V. A MIKROSZKÓP. FÉNYMIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE ÉS MŐKÖDÉSE Minden olyan optikai eszközt, amely arra szolgál, hogy a tiszta látás távolságán belül megnövelje a látószöget abból a célból, hogy a szabad szemmel nem látható részleteket az emberi szem számára láthatóvá tegye, nagyítónak nevezzük. A látószög az a szög, amely alatt a szemlélt tárgy szabad szemmel történı szemlélés esetén látszik. A mikroorganizmusok világának megismerésében alapvetı szerep jutott a mikroszkópnak. A mikroszkóp elıdje az egyetlen lencsébıl álló, rövid gyújtótávolságú nagyító (lupe), melynek segítségével Antonie van Leeuwenhoek holland kereskedı az 1670es évek végétıl már egysejtőek, hímivarsejtek, vörösvérsejtek megfigyelésérıl számol be, és a megfigyelt rendszerek igen jó ábrázolását is megadja. A mikroszkóp összetett nagyítórendszer, amely két győjtılencse-rendszer segítségével kismérető tárgyak jelentısen nagyított, fordított állású látszólagos képét állítja elı. Történelmileg a csillagászati távcsıbıl alakult ki. Minden mikroszkóp értéke elsısorban a nagyításától és a felbontóképességétıl függ. A nagyítás mértéke a megfigyelt tárgy egyes részeinek lineáris növekedése, a felbontóképesség pedig az a szög, amely alatt két különálló pontot még külön-pontként érzékelünk. Az emberi szem felbontóképességének határa egy ívperc (1'). A látószög a tárgynak szemünkhöz való közelítésével növelhetı, ennek azonban határt szab az a tény, hogy a tiszta látás távolságán (250 mm) belül szemünk már nem lát élesen. Ezért van szükség olyan optikai eszközre, amely a látószöget növeli. A mikroszkóp felbontóképességének meghatározása Ernst Karl Abbe német fizikus (1840-1905) nevéhez főzıdik. Bármilyen tökéletesen csiszolt lencse esetén is a fény hullámtermészete miatt a lencse befogadónyílásán fényelhajlás lép fel, aminek következtében egy pontszerő tárgy képe nem pontszerő lesz, helyette egy kis fénylı korongot kapunk. Mivel ezek a kis korongok átfedik egymást, megakadályozzák, hogy tetszés szerinti finomságú struktúrát észlelni tudjunk. Az Abbe-törvény értelmében a felbontóképesség az alábbi képlettel számítható ki: λ d=0,61 n sin α d: felbontóképesség λ: a tárgyat megvilágító fény hullámhossza n: a tárgy és a lencse közötti közeg törésmutatója a: a tárgyról az objektív frontlencséjébe még éppen bejutó fénysugár és az optikai tengely által bezárt szög (nyílásszög fele) A képlet alapján belátható, hogy adott megvilágítás esetén a felbontóképesség a numerikus apertúra (n*sin α) értékétıl függ. Minél nagyobb a numerikus apertúra, annál kisebb az a távolság, amely két, a szemünk által külön érzékelhetı pont között van. A numerikus apertúra tehát növelhetı egyrészt a közeg törésmutatójának növelésével, másrészt a nyílásszög növelésével. Túlzott nagyítást eredményezı lencsekombinációknál a feloldóképesség nem javul, un. holt nagyítást kapunk.
