Vérkészítmény Tesztelése Tenyésztőmédiumkiegészítőként KÉSZÍTETTE: Babos Kitti Biomérnök szakos hallgató TÉMAVEZETŐ: Vácz Gabriella Budapest, 2014
Vérkészítmény Tesztelése Tenyésztőmédium-kiegészítőként Az őssejtekkel kapcsolatos kutatások napjainkban nagyon népszerűek, hiszen ezen sejtek felfedezésével és vizsgálatukkal lehetőség nyílt a regenerációs gyógyítás magasabb szintre emelésére. Az alkalmazásuk és működésük azonban továbbra is kérdőjelekkel teli. Az egyik vitatott terület a sejtek tenyésztésével van összefüggésben. A felnőtt sejteket felhasználó őssejtterápiák lényege ugyanis az, hogy az emberi szervezetben kis számban előforduló őssejteket speciális in vitro körülmények között feldúsítják és ezt a megnövelt, gyógyításra már elegendő mennyiséget jutatják el a probléma helyére. Ehhez a lépéshez olyan tenyésztőmédiumra van szükség, ami tartalmazza a sejtek növekedéséhez és differenciálódásához fontos anyagokat. Az egyik tápoldat-komponens az FBS (fetal bovine serum), azaz magzati szarvasmarha szérum, aminek az alkalmazása erősen vitatott. Az egyik komoly problémát a tudományos oldal jelenti, vagyis az, hogy az állati eredetű vér fertőzött lehet, így az alkalmazása komoly elővigyázatosságot igényel, ami a termék költségeit is megnöveli. Másfelől a szérum gyűjtése során rengeteg borjúmagzatot kell leölni, ami jelentősen megkérdőjelezi a módszer etikusságát. A TDK dolgozatom témája egy megfelelőbb kiegészítő találása az FBS helyett, amely ezeket a problémákat kiküszöböli. A vizsgált anyag egy emberi vérkészítmény, az SPRF (serumderived from platelet-rich fibrin), vagyis trombocitában gazdag fibrinből származtatott szérum volt. Ehhez nincs szükség állatok feláldozására és mivel a dúsításhoz szükséges mennyiség a beteg saját véréből elkészíthető, így az átfertőzéseket is megelőzi. A kísérletsorozat során fiatal, illetve idős donoroktól származó őssejteket kezeltem fiatal donor SPRF-ét, idős donor SPRF-ét, illetve FBS-t tartalmazó tápoldatokkal és vizsgáltam, hogy a három csoport körül melyik hozza a legnagyobb sejtnövekményt. A kapott eredmények arra engedtek következtetni, hogy a humán készítmény felülmúlhatja az állatit és így új távlatokat nyithat az őssejtterápiák felépítéséhez.
Testing a Blood Fraction as a Cell Culture Medium Supplement Stem cell based researches are very popular nowadays, because discovering and studying these cells made the chance to take regenerative healing to a higher level. However, their application and mechanisms are questionable so far. One of the most controversial areas is cell growing. The purpose of stem cell therapies, which use adult cells, is to enrich them to an increased number under in vitro conditions, because in the human body these cells are very rare. So then, this raised quantity is taken to the problematic part of the organism. For this step, we need a special culture media, which contains the important factors for cell growing and differentiation. One medium supplement is the FBS (fetal bovine serum), but the use of it is debated. Some problems are scientific, which means that the using of the product needs very serious providence, because it is inhuman. These methods make the FBS expensive. On the other hand, collecting the serum needs a lot of bovine sacrifices, which makes questions about the ethical part of this process. My study is about searching for another supplement instead of the FBS, which does not have the previously mentioned problems. The examined material was a human blood fraction named SPRF (serum-derived from platelet-rich fibrin). For this product we do not need to slaughter animals and there is no threat of contamination, because it can be acquired from the blood of the patients. In the experiments I used mediums with SPRF from an old donor, SPRF from a young donor and FBS as a media supplement to treat old and young mesenchymal stem cell lines. The following step was to test which one of these three groups had the greatest increase in the number of cells. The results showed that the human blood fraction can surpass the animal, and because of this, it can open up new perspectives for the construction of therapies utilizing stem cells.
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 1 2. Irodalom... 3 2.1. Őssejtterápiák... 3 2.1.1. Az őssejtek típusai... 3 2.1.1.1. Mezenchimális őssejtek... 5 2.1.2. Terápia mezenchimális őssejtekkel: múlt, jelen és jövő... 6 2.2. Az őssejtek tápanyagigénye... 8 2.2.1. Problémák az FBS használatával... 11 2.2.1.1. Humán alternatívák... 13 2.2.1.2. Szérum-mentes médiumok... 15 3. Kísérletek és módszerek... 16 3.1. Ötlet a kísérletek megvalósítására... 16 3.2. Sejtkultúra fenntartása... 17 3.2.1. Őssejtek általános ellátása... 17 3.2.1.1. Őssejt médium készítése, sejtek táplálása... 18 3.2.1.2. Passzálás... 19 3.2. Vérkészítmény tesztelése idős és fiatal donorból származő őssejtvonalakon... 20 3.2.1. Tenyésztőmédiumok elkészítése... 21 3.2.2. Sejtek számlálása és tálcára tétele... 22 3.2.3. Az életképesség mérése... 25 4. Eredmények és értékelésük... 27 4.1. A médiumok hatása fiatal donorból izolált sejtekre... 27
4.2. A médiumok hatása idős donorból izolált sejtekre... 28 4.3. Az eredmények értékelése... 29 5. A folytatás... 30 6. Összefoglalás... 31 7. Függelék... 32 7.1. Fiatal őssejtek mérési eredményei... 32 7.1.1. Kontroll médiumban... 32 7.1.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban... 34 7.1.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban... 36 7.2. Idős őssejtek eredményei... 38 7.2.1. Kontroll médiumban... 38 7.2.2. Fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiumban... 39 7.2.3. Idős donor SPRF-ét tartalmazó médiumban... 40 7.3. Eredmények összefoglalása... 42 8. Irodalomjegyzék... 43
Rövidítésjegyzék ESC Embrionális őssejt Embryonic stem cell NESC Nem embrionális őssejt Non-embryonic stem cell MSC Mezenchimális őssejt Mesenchymal stem cell BMSC Csontvelő eredetű őssejt Bone marrow-derived stem cell HBMSC Humán csontvelő eredetű őssejt Human bone marrow-derived stem cell FBS Magzati szarvasmarha szérum Fetal bovine serum PRF Trombocitában gazdag fibrin Platelet-rich fibrin SPRF Trombocitában gazdag fibrinből származtatott szérum Serum-derived from platelet-rich fibrin HPL Humán trombocita lizátum Human platelet lysate
