Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia Program Doktori (Ph.D.) értekezés Diabéteszes redox változások hatása a stresszfehérjékre dr. Nardai Gábor Témavezeto: Prof. Csermely Péter Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest 2002
BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK A sejtet éro különbözo károsító hatásokra szintetizálódó, aktiválódó stresszfehérje-rendszer a celluláris védekezés igen konzervatív és hatékony része. A felfedezésük óta eltelt negyven év alatt számos stresszfehérjét azonosítottak, ismertté váltak biokémiai sajátosságaik, muködésük általános vonásai, szerkezeti alapjai is. Az utóbbi évek kutatásai egyre több olyan funkciójukat is feltárták, amelyek a sejt nyugalmi állapotában is fontosak. Ezen új eredmények ismeretében még izgalmasabb kérdés, hogy milyen szerepet töltenek be a stresszfehérjék az egyes betegségek pathomechanizmusában. Ismeretes, hogy védenek az ischaemiás-reperfúziós sejt- és szövetkárosodástól, javítják a szervtranszplantátumok felhasználhatóságát, aktiválásukkal egyes neurodegeneratív, krónikus betegségekkel szembeni ellenállás fokozható, az antigén prezentációban betöltött szerepük kihasználható a daganatos betegségek terápiájában. Ugyanakkor e fehérjék kóroki tényezoi több autoimmun betegségnek, a konformációs betegségeknek és mutációkat elnyomó hatásukkal hozzájárulhatnak egyes poligénes betegségek gyakoriságának csökkenéséhez. A fenti, szélesköru ismeretek ellenére igen keveset tudunk arról, hogy krónikus stresszállapotokban, betegségekben mi történik a stresszfehérjék muködésével. Doktori munkám során azt vizsgáltam, hogy diabétesz mellituszban, ahol az oxidatív stressz a kórfolyamat obligát velejárója, és hatása mind az intra-, mind az extracelluláris térben észlelheto, hogyan változik meg egyes kitüntetett szerepu citoplazmatikus és endoplazmatikus retikulumbeli stresszfehérjék muködése. Vizsgáltam a dajkafehérje aktivitású Hsp90 redox tulajdonságait és az oxidatív környezet esetleges hatását a fehérje muködésére. A Hsp90 fehérje a 90 kda-os stresszfehérjecsalád foként citoplazmatikus lokalizációjú tagja. A kompartment fehérjéinek 1-3 %-át adja és stresszhatásra szintje tovább emelkedik. Alapállapotban dimereket alkot, de pl. hohatásra oligomerizálódik. Doménszerkezete hármas tagolódású, az N- és C-terminális doméneket egy kicsi, de erosen töltött régió kapcsolja össze. Mind az N- mind a C-terminális rendelkezik nukleotid-kötohellyel, az ATP kötés a ciklikus Hsp90-segédfehérjék-szubsztrát kölcsönhatáshoz nélkülözhetetlen. Hidrofób kötofelszínei biztosítják muködésének szerkezeti alapját, hisz fontos szerepe van a károsodott szerkezetu fehérjék kiszurésében, aggregációjának gátlásában és esetleges renaturációjukban (ATP independens, passzív dajkafehérje-hatás). ATP-függo muködése során (aktív dajkafehérje-hatás) pedig újonnan szintetizálódó fehérjék 1
szerkezetének stabilizációjában, érésében vesz részt. A hat ciszteint tartalmazó fehérje redox tulajdonságairól eleddig annyit tudtunk, hogy szabad tiol-csoportjai szükségesek a DNS-sel, egyes fehérjékkel, kismolekulákkal történo interakciójához. Egyes becslések és analógiák azonban további redox tulajdonságokat valószínusítettek. Kísérleteimban arra a kérdésre kerestem választ, hogy rendelkezik-e a Hsp90 oxido-redukciós enzimaktivitással, illetve, hogy a környezet oxidatív változása hogyan befolyásolja muködését? Az endoplazmatikus retikulumban számos stresszfehérje található. Ezek egy része, illetve homológjaik más kompartmentekben is megtalálhatók (pl.: Grp78, Grp94) és vannak az endoplazmatikus retikulumra specifikus stresszfehérjék is (pl.: calnexin, protein diszulfid izomeráz). A luminális stresszfehérjék nagy része dajkafehérje aktivitással is rendelkezik, amely elengedhetetlen összetett funkcióik ellátásához. Ismeretes, hogy a szekrécióra, illetve a membránba kerülo fehérjék a riboszómákról az ER lumenébe kerülnek és itt alakul ki végleges szerkezetük, itt történnek meg a poszttranszlációs módosulások, szerelodnek össze komplexeik. Ezek mind dajkafehérjék muködését igénylo folyamatok. Az egyik kiemelt jelentoségu folyamat a redox tekeredés, a diszulfid-hidak irányított szintézise a fehérjékben, melynek muködéséhez a