*** l. ábra: A mikroszkóp felépítése A fénymikroszkóp leglényegesebb része az optikai rendszer, amely az alábbi fıbb egységekbıl áll: fényforrás tükör kondenzor objektívek (tárgylencse-rendszerek) okulárok (szemlencse-rendszerek) Az optikai rendszer hibátlan mőködését a mechanikai szerkezetek biztosítják: állvány tárgyasztal beállító rendszer (makro- és mikrocsavar) A mikroszkóp szerkezeti felépítését az 1. ábra mutatja be. A fényforrás régebbi típusú mikroszkópoknál külsı, a modernebb változatoknál már a készülék talpába épített egység. A fényt egy egyenletesen sugárzó izzószál bocsátja ki. Ennek képét a kollektorlencse (győjtılencse) a kondenzorrekesz síkjába vetíti. A felesleges fény kizárásáról a kollektorrekesz gondoskodik. A fény színének és erejének szabályozására különbözı színszőrık, illetve homályos üveglap szolgál. Külsı megvilágítású mikroszkópok esetén a tükör a készülék alján van felszerelve. Belsı világítású mikroszkópokban be van építve. Kondenzor alkalmazása esetén síktükörrel, kondenzor nélkül pedig homorú győjtıtükörrel vetítik a fényt a preparátumra. A mikroszkóplámpa felépítését a 2. ábra mutatja be. ***2. ábra: A mikroszkóplámpa sematikus képe A kondenzorrekesz (írisz diafragma) a megvilágítási nyílásszög beállítására szolgál, ezáltal a tárgykontrasztot szabályozza. A teljesen nyitott kondenzorrekesz fényes, de kontraszt nélküli, míg a túlságosan zárt sötét, kontrasztos képet ad. A kondenzorlencse feladata, hogy a fényforrásból érkezı sugarakat a vizsgálandó tárgyra sőrítse. A kondenzor egy fogasléc segítségével fel-le mozgatható. A mozgató apparátus segítségével érhetı el, hogy a kondenzor olyan távolságban legyen a tárgysíktól, amelyben az írisz diafragma képe a tárgysíkban jelenik meg. A kondenzorból érkezı, a vizsgált tárgyon áthaladó és megtörı fénysugarak az összetett nagyítórendszer elsı tagjába, az objektívbe (tárgylencse) kerülnek. A lencsék olyan lencsehibákkal rendelkezhetnek, amelyek leképezési hibákat okozhatnak. A két legfıbb lencsehiba a gömbi eltérés és a színi eltérés. A gömbi eltérés oka, hogy a kép közepét és perifériáját nem lehet egyszerre élesre állítani, mert az áthaladó fénysugarak gyújtópontja nem esik egybe. A gömbi eltérés diafragma beépítésével csökkenthetı. A színi eltérés oka, hogy a különbözı hullámhosszú fénysugarak nem egyformán hajlanak el, gyújtópontjuk az optikai tengelyen nem esik egybe. Fehér fény használata esetén nem kapunk éles képet, és a kép színes szegéllyel rendelkezik. A színeltérés csökkentése lencserendszerkombinációkkal történik. Két szín korrekciója esetén - ezek a zöld és a sárga, amelyekre szemünk a legérzékenyebb - akromát lencsérıl beszélünk. Az objektíven ezt külön nem jelölik meg, mivel valamennyi ma gyártott jelöletlen lencse akromát. Három szín korrekciója esetén apokromát lencsérıl beszélünk, ezeket "apochromat" felirattal jelölik. A
maradék színek hibája már nem számottevı. Ezeket a lencséket akkor használjuk, ha finom színes részletek megkülönböztetésére is szükség van. Az objektív frontlencséje és a tárgy közötti távolság - a szabad tárgytávolság,- a legnagyobb nagyítású tárgylencsék esetében a milliméter törtrésze, ezért a lencse védelmét úgy oldják meg, hogy az objektív egy rugó ellenében felfelé teleszkópszerően elmozdulhasson. Ily módon elkerülhetı a mikroszkóp beállításakor a tárgylemezre való erıs rászorítás, ami a frontlencse sérüléséhez vezethet. A tárgylencsén a következı adatokat szokás feltüntetni: Lineáris nagyítás Numerikus apertúra Tubushossz és az alkalmazható fedılemez vastagság Az objektívek maximális nagyítása 120-szoros szokott lenni. Ilyen lencsét csak immerzióval érdemes használni. Ebben az esetben az objektívet HI jelzéssel és/vagy az objektív alján körbefutó