1. Bevezetés Az őssejtek és a velük kapcsolatos terápiák napjaink orvostudományi kutatásainak egyik fontos területét alkotják. Ezt a tényt az indokolja, hogy a különböző típusú őssejtek képesek más és más sejtvonalbeli sejtekké differenciálódni, így a regenerációs medicina fel tudja őket használni a beteg, illetve sérült szövetek újjáépítéséhez, korrekciójához 1. Használatuk azonban a sorozatos kísérletek ellenére is kérdésekkel teli, a tenyésztésüktől kezdve egészen a hatásmechanizmusukig léteznek eddig megmagyarázatlan és kérdéses jelenségek. Az egyik problémát a sejtek számának feldúsítása jelenti. Az általunk vizsgált úgynevezett MSC-k (mesenchymal stem cells), vagyis mezenchimális őssejtek a szervezetben nagyon kis mennyiségben fordulnak elő, ezért a terápiás célú alkalmazásuk során fontos, hogy egy megfelelő sejtszámot dúsítsunk fel belőlük in vitro körülmények között és ezt a megnövelt mennyiséget juttassuk el a probléma helyére 2. Más módszereken alapuló technikák is igénylik ezt a lépést. A problémát tulajdonképpen az jelenti, hogy az őssejtek számára biztosítani kell a megfelelő összetételű tápközeget. Ma ez úgy történik, hogy a létfontosságú komponenseket tartalmazó, úgynevezett alapmédiumot ki kell egészíteni FBS-el (fetal bovine serum) és sokszor egy antibiotikum-keverékkel. A gondot okozó anyag tulajdonképpen az FBS, ami, mint a neve is mutatja, magzati állapotú borjú vérszérumát jelenti. Ennek a használata felvet ugyanis különböző problémákat 3. Egyrészről az állati eredet miatt jelent gyenge láncszemet, mert ennek okán betegségek forrása lehet. Hogy ezt elkerüljék, a levett vérkészítmény nagyon gondos ellenőrzésen esik át, ami a termék költségeit jelentősen megemeli és továbbra sem jelent százszázalékos biztonságot. Másrészről az őssejtes kutatások népszerűsége miatt hatalmas mennyiségekre van szükség belőle, ami rengeteg borjú lemészárolását jelenti. Mivel ezek a problémák nem elhanyagolhatóak, már régóta próbálkoznak különböző kiegészítőkkel, amik helyettesíteni tudnák az FBS-t. A legjobb természetesen a szérummentes kultúra megteremtése lenne, mellőzve minden állati eredetű összetevőt, de sajnos a tudomány jelenleg állása szerint az eddig létrehozott készítmények hatása még bizonytalan. Ezeknél egyelőre jobbnak tűnnek a humán véralapú termékek 4. A munkám során az SPRF (serum-derived from platelet-rich fibrin) elnevezésű trombocitában gazdag fibrinkészítménnyel kísérleteztem, melynek már több publikációban is bemutatott, jótékony hatása ismeretes az őssejtekre 5, azonban médium-kiegészítőként még nem foglalkoztak vele. 1
Az előnye abban is rejlik, hogy ezzel az eljárással akár a beteg saját véréből megteremthetőek lennének a dúsítás feltételei, így állati áldozatot nem igényelne továbbiakban a művelet és jelentősebb kontaminációs kockázatot sem jelent. A kísérletsorozatom célja tehát az volt, hogy különböző életkorú emberekből származó sejteket kezeljek SPRF-el és FBS-el kiegészített alapmédiumokkal, majd vizsgáljam, hogy az emberi vérkészítmény hatása összemérhető-e az állatival. 2
2. Irodalom 2.1. Őssejtterápiák A regenerációs gyógyítás napjainkban egy igen gyorsan fejlődő irányzatát jelenti a kutatásoknak. Ennek az alapja az, hogy az emberi test rendelkezik egy belső, regenerációra és javításra specializálódott rendszerrel az őssejteken keresztül, amelyek szinte az összes szövetben megtalálhatóak 6. Ezen sejtek tanulmányozásának megkezdése Becker nevéhez fűződik. A kísérleteiben csontvelő eredetű sejteket fecskendezett sugárkezelt egerekbe, majd arra a megfigyelésre jutott, hogy a kezelt állatok lépében csomók keletkeztek, melyek száma arányos volt a beadott sejtek számával 7. A további tanulmányozások az őssejtek két alapvető tulajdonságára hívták fel a kutatók figyelmét: önmegújulásra képesek, valamint megfelelő körülmények között különböző sejtvonalakba tudnak differenciálódni. Ezek a felfedezések tették lehetővé a szövetépítés fogalmának megteremtését. Az 1970-es években W. T. Green arra a konklúzióra jutott, hogy a biológiai tudományok segítségével lehetséges regenerálni és létrehozni új szöveteket úgy, hogy az életképes sejtekből mérnökölt állványzatokat hozunk létre 8. 1993-ban Langer és Vacanti kijelentették, hogy a szövetépítés egy komplex terület, ami alkalmazza a mérnökség alapjait, hogy olyan biológiai helyettesítőket alkosson, amelyek visszaadják, fenntartják vagy javítják a szövet funkcióit 9. Látszik tehát, hogy a fogalom ugyan finomodott az évek során, de a lényege megmaradt és ezt ismerték fel tulajdonképpen az őssejteket felhasználó terápiák. 2.1.1. Az őssejtek típusai Az őssejtek két típusát különböztethetjük meg: embrionális őssejtek (ESCs) o az első emberi ESC vonalat 1988-ban állapították meg 10 o totipotens tulajdonságúak: mindhárom embrionális csíralemez sejtjeivé tudnak differenciálódni 3
o a hólyagcsíra belső sejtcsomójából származnak: ICM (inner cell mass) beágyazódás után embriogenezis történik, amely során az ICM két különböző sejtlemezzé alakul: hipoblaszt epiblaszt o ez alakul tovább a három csíralemezzé, amelyekből képződnek a test különböző szövetei o totipotens tulajdonságuk hatalmas lehetőséget rejt, de az alkalmazás etikai kérdéseket vet fel: embrió morális állapota élet szentsége Nem-embrionális őssejtek (NESCs) o hierarchiában alacsonyabb szinten állnak, mint az embrionális őssejtek totipotens aktivitásukat ugyanis elvesztették 11 nem tudnak mindhárom csíralemez sejtjeivé alakulni o más szóval multipotens differenciálódási aktivitással rendelkeznek o izolálási területüket tekintve nagyon sokfélék: amnion folyadék 12 köldökzsinór szövet 13 zsírszövet 14 központi idegrendszer 15 csontvelő 16 retina 17 bőr 18 o tárgyalásuknál a csontvelőből származó sejtekre szeretnék kitérni, mivel munkám során ezekkel foglalkoztam csontvelő eredetű őssejtek (BMSCs) potenciál, hogy kötőszövetté differenciálódjanak 19 első izolációjuk úgy történt, hogy csontvelőt inkubáltattak műanyag edényben, majd négy óra után a nem letapadt sejteket eltávolították 4
o az edény mikroszkópos vizsgálata során heterogén sejtpopulációkat és adherens sejteket figyeltek meg 20 egy részük képes létrehozni a mezenchimát, vagyis azokat a szöveteket, amelyek az embrió mezodermájából keletkeznek: mezenchimális őssejtek (MSCs) 16 2.1.1.1. Mezenchimális őssejtek A kísérleteket MSC sejttípussal végeztem a kutatás során. Ezt indokolta ezen sejtek sokszínűsége és a kutatócsoport profilja, vagyis az ortopédiai alkalmazások lehetősége. A sejtek legfőbb izolálási területeit, valamint a belőlük differenciáltatható sejtvonalakat az alábbi ábrával szeretném bemutatni 1 : 1. ábra Régóta megállapított tény, hogy a sorozatos megújulások a csontváz összes szövetét jellemzik. Ez tehát azt jelenti, hogy a végső állapotba került sejtek (pl. oszteoblasztok) elpusztulnak és helyükbe újonnan differenciálódottak lépnek. Ez az utánpótlás az MSC-kel 5
