Szabadgyökös reakciók, gyulladásos mediátorok, tápláltsági állapot változása. akut és krónikus pancreatitisben

Szabadgyökös reakciók, gyulladásos mediátorok, tápláltsági állapot változása akut és krónikus pancreatitisben Dr. Lásztity Natália témavezeto: Dr. Antal Magda az orvostudományok kandidátusa OKK-OÉTI, Táplálkozás-Egészségügyi Foosztály 8. Patológiai tudományok doktori iskolája Vezeto: Prof. Dr. Kopper László az orvostudomány doktora Programvezeto: Prof. Dr. Sótonyi Péter akadémikus Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest 2005 1

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés, célkituzések 4. oldal 2. Rövidítések jegyzéke 19. oldal 3. Experimentális vizsgálatok 20. oldal Aminosavak hatásának vizsgálata - nagy dózisú lizin és arginin okozta pancreas destrukció patkányban 3.1. Bevezetés 20. oldal 3.2. Módszerek 21. oldal 3.3. Eredmények 22. oldal 3.4. Megbeszélés 27. oldal 4. Klinikai vizsgálatok 29. oldal 4.1. Módszerek 29. oldal 4.1.1. Citokinek és antioxidans enzimek vizsgálata akut pancreatitisben jejunalis táplálás során 32. oldal 4.1.2. Antioxidáns status és fehérje-energia malnutrito akut pancreatitisben korai jejunalis táplálás mellett és krónikus pancreatitisben 33. oldal 4.1.3. Enteralisan adott n-3 zsírsavak hatása akut pancreatitisben 35. oldal 4.2. Eredmények 37. oldal 4.2.1. Citokinek és antioxidáns enzimek vizsgálata akut pancreatitisben jejunalis táplálás során 37. oldal 4.2.2. Antioxidáns status és fehérje-energia malnutritio akut pancreatitisben korai jejunalis táplálás mellett 39. oldal 4.2.3. Antioxidáns status és fehérje-energia malnutritio vizsgálata krónikus pancreatitisben 44. oldal 4.2.4. Enteralisan adott n-3 zsírsavak hatása akut pancreatitisben 47. oldal 4.3. Megbeszélés 52. oldal 4.3.1. Citokinek és antioxidáns enzimek vizsgálata akut pancreatitisben jejunalis táplálás során 53. oldal 4.3.2. Antioxidáns status vizsgálata akut pancreatitisben korai jejunalis táplálás mellett és krónikus pancreatitisben 55. oldal 2

4.3.3. Akut és krónikus pancreatitisben szenvedo betegek fehérje statusa, protein energia malnutritioja 61. oldal 4.3.4. Enteralisan adott n-3 zsírsavak hatása akut pancreatitisben 65. oldal 4.3.5. Javaslatok akut és krónikus pancreatitisben szenvedo betegek komplex diétás kezelésére a vizsgálati eredmények tükrében 68. oldal 5. Táblázatok jegyzéke 74. oldal 6. Ábrák jegyzéke 76. oldal 7. Irodalom 77. oldal 8. A dolgozat alapjául szolgáló közlemények 87. oldal 9. Magyar nyelvu összefoglaló 89. oldal 10. Angol nyelvu összefoglaló 91. oldal 11. Köszönetnyilvánítás 93. oldal Appendix 94. oldal 3