lumennek a citoplazmához képest viszonylag oxidatív, szabályozott környezete elengedhetetlen. A diszulfid-hidak kialakítását a szubsztrátfehérjékben közvetlenül protein diszulfid izomeráz aktivitású fehérjék végzik (pl.: PDI, ERp57, ERp72), de a redox ciklus és az oxidatív környezet fenntartásában az ER membránban ülo és citoplazmatikus kapcsolattal rendelkezo fehérjék (pl.:ero1-l) és kismolekulák (glutation, aszkorbát) is részt vesznek. Irodalmi adatokból tudjuk, hogy a luminális redox környezet megzavarása a redox tekeredés gátlásával jár, illetve ismertté vált, hogy diabéteszben egyes ER stresszfehérjék (köztük a PDI) szintje változik. Kísérleteimben azt vizsgáltam, hogy diabéteszben változik-e az endoplazmatikus retikulum redox állapota és ezzel párhuzamosan stresszfehérjéinek (különösen a redox tekeredésben résztvevoknek) a muködése? 2
MÓDSZEREK A Hsp90 vizsgálatában alkalmazott fontosabb módszerek A Hsp90-et patkány májból izoláltuk egymást követo kromatográfiás lépésekkel 95-98%-os tisztaságig. A redox tulajdonságok részletesebb tanulmányozásához megszintetizáltattuk a Hsp90 egyes cisztein tartalmú peptidszakaszait is. A tiolcsoportok számát Ellman-reakcióval határoztam meg. A citokróm c redukcióját a fehérjére jellemzo 550 nm-es hullámhosszon mérheto abszorpciónövekedés detektálásával követtem. A Hsp90 protein diszulfid oxidoreduktáz aktivitásának méréséhez két különbözo érzékenységu módszerrel vizsgáltam, hogy képes-e a fehérje az inzulin diszulfid-hídjainak redukciójára. A NADPH:kinon oxidoreduktáz aktivitást a NADPH szint csökkenésének fotometriás követésével végeztem naftokinon és fenantrénkinon szubsztrátok jelenlétében. A Hsp90 dajkafehérje aktivitását citrát-szintáz modellszubsztrát segítségével határoztam meg. A kémiailag denaturált citrát-szintázt tízszeres feleslegben Hsp90-et tartalmazó pufferbe hígítottam és aktivitását a felszabaduló koenzim A mennyiségének meghatározásával követtem. Az endoplazmatikus retikulum vizsgálatában használt fontosabb módszerek A diabéteszes változások tanulmányozásához kétféle patkány modellt használtunk: spontán diabéteszes BB/Wor állatok és streptozotocin-indukált diabéteszes állatok. A máj mikroszóma frakcióját ultracentrifugálással izoláltam. A luminális tioltartalmat Ellman módszerével határoztam meg. A protein diszulfid oxidoreduktáz aktivitást fluoreszcensen jelölt inzulin szubsztrát segítségével határoztam meg. A luminális stresszfehérjék mennyiségét diszkontinuus SDS-gélelktroforézist követo Western-blottal vizsgáltam. Redox állapotukat pedig egy szelektív tiol-jelölo molekula (4-acetamido-4 -maleimidilstilbén-2,2 -diszulfonsav AMS) alkalmazásával, amely kötodése esetén csökkenti a fehérje mobilitását nem-redukáló SDS-gélen, a mobilitásváltozás Western-blottal detektálható. 3
EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS Doktoranduszi kutatómunkám eredményeit az alábbiakban foglalom össze: 1. Kimutattam, hogy a patkány májból izolált Hsp90, illetve egyes cisztein-tiol csoportjait tartalmazó peptidjei képesek a citokróm c redukciójára. Ez a Hsp90 tiol-csoportjaihoz kapcsolt folyamat. A Hsp90 hat cisztein-tiol csoportjából fiziológiás pufferben csak 3 érheto el SH-reagensek számára, ami ezen SH-csoportok felszíni elhelyezkedésére utal, a további három csak a fehérjeszerkezet felbontásával/denaturációval válik elérhetové. A Hsp90 protein diszulfid oxidoreduktáz, illetve NADPH:kinon oxidoreduktáz aktivitását nem sikerült kimutatni. Feltehetoleg tehát a Hsp90 nem vesz részt tiol-diszulfid kicserélodési reakciókban, de megfelelo szubsztrát jelenlétében ciszteinjei reaktívvá válnak. A citokróm c-vel történo interakciója apoptózis során valósulhat meg, hiszen az apoptoszómának mindketten tagjai, itt redukáló hatásával fokozhatja például a citokróm c prooxidáns hatását. Kísérleteim valószínusítik továbbá, hogy a redox környezet befolyásolja a Hsp90 dajkafehérje aktivitását, hiszen oxidatív környezetben a Hsp90 passzív dajkafehérje aktivitása csökken. Szintén új eredmény, hogy az aszkorbátdehidroaszkorbát redox páros hat a citoplazmatikus stresszfehérjék in vitro muködésére. Mivel diabéteszben mind az oxidatív stressz mind az aszkorbátdehidroaszkorbát rendszer szintjének és arányának változása jellemzo, elképzelheto, hogy ezek a Hsp90 csökkent muködéséhez vezetnek, tovább súlyosbítva a celluláris károsodás mértékét. 