valósul meg, amelyek in vivo funkciója a megújítás, és pontosan ezt a tulajdonságot használja ki a terápiás alkalmazás is. Mivel a számuk igen kicsi: 100 000-500 000 sejtmagvas csontvelői sejtre körülbelül 1 darab mezenchimális jut, ezért fel kell őket dúsítani a hatékony terápiás mennyiséghez 21. 2.1.2. Terápia mezenchimális őssejtekkel: múlt, jelen és jövő Az MSC-k első klinikai használata 1995-ben történt, amikor tanulmányt írtak abból, hogy 23 betegből kitenyésztettek egy adott mennyiséget és azt intravénásan visszaadagolták. A kísérlet konklúziója a következő: sikerült a sejteket in vitro dúsítani, valamint nem tapasztaltak toxikus hatást. 2013-ig összesen 338 klinikai kipróbálást írtak le 22. Már a sejtekkel való korai kísérletek szakaszában rájöttek arra, hogy a tenyésztett sejtek gazdasejtbe juttatásához szükséges valamilyen hordozó, amely lokalizálja őket az érintett területhez. Kezdetben rágcsáló és kutya preklinikai modelleket állítottak fel, hogy tanulmányozzák a sejtek masszív csontjavításban való részvételét 23. A kísérlet úgy nézett ki, hogy csontvelőből izolált MSC-ket növesztettek in vitro körülmények között, megfelelő tenyészőmédium segítségével, inkubátorban (37 C, 5%-os CO 2 koncentráció), majd a kitenyésztett sejteket áthelyezték fibronektinnel bevont pórusos kálcium-foszfát kerámiára. Azért erre az anyagra esett a választás, mert előzőekben már felfedezett oszteokonduktív tulajdonságokkal rendelkezik és indukálja az MSC-k útját az oszteogenezis irányába 24. Azt tapasztalták, hogy az MSC-k csontot képeztek a pórusokban, ennek mértéke pedig nagyobb és gyorsabb volt, mint amikor egyszerűen csak csontvelővel dolgoztak. Az így kapott őssejtes hordozót műtét útján juttatták a kísérleti állat sérült testrészébe és azt tapasztalták, hogy az beépült és javította a további gyógyulási folyamatokat. Napjainkban a terápiák fejlődése három különböző irányvonalat alakított ki: 1.) Sejtcserés terápiák o genetikai betegségeknél o mutáns sejtek cseréje allogén (nem saját) donor sejtekre 6
2.) MSC-k, mint növekedési faktorok/citokinek pumpái o szívinfarktus és stroke modellben 25-26 o az 1. ábra szerint nem tudnak szív miocitákká vagy neurális elemekké alakulni mégis javítást érnek el, de hogyan? szekretálnak molekulákat, amelyek stimulálják a javítómechanizmusokat és gátolják a degeneratív jelenségeket 3.) Szövetépítési stratégiák o MSC-k egyesítése egy 3 dimenziós állványban, ezzel helyettesítve in vivo a sérült, javítandó szövetek 3 dimenziós darabjait o például porcjavítás esetén szükség van egy fibronektin bevonatú szivacsra, melyet hialuronsavból készítenek szállító támasztott elvárások: o elősegíti és erősíti a sejttapadást o pórusos, így a differenciált sejtek képesek bőséges és specializált extracelluláris mátrixot kialakítani benne o engedi a bioaktív molekulák hozzáférését a sejtekhez o tökéletesen beépül az új szövetbe vagy lassan felszívódik a folyamat lépései 21 : 2. ábra 7
az MSC-ket izoláció után feldúsítját Petri csészékben, majd hozzáadják a fibronektinnel bevont szállítót, hagyják a sejteket rátapadni, végül beültetik a sérülés helyére A jövőbeli tervek természetesen arra vonatkoznak, hogy pontosan kiderítsük ezen sejtek működési mechanizmusait. Nem teljesen tisztázott például még az a terület sem, hogy melyek azok az anyagok, növekedési faktorok, amelyek kellenek ahhoz, hogy biztosítani lehessek a maximálisan hatásos és specifikus differenciálódást. További kérdés ezeknek a szükséges koncentrációja. A mechanizmus vizsgálatára kialakulóban lévő folyamat az úgynevezett sejtfestés 27. Ennek az elve az, hogy egy fúziós proteint használnak festékként, amely hozzá tud kötődni és így megjelölni a protein A vagy G elnevezésű fehérjét, ami nem kovalensen a sejtmembránhoz van horgonyozva a palmitinsav által. Ez a napjainkban fejlődő, sejteket megcélzó (ún. cell-targeting) stratégiák alapja, amit MSC-kre is ki lehet terjeszteni. 2.2. Az őssejtek tápanyagigénye Mint ahogy azt az előző fejezetekben is leszögeztem, az MSC-k mennyisége az emberi szervezetben olyan kevés, hogy a terápiás alkalmazáshoz mindenképpen szükséges feldúsítani őket in vitro körülmények között. Most arra szeretnék kitérni, hogy pontosan hogyan is történik ez a folyamat. Az őssejtek izolációja során a forrást (például csontvelőt) az emberi szervezetből való elkülönítése után egy speciális tenyésztő edénybe helyezik, és növesztő médiumot tesznek rá, amely tartalmazza a sejtek növekedéséhez és differenciálódásához szükséges anyagokat. Hogy megteremtsék a megfelelő körülményeket, amelyek a sejteket eredendően körülveszik, inkubátorban tárolják őket. Ez 37 C-os hőmérsékletet és 5%-os CO 2 koncentrációt jelent. A sejtek néhány nap után letapadnak az edény (általában Petri-csésze) aljára. Ez mikroszkópos vizsgálattal nyomon követhető folyamat. A tenyésztőmédium összetétele sejttípusonként eltér, nincsen olyan univerzális közeg, amely minden őssejtnek megfelelő lenne. A következőben szeretném felsorolni, hogy általánosságban milyen anyagokra van szükség a növesztési folyamat során 4 : 8
Aminosavak o az úgynevezett alapmédium tartalmazza, mivel minden őssejt igényli őket Szénhidrátok o alapmédiumban o energiaforrás o általában glükóz Hormonok o fiziológiásan a vérkeringésben szérum tartalmazza őket Növekedési faktorok o szérumban o sejt proliferációjának segítése és specifikus sejtfunkciók stimulálása o a legtöbb sejttípus-specifikus Proteáz inhibitorok o szérumban o tripszinációs folyamat inhibíciója védő hatás Nyíróerő kivédők o szérumban o turbulencia és perfúzió okozta stressz ellen Proteinek o szérumban o alacsony molekulatömegű komponensek szállítása, adhézió könnyítése Vitaminok o alapmédiumban o szerep a növekedésben és a proliferációban Glutamin o alapmédiumban o proteinek és ribonukleotidok szintézisének prekurzora 9
o légzési üzemanyag Nyomelemek o alapmédiumban Lipidek o néhány az alapmédiumban o szérumban is (szérum albumin szállítja őket) o energiatárolás, membránstruktúra kialakítása, transzpont- és jelölő rendszerek Antibiotikumok o fertőzések elkerülése érdekében o sokszor negatív befolyás Ezek alapján a tenyésztőmédium a következő összetevőkből áll: 1 3. ábra F Mint a fentiekből látható, a tenyésztőmédium szérum komponense rengeteg fontos anyagot tartalmaz a sejtek számára. 1 Forrás: http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/ 10
Funkciói összefoglalva 28 : biztosítania kell o hormonális faktorokat, amik stimulálják a sejtnövekedést és proliferációt, valamint előremozdítják a differenciálódást o transzport proteineket, amelyek szállítják a hormonokat, ásványokat és lipideket o lehorgonyzó és kiterjesztő faktorokat o stabilizáló és detoxikáló faktorokat ph biztosítás, proteáz inhíbiálás A tenyésztőmédium fejlesztése során az FBS, vagyis a magzati szarvasmarha szérum vált a legígéretesebb kiegészítővé, így jó eredményei alapján ez terjedt el legszélesebb körben. Használata azonban ellentmondásos. 2.2.1. Problémák az FBS használatával A problémákat kétféle módon lehet megközelíteni. Egyrészről beszélhetünk tudományos oldalról, ami az FBS állati eredetéből fakad. Ebből kiindulva ugyanis az összetétele erősen variábilis, sokszor magas az endotoxin-tartalma, immunválaszt válthat ki, máig nem azonosított komponenseket tartalmaz 28 és könnyen mikrobiológiai fertőzések forrása lehet. Utóbbi miatt az összegyűjtött szérum komoly ellenőrzési procedúrán megy keresztül, ami a végtermék árát jelentősen megnöveli. A másik problémát az etikusság kérdése jelenti. Mivel az FBS a legelterjedtebb kiegészítő az in vitro eukarióta kultúrák körében, ezért nagy mennyiségekben kell előállítani. Ez a szám évi körülbelül 500 000 liter, amihez több mint egy millió borjút kell leölni 3. Ez rengeteg állati áldozatot jelent és a mennyiség az in vitro módszerek (mint klónozás, genetikai módosítások) alkalmazásának fejlődése miatt növekedni fog az elkövetkező években. Fontos tehát a magzati borjú jóléte a vérvétel során, hiszen felmerül a fötális tudatosság kérdése 29. 11
A magzati vér gyűjtése különböző hús-előállítási folyamatok során történik, miután a méhet eltávolították a kizsigerelés fázisában a leölt tehénből. A készítés további lépéseit az alábbi ábra mutatja 30 : 4. ábra A fötális tudatosság lehetőségéről a vélemények megosztottak. Ha az állatnak már kialakult a tudata (agyi érettség), akkor az azt jelenti, hogy érez fájdalmat, képes szenvedni. Kísérletes módon sikerült kimutatni, hogy a magzat reagál a fájdalmas stimulációkra a vemhesség késői stádiumában 31. Mivel a vérvétel is ebbe az időszakba esik (nagyobb magzattöbb vér) ezért különböző előírások születtek arra, hogy megelőzzék az állatok szenvedését. Mindemellett a biomedicinában kedvelt módszer az állatok lecserélése, érvényesül a 3R (replace, reduce, refine) elve, vagyis a lecserélés, csökkentés és javítás 32. Ezért 2003-ban szerveztek egy konferenciát, annak megvitatására, hogyan lehetne csökkenteni az FBS használatát és korlátozni-, vagy megszüntetni az élő, még meg nem született borjúk szenvedését 28. 2009-ben Dániában ültek össze újra, ahol bemutatták, hogy lehetséges lehet állati termékek nélkül sejteket növeszteni. A kísérleteknek két irányvonala ismert: Emberi helyettesítők keresése Szérum-mentes kultúrák kifejlesztése 12
2.2.1.1. Humán alternatívák Az emberi vérből készült helyettesítők sok problémát ki tudnának küszöbölni, de néhány kellemetlenség továbbra is fennáll az alkalmazásukkor. Előnyök: o nincs állati eredetű vírusveszély o akár a beteg saját véréből is elő lehet állítani a szükséges mennyiséget nincs immunológiai probléma, megbetegítés veszélye o több kipróbált készítmény hatása összemérhető-, vagy akár jobb is volt, mint az FBS-é Hátrányok: o továbbra sem precízen definiált összetevők o immunreakció ritkán, de előfordulhat o humán betegségeket hordozhat Az emberi alternatívák magas trombocita-tartalommal rendelkező vérkészítmények. Ezt azért érdemes kiemelni, mert régóta ismert tény, hogy a trombociták, vagy más néven vérlemezkék nagyon jó növekedési faktor-források. Ezt a trombocita gélek klinikai tanulmányokban való vizsgálata során állapították meg, amikor is azt tapasztalták, hogy csökkentik a műtétekkel járó duzzadást és fájdalmat 33, gyorsítják a lágyszövet helyreállítását 34 és növelik a csontsejtek regenerációját 35. Ennek a magyarázata az, hogy a vérlemezkék szekretálnak egyfelől kemotaxisért és az extracelluláris mátrix alakulásáért felelős faktorokat, mint a PDGF (platelet-derived growth factor) és TGFβ-1 (transforming growth factor β-1) 36. A faktorok másik csoportja a hemosztázist, proliferációt és a sebgyógyulás újraalakulásos fázisát segíti elő: FGF (fibroblast growth factor) 37, IGF (insulin-like growth factor) 38, EGF (epidermal growth factor) 39 és VEGF (vascular endothelial growth factor) 40. A fent említett tulajdonságokból következtethetünk arra, hogy az emberi vérkészítmények alkalmasak lehetnek az FBS helyettesítésére. A továbbiakban kettő alternatívát szeretnék kiemeltem tárgyalni. A hpl-el, vagyis a humán trombocita lizátummal 2005-ben foglalkoztak először és különböző kísérletekben nagyon hatásosnak bizonyult. Ennek hátterében az előbb felsorolt, 13
trombociták által szekretált citokinek, növekedési faktorok állnak. Ezt a készítményt PRP-ből, vagyis trombocita-gazdag vérplazmából állítják elő, a következő lépésekben 30 : 5. ábra A másik készítmény a PRF (platelet-rich fibrin), vagyis trombocitában gazdag fibrin, amely nevéből az látszik, hogy itt a vérlemezkék kedvező tulajdonsága mellett a fibrin is jelen van, ami nem más, mint a fibrinogén aktivált alakja 41. Utóbbi egy oldható molekula, amely állandóan jelent van mind a vérplazmában, mind a trombociták α-granuláiban. Szerepe a vérlemezke-aggregáció a hemosztázis alatt, amikor is oldhatatlan fibrinné alakul. A PRF tulajdonképpen egy természetes fibrin mátrix, első fejlesztése Franciaországban történt, szájsebészeti alkalmazásban 42. Sok kísérlet történt az őssejtekkel való kapcsolatának kiderítésére is és azt tapasztalták, hogy elősegítette azok proliferációját és migrációját 43. A fibrin továbbá az angiogenezis, vagyis az új vérerek alakulásának természetes támogatója, valamint elősegíti a sebgyógyulást az epithel sejtek és a fibroblasztok mechanizmusának vezérlése által 44. Összefoglalva tehát rengeteg előnyös tulajdonsággal rendelkezik és az előállítása is igen egyszerű 45 : 14 6. ábra