győrővel látják el (HI = homogén immerzió: az immerziós olaj törésmutatója megegyezik az üvegével, n=1,52). A fáziskontraszt objektívek jelölése: Ph vagy Phv. Az objektív a tárgyról elsıdleges valódi nagyított képet készít, amit a szemlencserendszer (okulár) nagyít tovább, és virtuális másodlagos képet hoz létre. A legelterjedtebb a Huygens féle okulár, amely egy kollektívlencsébıl és egy szemlencsébıl, valamint a kettı között. elhelyezett fényrekesztı győrőbıl áll. Ez utóbbi a képet teszi élesebbé. A megfelelı módon kialakított kompenzációs okulárok az objektív színi hibáját javítják, továbbá a gömbi eltérést is csökkentik. A Huygens-okulárokat legfeljebb 20-szoros nagyításig késztik. A nagyítás mértékét az okuláron feltüntetik. A mikroszkóp összes nagyítását az objektív és az okulár nagyításának szorzata adja. A mikroszkóp nagyítási elvét a 3. ábra mutatja be. ***3. ábra: A közönséges fénymikroszkóp nagyításának sémája A mikroszkóp állvány súlyos, fémbıl készült állvány, amelynek feladata az optikai részek biztos, rezgésmentes rögzítése. A tárgyasztal tartja a preparátumot hordó tárgylemezt. A tárgylemez rögzíthetı, és két csavarral a tárgyasztal felületével együtt egymásra merıleges két irányban elmozdítható. A mikroszkóp beállítása a kialakítástól függıen vagy a tárgyasztal, vagy a lencserendszert tartalmazó tubus optikai tengely vonalában történı mozgatásával - a makro- és mikrocsavar segítségével - történik. Az objektívet és az okulárt rögzítı és összekötı tubus szabványosított hossza 160 mm. A tárgyasztal alatt, függıleges irányba mozgathatóan helyezkedik el a kondenzor. Külsı megvilágítás esetén a homorú-sík tükör szintén a mikroszkóp-állványhoz van rögzítve kardán függesztéssel. 1. Közönséges fénymikroszkóp MIKROSZKÓPOS ELJÁRÁSOK A bakteriológiai vizsgálatok során az esetek zömében immerziós objektívet használunk a lehetı legjobb felbontóképesség elérése céljából. Az immerziós objektív és a tárgy közé
immerziós olajat (cédrusolaj) kell cseppenteni, amelynek a törésmutatója megegyezik az üvegével (homogén immerzió), így a feloldóképesség 0,2-0,4 µm lesz, ami az immerziós objektívvel használt mikroszkópot alkalmassá teszi a legkisebb mérető baktériumok vizsgálatára is. 2. Ferde megvilágítás A felbontóképesség nemcsak a törésmutató növelésével, hanem ferde megvilágítással is elérhetı. Ennek célja, hogy a fénysugarak az optikai tengelyhez képest ferdén jussanak a tárgyra, aminek következtében a tárgyról kapott kép sokkal árnyaltabb, plasztikusabb lesz. Ferde megvilágítás hozható létre: speciális kondenzorral a tükör excentrikus beállításával az apertúra írisz excentrikus beállításával a kondenzor keretébe helyezett excentrikus kör diafragmával 3. Sötét látóterő mikroszkóp A sötét látóterő mikroszkópban a tárgyat egy speciális paraboloid-kondenzorból érkezı fénysugarakkal világítjuk meg úgy, hogy a fénysugarak kívül, essenek az objektív nyílásszögén, így a látótér sötét marad. Az objektívbe csak azok a fénysugarak juthatnak be, amelyek a tárgy korpuszkuláris részecskéin törést szenvednek. Ily módon a sötét látótérben korpuszkuláris részek (pl. baktériumok) csillogó képet mutatnak (Tyndall-jelenség). A sötét látóterő mikroszkóp kifejezetten alkalmas a baktériumok mozgásának vizsgálatára. 4. Fáziskontraszt-mikroszkóp Eltérı törésmutatójú közegeken áthaladva a fény fázisa megváltozik. Az emberi szem azonban a fáziskülönbséget nem képes érzékelni, csak az amplitúdó-különbséget, ezért a fáziskülönbségeket amplitúdó-különbségekké kell alakítani. Az erre a célra kifejlesztett fáziskontraszt-eljárás, amelynek elméleti megalapozásáért Zernike 1932-ben Nobel-díjat kapott, kiválóan alkalmas élı mikroorganizmusok és más sejtek szerkezetének vizsgálatára. Az eljárás a kondenzor elsı gyújtósíkjában beépített fázisblende és az objektív hátsó gyújtósíkjában beépített fázislemez segítségével alakítja át a fázisváltozást amplitúdó változássá. 