BIOFIZIKA 2012 11 12 Metodika- 2 Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet liliom@enzim.hu
A biofizika előadások temakkája 1. 09-03 Biofizika: fizikai szemlélet, modellalkotás, biometria 2. 09-10 SZÜNET 3. 09-17 Az érzékelés biofizikája 4. 09-24 Mikrostruktúrák 5. 10-01 Zárthelyi dolgozat 1 6. 10-08 Sejtmembránok, lipid- fehérje kölcsönhatások 7. 10-15 Membránpotenciál, transzport biológiai membránokban 8. 10-27 Jelátvitel 9. 10-29 Zárthelyi dolgozat 2 10. 11-05 Metodika- 1: Hagyományos és nagyfelbontású mikroszkópia 11. 11-12 Metodika- 2: FRET, TIRF, SPR, QC 12. 11-19 Metodika- 3 13. 11-26 Metodika- 4 14. 12-03 Zárthelyi dolgozat 3 Pótzárthelyi - 2012. 12. 11. 10h- 12h 2
STED mikroszkópia felbontóképessége Synaptotagmin (balra) és synaptophysin (jobbra) fehérjék lokalizációja endoszómákon. Immunfestést követő STED mikroszkópos felvételek további felbontás- javítása lehetséges lineáris dekonvolúcióval (Wiener filter). Legjobb elért felbontás a vizsgált fehérjétől függően kb 20-25 nm! 3
MulKkolor PALM/STORM mikroszkópia Hat megfelelően választom fénykapcsolható festékpárral (a hosszabb hullámhosszon emimáló festék csak a rövidebb hullámhosszú párja általi gerjesztés hatására lesz fluoreszcens) streptavidint jelölve bizonyítomák, hogy a hatszoros együmes jelölés mérhető diffrakciós limit alap felbontással. 4
Színkódolt nanorészecskék egyedi molekulák detektálása A karboxil- módosítom nanorészecskéket egy flexibilis linkeren keresztül komplementer vagy random oligo- nukleokdokhoz kötömék. 5
Színkódolt nanorészecskék egyedi molekulák detektálása A DAOPHOT asztrofizikai fotometriai programot (amit zsúfolt csillaghalmazok térben közeli csillagainak azonosítására fejlesztemek ki) sikeresen alkalmazták az összetartozó nanorészecskék nagysebességű automakkus azonosítására. 6
Fluoreszcens festékek Néhány fluoreszcens alapmolekula kémiai módosításaival lefedték a teljes UV látható infra spektrumot. (példa: Alexa Fluor sorozat ) /The Molecular Probes Handbook/ Funkcionalizált (reakcióképes) és különböző hordozókhoz konjugált változatok sokasága kapható 7
Fluoreszcens fehérjék GFP GFP (Aequorea) származékok az Aequorea victoria csendes- óceáni medúzából izolálták DsRed (vörös korall, Anthozoa) származékok 8
Fluoreszcens fehérje palema GFP 9
Fluoreszcens fehérje palema A San Diego beach scene drawn with an eight color paleme of bacterial colonies expressing fluorescent proteins derived from GFP and the red- fluorescent coral protein dsred. The colors include BFP, mtfp1, Emerald, Citrine, morange, mapple, mcherry and mgrape. (2006) 10
Fluoreszcens kvantumpömyök (QD) Félvezető anyagban elektron- lyuk vezetőpárt hozunk létre, amelyet geometriai kényszerekkel szűk térrészbe zárunk (confinement). Az így csapdázom exciton energiaszintje a csapda méretével fordítoman arányos. A leggyakoribb a kadmium/szelenium QD mag, amelyet ZnS köpeny vesz körül, de már sokféle anyagból lehet QD- t készíteni, a legújabb alapanyag a grafén (a nehézfémek használata sok országban Kltom). 11
Fluoreszcens kvantumpömyök (QD) A gerjesztési spektrumok jól áyednek kb 400 nm- ig, tehát lehetséges egy hullámhosszon egy egész sorozat kvantumpömyöt gerjeszteni = színkódolt mulkplex alkalmazások! A kvantumpö,yök 1-2 nagyságrenddel foto- stabilabbak és világosabbak a hagyományos fluoreszcens festékeknél és fehérjéknél!!! 12
Kvantumpömyök mint nano- eszközök biolumineszcens gerjesztés bio- kompa6bilis bevonatok (PEG) és funkciós csoportok, jelölések nem- op6kai képalkotáshoz, stb... A kvantumpömyök a fluoreszcencia spektroszkópiai és mikroszkópiai alkalmazásokon túl funkcionalizált nanorészecskék formájában szinte bármilyen jelölésre vagy célbajumatásra használhatók (komoly távlatok a rák diagnoszkkájában és gyógyításában)... 13
FRET Förster/Fluorescence Resonance Energy Transfer mikroszkópia Megfelelő térközelség, orientáció és spektrális áyedés esetén a sugárzásmentes energiaátadás hatékonysága = 1/(1 + (r/ro) 6 ) 14
FRET mikroszkópia Biofizika, 2012, Liliom Károly 15
TIRF Total Internal ReflecKon Fluorescence 16
TIRF mikroszkópia 17
TIRF mikroszkópia 18
TIRF mikroszkópia 19
TIRF mikroszkópia 20
Mikroszkópia Fluoreszcens technikák (FRET, TIRF) Kölcsönhatások követése 21