A PRF izolációnál a vért alvadásgátlót nem tartalmazó vérvételi csőbe kell levenni, majd megfelelő időtartamú és fordulatszámú centrifugálás után azt tapasztaljuk, hogy a vér 3 különböző frakcióra válik szét: egy alsó, vörösvérsejteket tartalmazó (RBC, red blood cell)-; egy felső, trombocitában szegény plazmát tartalmazó (PPP, platelet-poor plasma)- és a közöttük elhelyezkedő, kocsonyás részre, ami nem más, mint a PRF. Mint az felső ábra jobb oldali képe is mutatja, ez csipesszel megfogható és kihúzható a csőből, ami megkönnyíti az izolálását. Médium-kiegészítőként még nem tesztelték ugyan a kocsonyás állaga miatt, de mivel az előbb említett, előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, ezért a kipróbálása mindenképpen indokolt. Jelen dolgozatom célja a kinyomkodása utána kapott ún. SPRF (serum from platelet-rich fibrin) vizsgálata, mint támogató-komponens. 2.2.1.2. Szérum-mentes médiumok Természetesen a legjobb megoldást az a tenyésztőmédium jelentené, amely nem tartalmaz semmilyen emberi, vagy állati eredetű összetevőt, de ennek a kifejlesztése még nem teljesen megoldott. Néhány cég ugyan már árul használatra kész termékeket, de ezek továbbra is tartalmaznak állati eredetű fehérjéket. Ha ezektől is meg tudnánk szabadítani a médiumot, akkor beszélhetnénk kémiailag definiált szérum-mentes médiumról 46. Ennek a megvalósítása érdekében rekombináns technológiával hoznák létre a kívánt növekedési faktorokat, de ez az eljárás igen drága. Az új terméknek a következő kritériumoknak kell továbbá megfelelni: könnyen elérhető standardizált összetevők tripszin-kompatibilitás regisztrált összetevők Vannak továbbá köztes technikák is, amelyek a sejttenyésztés elején még teljesen mértékben FBS-es médiumot használnak, majd szépen fokozatosan, mintegy hozzászoktatják a sejteket a szérum-mentes tápoldathoz 4. Az eddig piacra hozott médiumoknak létezik egy adatbázisa is, ahol körülbelül 450 különböző termék található, ám a hatásosságukról egyelőre szűkös információk állnak rendelkezésünkre 47. 15
3. Kísérletek és módszerek 3.1. Ötlet a kísérletek megvalósítására A kísérleteink célja az volt, hogy egy olyan vérkészítményt teszteljünk médiumkiegészítőként, amivel az irodalmak ilyen megközelítésben még nem foglalkoztak. Ez nem volt más, mint az SPRF vagyis trombocitában gazdag fibrinből nyert szérum, ami a kutatócsoport saját fejlesztése. A készítmény tulajdonképpen a PRF származéka, ugyanis az előállításából kapott zselés állagú enyvet egy tálcában kinyomkodjuk és így folyékony halmazállapotú termékhez jutunk, amely megkönnyíti a vele kapcsolatos további munkákat. Ez teszi lehetővé azt is, hogy kiegészítsük vele a sejttenyésztő-médiumot. Mint ahogy arra az irodalmi áttekintésben is kitértem, a PRF-nek bizonyítottan nagyon előnyös tulajdonságai ismeretesek az őssejtek feldúsítására, így ezek alapján az SPRF nagyon jó anyagnak tűnik. A kiindulási gondolat az volt, hogy a vérkészítmények azért alkalmasak megfelelő támogató anyagnak, mert akár a beteg saját véréből is elkészíthetőek, így nem igényelnek sem állati áldozatot, sem pedig drága technológiákat. Ez viszont felveti azt a kérdést, hogy a donor kora nem befolyásolja-e egyrészt az őssejtjei, másrészt a vérszérumának lehetőségeit a hatékony gyógyításra. A humán trombocita lizátum kapcsán leírtak ugyanis egy olyan megfigyelést, hogy ennek a stimulációs hatása az MSC-kre korfüggő, ám a pontos mechanizmus még nem teljesen tisztázott 48. Másrészről arról sem szabad megfeledkezni, hogy az idő előrehaladtával mind az MSC-k száma, mind pedig az aktivitásuk csökkenni kezd 49. Hogy ezt a két hatást vizsgálni tudjuk fiatal és idősebb donoroktól is tenyésztettünk őssejteket és mindkét korcsoportú sejteket kezeltünk idős és fiatal donortól származó SPRF-et tartalmazó médiumokkal. Azért, hogy ezek hatása összemérhető lehessen az FBS-ével, mindkét sejttípushoz tartozott egy-egy kontroll (FBS-t tartalmazó) médiumot kapó kategória is. Mindkét támogatóanyagot 10%-os koncentrációban alkalmaztuk. A mérések úgy zajlottak, hogy a két csoport sejtjeit 24-lyukú tálcákon, hét napig növesztettem az adott médiumokban és mindegyik nap mértem a sejtek életképességét MTT esszé segítségével. Az adatokat végül összesítettem és kiértékeltem. 16
3.2. Sejtkultúra fenntartása A munkám során HBMSC-kel, azaz humán származású, csontvelő-eredetű mezenchimális őssejtekkel foglalkoztam. A sejtekkel kapcsolatos tevékenységek fontos alapköve a steril körülmények biztosítása, hiszen a levegőben szennyeződések és spórák találhatóak, melyek negatívan befolyásolhatják a sejtek életét és így a kísérletek kimenetelét. 3.2.1. Őssejtek általános ellátása Az őssejteket ideális összetételű őssejtmédiumot tartalmazó Petri csészékben inkubáltattam a növesztési folyamat során. Az inkubáció 37 C-on, 5%-os CO 2 koncentráció mellett történt. Az MSC-ket mikroszkóp alatt vizsgálva nyúlványosan letapadt sejteket figyelhetünk meg, melyek a csésze alján egy monolayert alkotnak 50 : 7. ábra A sejtekkel kapcsolatosan 3 rutinművelet különböztethető meg 51. Etetés o őssejtek friss médiummal való ellátása 17
o a sejtek növekedése során a tápközegből a szükséges faktorok elfogynak, így ezeket pótolni kell Szétosztás o más néven passzálás o akkor végezzük, amikor a sejtek száma a kultúrában túlnövi a csésze kapacitását Fagyasztás o sejtekkel való munka ideiglenes felfüggesztése A feladataim során az első két műveletet láttam el. 3.2.1.1. Őssejt médium készítése, sejtek táplálása Az etetésnél az első feladat a megfelelő őssejt médium elkészítése volt. Az ehhez szükséges anyagok: 1 db 500 ml DMEM (with 1 g/l glucose, with L-glutamine) médium o 1g/l glükóz tartalommal o alapmédium, amelyet még ki kell egészíteni további szükséges anyagokkal 50 ml FBS (Fetal Bovine Serum) o fontos növekedési faktorokat tartalmaz o 10%-os koncentrációban tartalmazza a tenyésztőmédium 5 ml PEST (Penicillin-Streptomycin) o antibiotikumkeverék Penicillin: 100 U/ml Streptomycin: 100 µg/ml o 1%-os koncentrációban tartalmazza a tenyésztőmédium A hőérzékeny összetevők miatt a médiumot +4 C-on, a szérumot és az antibiotikum keveréket pedig -20 C-on tároljuk. Az elkészítés menete a következő: az összetevőket felmelegítettem vízfürdőben, az alapmédium felbontása után abból 50 ml-t kipipettáztam, majd helyette 50 ml FBS-t és 5 ml PEST-t tettem bele. Az így elkészült őssejt médiumot az előbb leírtak alapján, előzetes feliratozás után a +4 C-os hűtőszekrénybe raktam. 18