5. Fluoreszcens mikroszkóp A mikroszkóp felbontóképességének javítása az Abbe-törvény értelmében a hullámhossz csökkentésével is elérhetı. Ebben az esetben a tárgy megvilágítására ultraibolya fényt alkalmazunk. Mivel az, üveg igen jelentıs mértékben elnyeli az UV-sugarakat, a fluoreszcens mikroszkópban az optikai részeket kvarcból kell készíteni. Mivel szemünk az ultraibolya fényt nem érzékeli, ilyenkor a preparátumot. fluoreszkáló festékkel kell kezelni (pl. akridinoranzs, rodamin, fluoreszcein stb). A fluoreszcens festékkel megfestett baktériumok az UV-fénysugarakat. elnyelik, és azokat hosszabb, már a látható fény hullámtartományába esı sugarak formájában bocsátják ki, azaz fluoreszkálnak.
A fluoreszcens mikroszkópia speciális formája az immunfluoreszcencial Ezt a módszert akkor alkalmazzuk, ha meghatározott antigénszerkezető baktériumot keresünk a preparátumban. Az immunfluoreszcens eljáráshoz a fluoreszkáló festéken kívül a keresett antigén ellen termelt ellenanyagot tartalmazó savóra is szükség van. A fluoreszcens festék a specifikus ellenanyaghoz van kötve. A preparátumot ezzel a jelzett ellenanyaggal kell kezelni. Amennyiben a preparátum tartalmaz az ellenanyagnak megfelelı antigént, azzal összekapcsolódik és a mikroszkópban az antigén-ellenanyag komplex a fluoreszkálás révén kimutatható. 6. Polarizációs mikroszkóp A polarizált fény lehetıséget teremt a kettıs töréső (anizotróp) és a fényre nézve homogén (izotróp) anyagok egymástól való megkülönböztetésére. Mivel a sejtalkotórészek kettıstörése olyan finom szerkezetekben rejlik (mint pl. a mitotikus apparátus), amelyek a közönségek fénymikroszkóp felbontóképességénél kisebbek, a polarizációs mikroszkóp az ilyen ultrastruktúrák vizsgálatára alkalmas. A polarizációs mikroszkópban egy polarizációs szőrıt, vagy Nicol-prizmát építenek a kondenzor elé (polarizátor) és az okulár fölé (analizátor). Az utóbbi elforgatásával a sötét látótérben elıtőnnek a kettıs töréső részek. 7. Sztereo-binokuláris mikroszkóp Olyan fénymikroszkóp, amely nem átesı, hanem visszavert fénnyel mőködik. Lényeges eltérés, hogy a vizsgált objektumot két, egymással szöget bezáró tárgylencsén keresztül vizsgáljuk, ezáltal plasztikus térbeli képet kapunk. A közönséges fénymikroszkóphoz képest azonban csak kisebb nagyítás érhetı el, mert a ferde objektívlencsék miatt viszonylag nagyobb szabad tárgytávolság szükséges. 8. Elektronmikroszkóp Az elektronmikroszkóp mőködési elvében nem különbözik a fénymikroszkóptól. Az elektronmikroszkópban a tárgy "megvilágítására" nagy sebességő elektronsugarakat használunk, amelyeket mágneses terek. segítségével irányítunk a vizsgálandó tárgyra. A képalkotás a tárgy egyes részeinek eltérı sugártörı képességén alapul. A tárgyra irányított elektronsugarak az, áthaladás, elnyelıdés vagy visszaverıdés után egy lumineszkáló ernyın leképezhetık, vagy filmen rögzíthetık. Az elektronmikroszkóp - bár a minta-elıkészítés hosszadalmas és igen bonyolult nagy elınye abban rejlik, hogy az elektronsugarak hullámhossza igen kicsi, így felbontóképessége lényegesen jobb a fénymikroszkópokénál, mintegy 0,005 nm, ami vírusok és sejtek ultrastruktúráinak, sıt egyes makromolekulák (pl. DNS) vizsgálatára is alkalmassá teszik. Az elektronmikroszkóp az elektronsugár irányát tekintve kétféle lehet. A hagyományos, un. transzmissziós elektronmikroszkóp esetén az elektronnyaláb áthatol a vizsgálandó vékony rétegő mintán. Ezzel szemben a scanning, vagy pásztázó elektronmikroszkóp esetén a sugarak ferdén érkeznek a tárgyra, azt "letapogatják", és róla háromdimenziójú képet készítenek.
MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK l. Natív készítmények vizsgálata A baktériumok morfológiai vizsgálata natív, vagy festett preparátumokon történik. A natív készítményekben élı festetlen mikroorganizmusok alaki tulajdonságait és mozgását vizsgálhatjuk. 1.1. Élesztı és penészgombák sejtjeinek és szaporító-képleteinek tanulmányozása. A penészgombák a fonalas gombák közé tartoznak. Ezekre jellemzı, hogy egy vagy, több megnyúlt sejtbıl álló, hosszabb-rövidebb fonalakat, un. hifákat képeznek. A hifák a végükön lévı csúcssejtek osztódása révén növekednek. Elıfordul, hogy a csúcs alatti sejt is osztódni kezd, ekkor a hifák elágazóak lesznek. A hifák között vannak vegetatív fonalak, amelyek a tápanyag felszívására illetve a gombatelep rögzítésére szolgálnak, illetve reproduktív hifák, amelyeken a spórák képzıdnek. A fonalak szövedéke a vattaszerő gombatelep, a micélium. Az élesztıgombák nem spórákkal, hanem sarjadzással szaporodnak, és pszeudomicéliumokat képeznek. Telepeik a baktériumok telepeire emlékeztetnek. ***Penészek és élesztık képe GYAKORLAT Szükséges eszközök és anyagok: Mikroszkóp, tárgylemez, fedılemez, pipetta, oltókacs Mikroorganizmusok: Saccharomyces cerevisiae Penicillium expansum A gyakorlat menete: A 96 %-os alkohollal megtisztított és Bunsen-égı lángjában leégetett tárgylemez felületére a Saccharomyces cerevisiae élesztıgomba tenyészetbıl elıre elkészített vizes szuszpenzióból egy cseppet kell cseppenteni, majd fedılemezzel buborékmentesen lefedni. (A fedılemezt élével a csepp széléhez kell állítani, és a kaccsal alátámasztva a tárgylemezre engedni. ) A preparátumot a mikroszkóp tárgyasztalán rögzítjük, majd a megfigyelést 10-szeres nagyítású objektívvel kezdjük. A pontos beállítás után térünk át nagyobb nagyítású objektívekre. A Penicillium expansum (penészgomba) vizes szuszpenzióját a fenti eljárással azonos módon kell megvizsgálni. Megfigyelések: 1.2. Élesztı-szuszpenzió sejt sőrőségének meghatározása Bürker-kamrás sejtszámlálással Az eredetileg vérsejtek számlálására kifejlesztett kamra igen jól alkalmazható mikroorganizmusok, különösen élesztıgombák számának vizes szuszpenzióból történı meghatározására. A módszer lényege, hogy a kamra adott térfogatú, beosztott részeiben
mikroszkóp segítségével a sejteket megszámolva egy szorzófaktor segítségével megadható a cm 3 -enkénti sejtszám. A Bürker-kamra kalibrált hálózatát a 3. ábra szemlélteti: ***3. ábra: A Bürker-kamra kalibrált hálózatának rajza A kamra mélysége 0,1 mm, így attól függıen, hogy milyen négyzetekben illetve téglalapokban számoljuk meg a sejteket, különbözı szorzófaktorral számíthatjuk át azokat 1 cm 3 -re. Az átszámítási faktorokat az alábbi táblázat tartalmazza: Kamra Méret Térfogat (mm 3 ) Szorzófaktor Nagy négyzet 0,2*0,2 0,04*0,1 2,5*10 5 Kis négyzet 0,05*0,05 0,0025*0,1 4*10 6 Téglalap 0,2*0,05 0,01*0,1 1*10 6 A kimutathatóság alsó határa 10 6 sejt/cm3. Nagyon sőrő szuszpenziók hígítással tehetık számlálhatóvá. A számlált részecskék eloszlása statisztikailag a Poisson eloszlással jellemezhetı, ezért az átlagértékek becslésének relatív hibája csak úgy csökkenthetı 20 % alá, ha annyi négyzetet vagy téglalapot vonunk be a számlálásba, hogy a bennük lévı összes sejtek száma 300-500 körüli érték legyen. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: Mikroszkóp, Bürker-kamra, szőrıpapír, pipetta Mikroorganizmus: Saccharomyces cerevisiae vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A Bürker-kamrát puha száraz ronggyal megtisztítjuk. A hálózat tisztítását nagyon óvatosan kell végezni. A fedılemez felhelyezése után a vizsgálandó szuszpenzióból egy-egy kis cseppet kell cseppenteni a fedılemez alsó és felsı széléhez. Mivel az élesztısejtek vizes szuszpenzióban gyorsan kiülepszenek, a felcseppentést alapos felrázás után kell elvégezni. Megvárjuk, míg a szuszpenzió egyenletesen beszívódik, majd a maradék folyadékot szőrıpapírral felitatjuk ügyelve arra, hogy a fedılemez alól ne szívjuk ki a szuszpenziót. Mikroszkóp alatt, 20-szoros nagyítású objektívet használva számoljuk meg a sejteket mind az alsó, mind a felsı hálózatban. Egységesen olyan hálózatot válasszunk, amelyben legalább 15-20 sejt van. A határvonalon lévı sejteknél következetesen járjunk el. Ügyeljünk arra, hogy a megszámlált összes sejtszám legalább 300 legyen. A számlálást követıen kiszámítjuk a sejtszám-átlagokat külön az alsó és a felsı hálózatra, majd e kettı átlagát szorozzuk a megfelelı szorzófaktorral. Eredmények: 1.3. Csillós baktériumok mozgásának vizsgálata függıcsepp-készítményben
A baktériumok egy része aktív mozgásra képes, amely segítségével történik. A csillók csöves szerkezető, helikális fehérjékbıl felépülı sejtszervecskék. A baktériumok felületén található csillók száma és elhelyezkedése igen változatos. Ezek lehetséges formáit mutatja be a 4. ábra. ***4. ábra: A csillós baktériumok formái (a: monotrich, b: amphitrich, c: lophotrich, d: amphilophotrich, e: peritrich) A baktériumok mozgásvizsgálatának egyik legegyszerőbb és leggyorsabb módszere a függıcsepp-készítmény. GYAKORLAT Szükséges eszközök és anyagok: mikroszkóp, vájt tárgylemez, fedılemez, oltókacs Mikroorganizmusok: Proteus vulgaris, esetleg Proteus mirabilis levestenyészete A gyakorlat menete: A függıcsepp fedılemezét megtisztítjuk, majd lelángolt oltókaccsal a levestenyészetbıl egy cseppet ráviszünk. A fedılemezt a cseppel lefelé a vájt tárgylemez vájata fölé helyezzük, majd mikroszkópban megvizsgáljuk. Ügyeljünk arra, hogy a baktériumok mozgásképességének megállapításánál a folyadékcseppben lévı esetleges áramlás vagy a Brown-féle mozgás ne tévesszen meg. A függıcsepp-készítmény felépítését a 6. ábra mutatja be. ***6. ábra: Függıcsepp-készítmény Megfigyelések: