölcsönható felület minősége a döntő: konformációfüggő (mérési körülmények) 20
2. UHPLC előnyei továbbra is fennállnak! RP peptidtérképezés 21
3. Fehérjék heterogenitásának vizsgálatára szolgáló folyadékkromatográfiás technikák 22
Óra óra anyaga óra megemlítjük 23
3. Mit hoznak a konyhára az egyes LC módszerek? - Méretkizárásos kromatográfia (SEC): aggregátumok, fragmensek és kismolekulák elválasztása a natív fehérjétől - Ioncserés kromatográfia (IEC): anion és kation töltésvariánsok elválasztása - Fordított fázisú kromatográfia (RP): oxidált/redukált variánsok, valamint fragmensek elválasztása - Hidrofil kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HILIC): RP-re nagyjából ortogonális, főleg peptidek esetén használható - Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) alternatív RP, ADC-k jellemzése Gyógyszeripari környezetben a megfelelő jellemzéshez különböző módszerek együttes alkalmazása szükséges. A feladat komplexitása miatt nem elvárás az exakt jellemzés, de az elérhető legrészletesebb, koherens információval kell rendelkezni.
RPLC Minőség ellenőrzés Oxidált variánsok, aminosav variánsok Általános jellemzés kromatogram alapján IEX Töltés heterogenitás Nem denaturáló Denaturáló SEC Aggregáció Fragmensek Nem denaturáló HILIC Általában peptidek, glikánok jellemzése RP re ortogonális Denaturáló HIC Hidrofóbicitás ADC k jellemzése Denaturáló 25
3. LC módszerek SEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) - Aggregáció/fragmensek: terápiás hatékonyság változása, immunreakció - Kiváltó ok: fizikai/kémiai behatások, tárolás - Elválasztás hidrodinamikai rádiusz alapján (nem MW!) teljes kizárás 2-3 nagyságrend repulzió adszorpció teljes áteresztés - Főleg diol fázisok: ne legyen adszorpció! - d p : 3-20 µm, d c : 4.6-8 mm, L: 30 cm - mérési idő: 20-30 min - Eltérések a kalibrációs görbétől: - adszorpció - elektrosztatikus repulzió - konformációs változások ph pi beállítása 50-100mM puffer + 50-100mM só 5-10% MeOH/MeCN - Ált. nem MS kompatibilis pórusméret (Å) MW (kda) példa 100-150 10-100 Interferon 200-300 100-500 mab 500-1000 >500 PEGilált f.
3. LC módszerek SEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) 1: monomer (Interferon, ~19 kda) 2: dimer (~38 kda) 3: nagyobb aggregátumok főcsúcs(mab, ~150 kda) 2: dimer (~300 kda) 1: nagyobb aggregátumok Aggregátumok jellemzése: moltömeg meghatározása fényszórás detektorral (nehéz, sok a hibalehetőség) moltömeg meghatározása off line MS sel (egyszerű, lassú) moltömeg meghatározása on line SEC MS sel (egyszerű, gyors, kevés tapasztalat: MS barát körülmények)
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) -Elsősorban erős kationcserélő töltetek: nemporózus, szilika/polimer, vagy gyanta - 5-10 µm-es szemcsék, kolonnahossz nem kulcskérdés R s szempontjából - ph<pi-1, gradiens: 1-2M NaCl, vagy kereskedelmi ph gradiens puffer - Töltésvarinasok: pl. C term -lizin, N term -glutamin/piroglutamát variábilitás eltérő bioaktivitás - Molekulaméret csökkentésével javul a szelektivitás: limitált proteolízis Töltésvariánsok (aminosavcsere/transzlációs módosítás) elválasztása ph vagy só gradiens alkalmazásával Ioncserélő (kation v. anion) tölteten A töltet töltése ellentétes a variánsok töltésével!
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Ioncserélő gyanta Kationcserélő Anioncserélő Erős Acide fort kationcserlő Gyenge Acide faible kationcserélő Erős Base forte anioncserélő Gyenge Base faible anioncserélő SCX WCX SAX WAX Kvaterner szulfonát karboxilát amin SO 3 CO 2 ammónium NR + NHR + 2 4 Mozgófázis ph: - töltet töltött állapotban legyen -fehérje ellentétes töltésű legyen -mab-ok: pi ált. 7-9, enyhén savas ph, kationcsere 29
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Kationcserés kromatográfia Főcsúcs Bázikus variánsok Savas variánsok pi alacsony (savas) pi magas (bázikus) 30
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Kationcserés kromatográfia Csúcsfelbontás növelhető az oszlophossz és a gradiensidő növelésével Nem lehet előre megmondani, hogy melyik kolonna lesz a jó. F,G,H,I: négy különböző kolonna; 1,2,3,4: különböző mab ok 31
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) ph gradiens só gradiens J. Pharm. Biomed. Anal. 102 (2015) 282. J. Pharm. Biomed. Anal. 102 (2015) 33. - Szelektivitás egyes esetekben változik - Sógradiens mellett ált. nagyobb a hatékonyság - Sógradiens mellett ált. mérsékelt adszorpció - Sógradiens egyszerűbben megvalósítható
3. LC módszerek IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Só és ph gradiens elválasztás is tervezhető! Vizsgáljuk, hogy a kromatográfiás paraméterek változásának hatására hogy vándorolnak a csúcsok a kromatogramon (kísérleti terv), majd megkeressük az optimális körülményeket A kritikus pár felbontását kell figyelni! Faktorok itt: Gradiens idő ph 33
LC módszerek RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges) - Fragmensek, oxidált/redukált variánsok, peptidtérkép: főként minőségellenőrzési vizsgálatokban - Elválasztás: főként hidrofób, kisebb mértékben poláris szelektivitás alapján (állófázisfüggő) - Kapcsolható MS-sel! - Robusztus, nagy felbontó erő jellemzi - Alapvető körülmények: - 200-300 Å C4-C18, bifenil, stb - héjszerű (hatékonyág) - T: 50-90 C - MeCN gradiens (0,1% trifluorecetsav) - 200-400 µl/min (2.1 mm i.d.) Problémák: - ált. denaturáló körülmények: aktív formában nem frakcionálható a fehérje (SEC, IEX OK.) - magas hőmérséklet: hődegradáció veszélye - konformáció nagyon függ a mérési körüményektől (additívek, P, T): adszorpció, retenció változhat A nagy hatékonyság érzékeny az anyagátadási ellenállásra: nagy MW kis D m Limitált proteolízissel jelentősen javítható (az adszorpciós hajlam is)
LC módszerek RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges) Filgrastim (18,8 kda) variánsok, BEH300 1.7 µm, 50*2,1 mm LC-GC Eur. 25 (2012) 540. ox red nat Papain emésztmény Fc+Fab variánsok ox DTT redukció LC+HC variánsok J. Pharm. Biomed. Anal. 70 (2012) 158.
LC módszerek RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges) A fehérjék érzékeny molekulák! A magas hőmérséklet, a savas mozgófázis és a hosszú mérési idő együtt degradálhatják a mérés közben! szellemcsúcsok, helytelen mérési eredmények! 36
3. LC módszerek HIC (bioaktív forma izolálása lehetséges) - Hidrofób az állófázis felületete - Kezdeti magas sókoncentrációval kisózzuk a fehérjéket az állófázis felületére - A sókoncentráció csökkentésével megtörténik a deszorpció/elúció - Főként preparatív elválasztásokban használják: bioaktív RP - Nagyon érzékeny a fehérje felületi hidrofóbicitásának változásaira Analitikai elválasztásban: ph pi, 50mM puffer + 1-2 Mm sógradies nemporózus töltet (polimer/módosított szilikagél), kis szemcseméret, kis kolonnatérfogat
3. LC módszerek HIC: ADC-k jellemzése (bioaktív forma izolálása lehetséges) - Ha a kapcsolás (linker) és a konjugált drog neutrális, egyébként IEC - Igéretes módszer antitest-drog konjugátumok jellemzésére: érzékeny a felületi hidrofóbicitás változására (Drug-Antibody Ratio: DAR nagymértékben befolyásolja a szer hatékonyságát) - Eddig kevés a tapasztalat
3. LC módszerek HIC: ADC-k jellemzése (bioaktív forma izolálása lehetséges) A kismolekula konjugációja extra variabilitást visz a már amúgy is komplex analátba 39
3. LC módszerek AC - Rendkívül sokféle állófázis, igényre szabható ($) - Főbb típusok: - immunaffinitás (antigén megkötése immobilizált antitesttel, vagy fordítva) - immobilizált fémion affinitás (IMAC): Co/Cu/Ni: hisztidintartalmú fehérjék Fe/Zn/Ga: foszfopreoteinek - lektin: glikoproteinek -stb - Adott fehérje kinyerése további vizsgálatra, vagy mátrix tisztítása zavaró fehérjéktől. - Kolonnában, SPE, vagy spin-cartridge-ként is elérhető
3. LC módszerek frakcionálás fehérje és peptid szinten Humán plazma fehérjék (Alb, IG depletálva) RP: nincs glikoform elválasztás Transzferrin triptikus emésztmény HILIC: glikopeptid dúsítás Helyspecifikus glikoziláció minor glikoformokra is - Megfelelő szelektivitás kiválasztása - Frakciószedés, mintaelőkészítés, analízis - Minor komponensek szelektív dúsítása, tetszőleges mértékben.
Összefoglalás Fehérjekromatográfia: Komplex, érzékeny minták Összetett elemzés Sok empirikus paraméter a módszer fejlesztésben Sok kihívás, izgalmas Nagy piac Munkalehetőség 42