A sejtek etetése előtt fontos, hogy a médiumot vízfürdőben felmelegítsük 37 C-ra, hiszen ez a sejtek számára ideális hőfok, ennél alacsonyabb hőmérsékletű anyaggal sokkolnánk őket, ami negatívan befolyásolná a növekedésüket. A sejtek táplálása heti háromszor történik. Az elhasznált médiumot biológiai fülke alatt kell kicserélni, ami egy olyan berendezés, amely a bejáratánál laminárisan felfelé levegőt áramoltat, ezzel elválasztja egymástól a fülke belső terét a környezettől és így segíti a kontamináció-mentes munkát. A sejteken lévő elhasznált oldatot pipettor segítségével távolítottam el és szintén ezzel helyeztem rájuk 8-10 ml friss médiumot. 3.2.1.2. Passzálás A passzálás lényege az, hogy ha a sejtek benövik a csésze alját, akkor szét kell őket oszlatni több másik csészébe, különben egy idő után a túl nagy szám miatt pusztulni kezdenek, vagy nem kedvező sejtvonalakba differenciálódnak. A folyamat első lépésében fülke alatt eltávolítottam a sejtekről a médiumot és mostam őket kétszer 5 ml PBS-el (phosphate buffered saline), ami egy fiziológiás oldat. Mivel a HBMSC-k a csésze aljára vannak letapadva, ezért a következő lépésben fel kell őket szedni onnan, ami egy tripszin nevű fehérjebontó enzim segítségével történik. Ez a sejtek letapadó nyúlványait kezdi el emészteni, ennek következtében pedig a HBMSC-k oldatba kerülnek. A PBS eltávolítása után tehát 1 ml, 10%-os töménységű tripszint pipettáztam az adott csészébe, amit ezután inkubátorba helyeztem azért, mert az enzim működésének ideális hőmérséklete 37 C. Az edényt ezután 2 percenként mikroszkóp alatt vizsgálva figyeltem a sejteket. Körülbelül 4-5 perc után azt tapasztaltam, hogy a sejtek túlnyomó többsége felgömbölyödve úszik az enzimes oldatban, tehát a folyamat leállítható. Ez 6 ml őssejt médiummal, mint szubsztrát-felesleggel történik. A leállítást követően a csésze tartalmát centrifugacsőbe pipettáztam és centrifugáltam 6 percig 1400 rpm fordulatszámon. Ezután a csőből leöntöttem a felülúszót és a letapadt sejthalmazt kiegészítettem 1 ml-re őssejt médiummal, majd szuszpendáltam az oldatot. Közben 2-3 Petri csészét előkészítettem (feliratozás, 10 ml őssejt médiummal való feltöltés) és a cső tartalmát eloszlatva megfelelő részletekbe, a sejtes oldatot beléjük pipettáztam. Ezután a csészéket az inkubátorba helyeztem és az etetésüket a fentebb ismertetett módon végeztem. 19
3.2. Vérkészítmény tesztelése idős és fiatal donorból származő őssejtvonalakon A fenti pontokban említett tevékenységek tehát az őssejtek általános ellátásával kapcsolatosak. Ezeket a műveleteket végeztem a dúsítási folyamat közben is. A sejteket a Semmelweis Egyetem Ortopédiai Klinikától kaptuk, csontvelő formájában. Ezt közvetlenül a műtét után a laborba vittük és ott Petri csészékbe helyeztük, majd őssejt-médiumban inkubáltattuk. Kétnaponta ezeket is etetni, valamint mosni kellett, egészen addig, amíg a csésze alját szépen be nem nőtték a sejtek. Hogy a sejtszám biztosan elegendő legyen, ezért passzáltam mind az idős, mind a fiatal donortól származó sejtvonalat. Az egyszerűség kedvéért innentől szeretnék úgy hivatkozni rájuk, hogy idős, illetve fiatal őssejtek, habár ez az elnevezés így pontatlan, de a használat szempontjából praktikus. A kísérleteket végül P2-es fiatal, valamint P3-as idős sejtekkel végeztem el. Hat darab 24-lyukú tálcára volt szükségem, hiszen kétféle őssejtünk van (idős-fiatal), melyeket három-három különböző médiummal kezeltem, összefoglalva tehát: Kontroll médiumos kezelés 3 db fiatal sejtes tálca Fiatal SPRF-es kezelés Idős SPRF-es kezelés 6 db 24-lyukú tálca Kontroll médiumos kezelés 3 db idős sejtes tálca Fiatal SPRF-es kezelés Idős SPRF-es kezelés 8. ábra A kísérletek eredetileg úgy zajlottak volna, hogy 10.000 sejtet teszek mindegyik használni kívánt lyukba és egy napig hagyom a sejteket letapadni. Másnap, a kísérleti időben vett 1. napon mindegyik tálcáról megmértem volna 3 darab lyukat, amelyek az MTT esszé hatására 20
elvesztik az életképességüket, így ezekkel többet nem kell foglalkozni. A mérések mindennap, médiumcserék pedig minden másnap történtek volna, tehát a 2. napon van esszé és csere is, a többi napon pedig ennek megfelelően. A könnyebb vizualizáció kedvéért egy időskálán is bemutatom az elképzelést: 9. ábra Ezen a protokollon végül sejthiány miatt változtatni kellett egy kicsit. 3.2.1. Tenyésztőmédiumok elkészítése Az elkészítéshez először ki kellett számolni, hogy mekkora térfogatú médiumokra van szükség készítményenként. A számolást a fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médiummal szeretném bemutatni, a másik vérkészítményből ugyanennyire volt szükség. Két olyan 24-lyukú tálcánk volt, amelyikhez fiatal donortól származó SPRF-es médiumot kell adni: egy fiatal őssejtes és egy idős őssejtes csoport. Hét napi mérésünk van, 3 lyuk/mérési alkalom felbontásban, és egy lyukba 1 ml médium kerül, tehát csak a feltöltésre kell 2x7x3 ml, azaz 42 ml. Nem szabad megfeledkezni továbbá a médimcserékről sem, amelyek kétnaponta történnek. Mivel a már lemért lyukakban a sejteket az életképességet mérő eljárás elpusztítja, azokkal már nem kell számolni, így az első cserénél (2. nap) 2x15 ml kell, a 4. napon 2x9 ml, az 6. egyben utolsó cserés napon már csak 2x3 ml. Ez összesen 52 ml. Összefoglalva: 2(tálca) x 7(mérési nap) x 3(lyuk/mérés)ml + 54 ml (médiumcsere) = 96 ml tenyésztőmédium 21
Mivel úgy gondoltuk, hogy inkább ráhagyással, de természetesen az arányok megtartásával fogunk dolgozni (10% szérum, 1% antibiotikum), ezért a végső tenyésztőmédium-összetétel a következőképpen alakult: 100 ml alapmédium 11,1 ml SPRF 1,11 ml PEST A vérkészítmények elkészítésének első lépése véradó donorok keresése volt. A kritériumunk az volt, hogy az idős donor legyen 60 év feletti, a fiatal pedig 25 alatti, egészséges ember. Miután találtunk megfelelő jelentkezőket, behívtuk őket vérvételre. Általánosságban az igaz, hogy 1 fiolányi (6ml) vérből körülbelül 1 ml SPRF nyerhető, ezért mindkét donorunktól 11-11 fiola vért vettünk le alvadásgátlót nem tartalmazó csövekbe és ezeket gyorsan (hogy ne induljon meg az alvadás) lecentrifugáltam 5 percig 3000 rpm fordulaton. Miután ez megtörtént, a keletkezett fibrin csomót kihúztam mindegyik csőből és attól függően, hogy az idős, vagy a fiatal donor véréből készült, két külön csészébe tettem, majd kinyomkodtam a tartalmukat. Ezután feliratoztam két darab zárható, 0.5 literes üvegedényt, majd mindkettőbe belepipettáztam 100-100 ml alapmédiumot és a megfelelő SPRF-ből 11,1-11,1 ml-t, végül pedig az antibiotikumot. Kontroll médiumot külön nem készítettünk, hiszen ez megegyezik az általános sejttenyésztő médiummal, ami mindig rendelkezésünkre állt a sejtek táplálása miatt. A két edényt a használatuk után mindig hűtőszekrénybe tettem +4 C-ra, ahol a legjobb az eltarthatóságuk. 3.2.2. Sejtek számlálása és tálcára tétele A következő művelet a sejtek tálcára való kitétele volt. Mint azt illusztráltam is, sejtvonalanként 3-3 tálcát használtam. Az elgondolás az volt, hogy a legmegfelelőbb sejtszám 10.000 sejt/lyuk lesz, arra alapozva, hogy ez a szám nem fogja még teljesen benőni a rendelkezésre álló terek a 7. napra, ezért elviekben azt fogjuk tapasztalni, hogy a sejtszám szép fokozatosan, de reményeink szerint médiumoktól eltérő mértékben nő. 22
A következő kérdés tehát az, hogy hány darab sejtre van szükségünk sejtvonalanként. 3-3 csészére tesszük ki a sejteket, csészénként 21 lyukat használva (7 mérés x 3 lyuk/mérés), tehát típusonként 3x21x10.000 sejtre van szükségünk, ami 630.000 sejt/vonal. A sejtszám meghatározása tulajdonképpen a passzálás egy későbbi lépésében történik, amikor a lecentrifugált sejtes oldat felülúszóját leöntve a letapadt sejtcsomót ki kell egészíteni 1 ml-re őssejt médiummal. A számlálást Bürker kamrával végeztem, ami a számlálókamrák csoportjába tartozik. Ezek tulajdonképpen különlegesen kiképzett tárgylemezek. Az általunk használt egy vastag üveglemezből és egy vékonyabb fedőlemezből állt, amelyeket egymásra helyezve, a közöttük lévő rés pontosan 0,1 mm vastagságú. Az üveglemezen ismert távolságú beosztások találhatóak, így ezek ismeretében kiszámolhatóvá válik az adott térfogategységben lévő sejtek száma. A műveletet úgy végeztem el, hogy a sejteket tartalmazó oldatból kipipettáztam 10 μl-t egy eppendorf csőbe, majd kiegészítettem 10 μl tripán-kék festékkel, melynek segítségével a sejtek a mikroszkóp alatt jól láthatóvá válnak. Az így kapott keveréket jól összeszuszpendáltam és 10 μl-t egyenletesen a fedőlemez alá fecskendeztem. A festék rögtön megfesti a sejteket, így a mikroszkópos vizsgálat azonnal kezdhető. A nagyított kamrára nézve négyzetes hálózatot figyelhetünk meg. A feladat az, hogy két egymás követő sorba és további egy négyzetben megszámoljuk a sejteket. Ezt a műveletet a tárgylemez másik két helyén is elvégezzük. Az így kapott három számnak vesszük az átlagát, és ha ezt a számot a hígítás és a kamraparaméterek függvényében megszorozzuk 20 000-el, akkor megkapjuk, hogy mennyi sejtünk van az elkészített 1 ml oldatban és így kiszámolhatóvá válik, hogy az általunk szükséges mennyiség mekkora térfogatban van jelen. 23
A fiatal sejteket felszedve és megszámolva már egy Petri csészében megvolt az elegendő mennyiség, szám szerint 640.000 sejt. Ez volt benne 1000 µl sejtszuszpenzióban, tehát egyszerű aránypárral számolva azt kaptam, hogy a kívánt 10.000 sejt 15,6 µl oldatban lesz jelen. Ennek megfelelően a 3x21 lyukat feltöltöttem 1-1 ml fiatal SPRF-et tartalmazó médiummal és ebbe pipettáztam bele lyukanként 15,6 µl-t a sejtoldatos centrifugacsőből. A fiatal sejteket tartalmazó 3 csoport tehát a következőképpen nézett ki: Fiatal donortól származó MSC-k Fiatal SPRF-es médium 1. nap 1. nap 1. nap 2. nap 2. nap 2. Nap Öreg SPRF-es médium 1. nap 1. nap 1. nap 2. nap 2. nap 2. Nap 3. nap 3. nap 3.nap 4. nap 4. nap 4. Nap 3. nap 3. nap 3.nap 4. nap 4. nap 4. Nap 5. nap 5. nap 5. nap 6. nap 6. nap 6. Nap 5. nap 5. nap 5. nap 6. nap 6. nap 6. Nap 7. nap 7. nap 7. nap 7. nap 7. nap 7. nap Kontroll médium 1. nap 1. nap 1. nap 2. nap 2. nap 2. Nap 3. nap 3. nap 3.nap 4. nap 4. nap 4. Nap 5. nap 5. nap 5. nap 6. nap 6. nap 6. Nap 7. nap 7. nap 7. nap 10. ábra 24
Az idős sejteknél sajnos nem tapasztaltam ilyen nagy mennyiségeket, ami valószínűleg azzal magyarázható, hogy korral ezek aktivitása és proliferációs képessége csökkent. Az összes Petri csészét felhasználva is csak 260.000 sejtet kaptam, ezért itt módosítani kellett a kísérleti protokollon. Úgy gondoltuk, hogy csak 2 lyukat vizsgálunk egy tálcáról mérésenként és ezeket nem naponta, hanem csak minden másnap mérjük. Tehát ebből végső soron az jött ki, hogy egy tálcán csak 8 lyukat használtunk. Habár ez rontotta a mérésünk megbízhatóságát, ennek ellenére úgy gondoltuk, hogy valamennyi használható információval így is gazdagabbak leszünk a kísérlet során. Így tehát a tálcák elrendezése a következő: Idős donortól származó MSC-k Fiatal SPRF-es médium 1. nap 1. nap 3. nap 3. nap 5. nap 5. nap Öreg SPRF-es médium 1. nap 1. nap 3. nap 3. nap 5. nap 5. nap 7. nap 7. nap 7. nap 7. nap Kontroll médium 1. nap 1. nap 3. nap 3. nap 5. nap 5. nap 7. nap 7. nap 11. ábra 3.2.3. Az életképesség mérése Az MTT esszé egy olyan elemzési forma, amely jelen kísérletben arra szolgált, hogy a különböző médiumokkal kezelt sejtcsoportokban megadja az élő sejtek mennyiségét. A mérés egy tetrazónium són, pontosabban a halványsárga 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromidon alapszik, amit szubsztrátként az élő sejtek mitokondriális enzimei át tudnak 25
alakítani sötétkék formazánná 52. Mivel ez kristály állapotú, ezért oldatba kell vinni, amihez izopropanolt használnak 53. A keletkezett formazán mennyisége pedig széles határok között egyenesen arányos az élő sejtszámmal. Ez az elemzés az életképesség mellett alkalmas a proliferáció és az aktiváció mérésére is 54. Az MTT oldatot előzetesen készítjük el úgy, hogy a koncentrációja 5 mg/ml legyen. Az MTT sót tartalmazó üvegcséből tehát analitikai mérlegen kimértem 0,05 g-ot és ehhez a mennyiséghez 10 ml PBS-t pipettáztam. Az oldatot vortex segítségével homogenizáltam, majd 1-1 ml-es részletekben pipettáztam szét eppendorf csövekbe, melyeket ezután a -20 Cos mélyhűtőbe helyeztem. A kísérlet során az elemzési lépés úgy történt, hogy az adott mérési napokon elkészítettem az esszéhez szükséges oldatot aszerint, hogy az MTT: őssejt médium aránynak 1: 9-nek kell lennie. Például a 3. mérési napon, amikor mértem 3 fiatal őssejtes tálcáról 3-3 lyukat és 3 idős őssejtesről 2-2-t, összesen 3x3+3x2 ml, azaz 15 ml MTT esszére volt szükségem. Az aránynak megfelelően 1500 µl MTT oldatot pipettáztam 13 500 µl őssejt-médiumban. Ehhez kontrollmédiumot használtam, nem foglalkoztam azzal, hogy a megfelelő SPRF-et tartalmazó legyen, mert úgy gondoltam, hogy ez plusz információt nem adna a kísérlethez és így kevesebb vért is elegendő volt venni a donoroktól. A mérni kívánt lyukakból ezután eltávolítottam a médiumokat, majd a helyükbe 1-1 ml MTT esszét tettem. Mivel az enzimes reakció 37 C-on valósul meg és a tálca többi részén még érzékeny, növeszteni kívánt sejtek vannak, amelyek nem bírják a tartós szobahőmérsékletet, ezért a tálcákat 1 órára inkubátorba helyeztem. Az 1 óra letelte után az oldatot kipipettáztam a lyukakból és helyette 1-1 ml izopropanolt helyeztem beléjük, majd további egy óráig inkubáltattam őket. Ezután spektrofotométer segítségével mértem az egyes lyukak abszorbanciáját 2 hullámhosszon: 570 és 690 nm-en. Utóbbin azért, hogy a háttér zavarásából adódó hiba kiküszöbölődjön. 26
abszorbancia 4. Eredmények és értékelésük A sejtéletképesség méréséből származó eredményeket a kísérlet lezajlása után összegyűjtöttük és kiértékeltük a GraphPad nevű program segítségével. Az eredményeket a következő, kapott ábrákon szeretném bemutatni. 4.1. A médiumok hatása fiatal donorból izolált sejtekre Eredmények elemzése a fiatal sejtes csoportoknál: Sejtszám növekedés helyett az életképesség csökkenést tapasztaltuk Ennek ellenére a fiatal SPRF szinte végig felülmúlta a többit Az idős donor SPRF-ével kiegészített médium általánosságban szintén jobbnak bizonyult a kontroll médiuménál o Ahol nem teljesített jobban, ott is összemérhető volt a hatása az FBS-tartalmú médiummal 27
Az előző három pontbeli megfigyelésnek ellentmond a 6. nap, amikor a kontroll médiumban mértük a legjobb életképességet és meglepő módon a fiatal SPRF-ben a legrosszabbat 4.2. A médiumok hatása idős donorból izolált sejtekre Eredmények elemzése az idős sejtes csoporoknál: Itt szintén folyamatos sejtszám-csökkenést tapasztaltam A fiatal donor SPRF-ét tartalmazó médium mind a négy mérési napon jobb eredményt hozott a másik kettőnél Az idős SPRF az esetek felében nyújtott rosszabb teljesítményt a kontrollnál, de ezeknél sem igazán számottevő mértékben 28
4.3. Az eredmények értékelése Természetesen az, hogy mindkét csoportnál fokozatos sejtpusztulást figyeltünk meg, nem jó. Ennek sokféle oka lehet. Az egyik felmerülő gondolat az, hogy nem volt megfelelő a kiinduláshoz használt sejtszám (10.000 sejt/lyuk), ezért a sejtek tulajdonképpen már az első napon telenőtték a csésze alját és ezután helyhiány miatt pusztulni kezdtek. Másrészről az is előfordulhat, hogy kontamináció lépett fel az inkubátorban, ami megfertőzte a vizsgált sejteket is. Sajnos ebben az időszakban többször tapasztaltunk hasonlókat egyéb sejttenyészetekben is. A harmadik lehetséges magyarázat az, hogy az MTT esszé hatására kezdtek el pusztulni a sejtek, esetleg az egy órás izopropanolos inkubálás során az elpárolgó propanol beleoldódott a mérésre még nem került lyukakba. Mindenesetre az mindenképpen pozitív eredmény, hogy a kontroll médiumnál is tapasztaltam az életképesség-csökkenést, ráadásul általában jóval nagyobb mértékben, mint az SPRF-et tartalmazó médiumoknál. Mint az várható volt, a legjobb teljesítményt a fiatal donorból származó SPRF-et tartalmzó médium produkálta mindkét sejtcsoportnál. Tehát beigazolódni látszik az a lehetőség, hogy a vérben a különböző növekedési faktorok és más őssejteket segítő molekulák száma, illetve aktivitása a korral valamilyen mértékben csökkent. Az látszik továbbá az eredményekből, hogy a két őssejtcsoport életképessége egészen más értékekről indult. Míg a fiatal sejteknél a maximális abszorbancia mindössze 0.065 volt, addig az öregnél körülbelül 0.125. A kísérlet tehát nem igazolta azt, hogy az idősebb emberekből származó őssejtek proliferációja rosszabb lenne a fiatalokénál, sőt, ezzel ellentétes hatást mutatott. 29
5. A folytatás Mivel a kísérleti eredményeink folyamatos sejtszámcsökkenést mutattak be növekedés helyett, ezért ezt a méréssorozatot mindenképpen meg kell ismételni. A kapott adatok azonban azt mutatják, hogy ez nagyon jó kiindulási pont lehet egy új tenyésztőközeg fejlesztéséhez, hiszen az SPRF-es médiumok többségben felülmúlták a kontrollt és a legrosszabb esetben is ahhoz nagyon közeli értéket mutattak. Amit el kell végezni egy következő sorozat előtt, az egy arra irányuló kontrollkísérlet, hogy pontosan mennyi sejtre van szükség egy lyukban, mert a használt mennyiség (10.000 sejt) felvetett kérdéseket a kimenettel kapcsolatban. Érdemes lenne tehát egy olyan kísérletet csinálni, amelyben különböző mennyiségű sejteket teszünk ki 1-1 tálcára és rájuk a megszokott tenyésztőmédiumot téve vizsgáljuk egy hétig minden nap a sejtek mennyiségét. Az is könnyen előfordulhat, hogy nem is szükséges ilyen hosszú időtartamig vizsgálni a sejtek alakulását, hiszen a rendelkezésükre álló felület olyan kicsi, hogy még nagyon kevés sejt is gyorsan benövi. Ha ennél az ideális-sejtszám meghatározó kísérletnél is azt tapasztaljuk, hogy az összes tálcában csökken az idő függvényében a sejtek száma, akkor az azt jelenti, hogy az életképesség meghatározására használt MTT elemzési eljárás károsan befolyásolja a mérés alá még nem vetett sejtek életét. Ezt úgy tudjuk majd kiküszöbölni, ha a különböző mérési csoportokat különböző tálcákon kezeljük. Habár ez feleslegesen sok eszközt jelent (hiszen így egy 24-lyukú tálcáról csak 3 lyukat használunk ki), de teljesen megóvja a többi sejtet a módszer negatív befolyásolásától. 30
6. Összefoglalás A TDK dolgozatom célja az volt, hogy keressek egy megfelelő alternatívát napjaink legelterjedtebb őssejtmédium-kiegészítője, az FBS helyett. Erre azért van szükség, mert a használatát a tudomány erősen vitatja. Egyrészt az állati eredetéből adódóan potenciális fertőzések forrása lehet, valamint mivel az összetétele változékony, így a kísérletek kimenetelét is különféleképpen befolyásolhatja. A másik problémacsoport szintén a származásából ered, méghozzá azért, mert az előállítása rengeteg állat életébe kerül. Az általam vizsgált anyag egy emberi vérkészítmény, az SPRF volt. Erre azért esett a választás, mert a géles formáját, a PRF-et már nagyon sok tanulmány bemutatta, mint potenciális forrás az őssejtek növekedéséhez, osztódásához. A másik nagyon pozitív érv mellette az, hogy őssejterápiáknál a beteg saját véréből elő lehetne állítani egy megfelelő közeget, hogy az előzetesen kinyert sejtmennyiséget feldúsítsuk a terápiás mennyiségre, ami ezután visszaültethető lenne. A kísérletsorozat úgy zajlott, hogy idős és fiatal donortól is tenyésztettem sejteket, majd mindkét sejttípust kezeltem 3-3 különböző tenyésztőmédiummal: idős embertől származó SPRF-et, fiatal emberből származó SPRF-et és FBS-t, mint kiegészítőt tartalmazóval. Ezt az magyarázza, hogy megfigyelések alapján az idősebb vonalból származó őssejtek vesztenek a proliferációjuk sebességéből és ez a vér növekedési faktor mennyiségére is igaz lehet. Így hát az előbb leírt hat csoportot egy hétig növesztettem a megfelelő médiumban és mindennap mértem a sejtéletképességüket MTT esszé segítségével. Az eredmények bizakodásra adnak okot, ám nem tökéletesek. A fiatal donor véréből készült SPRF mindegyik csoportban általánosan a legjobb eredményt produkálta és az idős donoré is elérte, vagy sokszor meg is haladta az FBS-sel kapott értékeket. A következő lépés az alkalmazandó sejtmennyiség pontos kikísérletezése kontroll médiumban, majd ezután a kapott értékkel a kísérletsorozat megismétlése. 31