2. Korábbi kísérleteinkben észleltük, hogy diabéteszben az endoplazmatikus retikulum redox állapota megváltozik, redukálóbbá válik és ezzel párhuzamosan fokozott aszkorbát akkumuláció mérheto. Prof. Mandl József és Bánhegyi Gábor munkacsoportjával közös kísérletekben megállapítottuk, hogy ennek oka feltehetoleg a fehérje-tiolok mennyiségének növekedése és nem a dehidroaszkorbát-reduktáz aktivitású protein diszulfid izomeráz (PDI) stresszfehérje mennyiségének/aktivitásának megváltozása. 3. További kísérleteimben tisztáztam, hogy a belso milio redukciós eltolódásával párhuzamosan a redox tekeredésben részt vevo stresszfehérjék (protein diszulfid izomeráz, ERp57, ERp72) funkcionálisan igen fontos redox állapota is változik, 4
redukáltabbakká válnak. A PDI szintjének enyhe csökkenése is tapasztalható volt. A luminális oxidatív környezet fenntartásában kiemelt jelentoségu FAD-köto ERO1- L fehérje redox állapota is változott. Nem változott azonban más, a diszulfid-híd kialakításban közvetlenül részt nem vevo stresszfehérjék mennyisége és redox állapota sem. A luminális fehérjék redox állapotának diabéteszben tapasztalt eltolódása izolált mikroszómákon oxidált glutation és dehidroaszkorbát kezeléssel is visszaállítható volt. Ezek az eredmények fölvetik annak lehetoségét, hogy az ismert glutation redox rendszer mellett a lumenben amúgy is nagy koncentrációban jelen lévo aszkorbát-dehidroaszkorbát redox rendszer is kapcsolatban áll a fehérje diszulfid-hidak kialakításának folyamatával. Elképzelheto továbbá, hogy diabéteszben a szekréciós fehérjék betekeredése károsodhat, hozzájárulva ezzel egyes plazmafehérjék szintjének diabéteszben tapasztalt csökkenéséhez. Az ERO1-L fehérje redox állapotának befolyásolása pedig arra utalhat, hogy a luminális környezet redox tulajdonágainak megváltozása a metabolizmus diabéteszben tapasztalható felborulásának következménye lehet. 5
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés témájából megjelent tudományos közlemények: Nardai G., Sass B., Eber J., Orosz Gy. és Csermely P. (2000) Reactive cysteines of the 90-kDa heat shock protein, Hsp90. Arch. Biochem. Biophys. 384, 59-67. (IF:2,6, id: 2) Nardai G., Braun L., Csala M., Mile V., Csermely P., Benedetti A., Mandl J. és Bánhegyi G. (2001) Protein disulfide isomerase and protein thiol dependent dehydroascorbate reduction and ascorbate accumulation in the lumen of the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 276, 8825-8828. (IF: 7,3, id: 6) Nardai G., Korcsmáros T. és Csermely P. (2002) Reduction of the endoplasmic reticulum accompanies the oxidative damage of diabetes mellitus. In: Thiol metabolism and redox regulation of cellular functions. Szerk.: Pompella A., Bánhegyi G. és Wellman-Rousseau M., NATO Science Series, I/347, 281-289. Más tudományos közlemények: Nardai G., Schnaider T., Soti Cs., Ryan MT., Hoy PB., Somogyi J. és Csermely P. (1996) Characterization of the 90-kDa heat shock protein (HSP90)-associated ATP/GTP-ase. J. Biosci. 21, 179-190. (IF: 0.4, id: 7) Nardai G., Csermely P. és Soti Cs. (2002) Chaperone function and chaperone overload in the aged. A preliminary analysis. Exp. Gerontol. 37, 1255-1260. (IF: 2,6) Összefoglaló cikkek: Csermely P., Gergely P., Nardai G., Schnaider T., Soti Cs., Szántó I. és Somogyi J. (1994) Molekuláris chaperonok biokémiája. Biokémia 18, 126-132. Csermely P., Schnaider T., Soti Cs., Prohászka Z. és Nardai G. (1998) The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol. Ther. 79, 129-168. (IF: 6,5, id: 116) Soti Cs., Nardai G. és Csermely P. (2003) Stresszfehérjék az orvostudományban. Orv. Hetil. nyomtatás alatt. Könyvfejezetek: Nardai G. és Csermely P. (2002) Protein folding in diabetes. In: New insights in experimental diabetes. Szerk.: Cheta D., Romanian Academy Publishing House, Bucharest, pp. 120-131. Csermely P., Nardai G. és Soti Cs. (2002) Redox regulation in protein folding and chaperone function. In: Thiol metabolism and redox regulation of cellular functions. Szerk.: Pompella A., Bánhegyi G. és Wellman-Rousseau M., NATO Science Series, I/347, 273-280. Összes IF: 19,4 Összes id: 131 6