1. Bevezetés és célkituzések Az akut pancreatitis gyakorisága mind hazánkban, mind világviszonylatban no. Magyarországon az esetek kb. 40%-ban epekövesség, 40%-ban alkoholizmus az etiológiai tényezo, míg a fennmaradó esetekben számos egyéb ok szerepel, de jelentos százalékban a kiváltó ok tisztázatlan marad. A betegség több mint 75-80%-ban enyhe vagy középsúlyos lefolyású, nem igényel hosszú távú kezelést, a tünetek 4-5 nap alatt gyorsan rendezodnek. Az esetek 15-20%-ában a beteg életét veszélyezteto nekrotizáló pancreatitis alakul ki, mely napjainkban is az egyik legsúlyosabb hasi kórképek közé tartozik, mortalitása elérheti akár a 40%-ot is (1). Akut pancreatitis kezdeti stádiumában nem lehet biztonsággal megítélni, melyik esetben alakul ki súlyos, a beteg életét veszélyezteto, az esetek többségében többszervi elégtelenséghez vezeto gyulladás. A betegség progressziójára és kimenetelére vonatkozóan a szakirodalom több prognosztikus tényezot ismer, amelyek a gyakorlatban is használatosak, mint például az Apache II, Ranson, Glasgow score-ok (2,3). A betegség súlyosságának megítéléséhez elengedhetetlen a hasi CT vizsgálat elvégzése, melyet a Balthazar score jellemez (4). Ezek rendkívül nagy segítséget jelentenek a terápiás protokollok és a kezelések idobeni alkalmazásához, de így is az esetek kb. 1/3-ban nem jelzik elore a súlyos szövodmények bekövetkezését. A progresszió okát túlnyomórészt nem ismerjük, nem tudjuk mi az oka annak, hogy az egyik betegben csak enyhe, ödémával kísért gyulladás, a másikban azonnal teljes nekrózis alakul ki. Klinikai megfigyelések alapján az akut pancreatitis két fázisát különböztethetjük meg. Az elso fázis a szervezetnek a pancreasból felszabaduló gyulladásos mediátorokra adott válasza (szisztémás gyulladásos válaszreakció - systemic inflammatory response syndrome, SIRS), mely súlyosabb esetekben többszervi elégtelenséghez, halálhoz vezethet. Ebben az elso szakaszban a kimenetel a gyulladásos reakció mértékétol és szervezet védekezo mechanizmusainak a gyulladást megfékezo képességétol függ (5). Pontos kiváltó tényezo ismeretének hiányában terápiás törekvéseink e kezdeti fázis megfékezésére irányulnak, annak felderítésére, mely pontokon és hogyan lehetne erosíteni a szervezet védekezo mechanizmusait, megfékezni a gyulladást. Hiszen e kezdeti szakasz végéig dol el, milyen irányban halad a betegség tovább. A második késoi fázisban, ha a szervezet természetes védekezo mechanizmusai vagy a kezelés nem fékezik meg a gyulladásos folyamatot, lokális és szisztémás szövodmények, nekrózis és 4

bakteriális felülfertozodés alakul ki a hasnyálmirigyben, a peripancreatikus szövetekben és a távoli szervekben. Fontos szerepet kap e második fázisban a betegek megfelelo tápláltsági állapota és az immunitás erosítése. A betegség második szakaszában a bélrendszerbol származó bakteriális kontamináció okozta szeptikus szövodmények veszélyeztetik a beteg életét. A fertozések gyakorisága a betegség folyamán növekszik, a 2. és 3. héten eléri a 30-60%-ot (6). Az akut pancreatitis patofiziológiájának szemléletében jelentos változások tanúi lehetünk. Mind a reaktív szabadgyökök, mind a citokinek és más gyulladásos mediátorok szerepe bizonyítottá vált akut pancreatitisben (7, 8). A 80-s évek kutatásai fényt derítettek az oxigén szabadgyökök szerepére, experimentális vizsgálatok sora igazolta fokozott jelenlétüket. A molekuláris biológia területén történt haladásnak köszönhetoen a régebbrol elfogadott autodigesztív elmélet mellett, mely a korai patológiás pancreas enzim-aktivációt tekinti a betegség meghatározó elemének, az utóbbi években egyre nagyobb teret hódít az úgynevezett gyulladásos robbanás elmélet. Eszerint a súlyos nekrotikus formákban felborul a szervezet stressz reakcióra adott gyulladásos válaszának ellenorzése. A gyulladásos mediátorok és sejtes elemek kontrollálatlan nagyfokú kiáramlása és aktiválódása súlyos, életet veszélyezteto többszervi elégtelenséghez vezet. Igaz az egyensúly megszunésének okát továbbra sem sikerült tisztázni, azonban világossá vált, hogy más, a szervezetet veszélyezteto állapotokban, mint például szepszisben, politraumában, nagy mutéteket követoen, autoimmun betegségekben a gyulladásos elemek hasonló láncreakciója észlelheto, melyek pontos megismerése új terápiás megfontolásoknak nyit teret. A diagnosztikus lehetoségek, ill. az intenzív terápiás ellátás fejlodése jelentos elorelépéshez vezetett a hasnyálmirigy gyulladásos betegségeinek kezelésében. A szélesköru experimentális és klinikai vizsgálatok ellenére az akut pancreatitis patogenezisét befolyásoló kezelési eljárások, melyek a legsúlyosabb formák változatlanul magas halálozását csökkentenék, a mai napig hiányoznak. Két klinikailag megalapozott terápiás módosítás, a szelektív enteralis dekontamináció (9) és a korai enteralis táplálás, az utóbbi években ismert prognosztikai javulást eredményezett, azonban ennek patofiziológiai magyarázata a szerteágazó irodalmi adatok ellenére további megvilágítást igényel. A jejunalis táplálás új fejezetet nyitott az akut pancreatitis kezelésében. A betegek kezelésében közel 15 éve alkalmazott korai 5

jejunalis táplálás csökkentette a késoi szövodmények, mutéti beavatkozások számát és a mortalitást, ami felvetette annak lehetoségét, hogy a táplálék bélrendszerbe történo juttatásával a bélatrophia és következményes bakteriális transzlokáció kivédése mellett, csökkentheto a szervezetben kialakuló gyulladásos válasz is (10,11). Vizsgálataimmal arra keresem a választ, miképpen befolyásolja a korai enteralis táplálás a pancreatitis kezdeti és késobbi szakaszában zajló gyulladásos folyamatokat, szabadgyök és citokin képzodést. Eredményeink a betegség pathomehanizmusának pontosabb megismerése mellett segítséget nyújthatnak az akut pancreatitis optimális kezelésének kialakításához. A következokben az akut pancreatitist illeto patofiziológiai megfontolások közül kutatási munkámhoz szorosan kapcsolódókat részletezem. Bélnyálkahártya barrierfunkciójának károsodása Akut pancreatitisben a fertozéses szövodmények, szisztémás gyulladásos válasz és többszervi elégtelenség kialakulásában a bélmucosa károsodásnak és bakteriális transzlokációnak központi szerepet tulajdonítanak, melyet több kísérletes eredmény is alátámaszt (12). Patofiziológiai háttereként a pancreatitises gyulladásos folyamatok és éhezés által kiváltott atrophiat, a bélfal szerkezeti sérülését és következményesen kialakult fokozott bélpermeabilitást valószínusítik, melyek lehetové teszik a lumenben jelenlevo gram-negatív kórokozók keringésbe való bejutását. Más, kifejezett gyulladással kísért kórképekben is, a fertozések, illetve szövodmények kialakulásában a bélmukoza károsodásának központi szerepére egyre több irodalmi adat utal (13). Komplex, részleteiben kelloképpen nem tisztázott módon ez a károsodás következménye, avagy éppen eloidézoje a szisztémás gyulladásos válasz, a többszervi elégtelenség és szeptikus állapotok kialakulásának. A klinikumra jellemzo hasi fájdalom mellett, a korai szakban gyakran jelentkezik hányinger, hányás esetenként paralitikus ileus, melyek a bélrendszer muködési zavarára utalnak. A per os táplálás felfüggesztése, mint a pancreas nyugalomba helyezésének alapfeltétele igen korán vezet bélnyálkahártya atrophiahoz. A mucosa károsodás kiváltásában gyakori tényezo a splanchnikus területi hipoperfúzió, következményes regionális hipoxia és az ezt követo reperfúziós, oxidatív károsodás. A betegség korai fázisában a bélrendszer a pancreatitisben kialakuló szisztémás 6

gyulladásos válasz célpontjává válik, majd az enterociták és lymphocytak citokin termelése révén tovább súlyosbíthatja a szervezetet és mucosat ért károsodást (14). A bélpermeabilitás fokozódását észlelték, mind experimentális, mind klinikai vizsgálatok során (15, 16). A bélfal fokozott permeabilitását igazolták akut pancreatitis korai fázisában (17). A fokozott bélpermeabilitás pozitív korrelációt mutatott a pancreatitis súlyosságával (18). Az atrophiás fokozottan átereszto bélfalon átjutó baktériumok szisztémás endotoxaemia, bakteriális szepszis kialakulásához vezetnek, a pancreas és a peripancreatikus szövetek következményes felülfertozodésével (19). A szeptikus komplikációk fontos szerepet játszanak a morbiditásban és mortalitás gyakoriságában. Az esetek l5-20%-t alkotó súlyos nekrotizáló pancreatitisek egy harmadában alakul ki bakteriális felülfertozodés a gyulladt hasnyálmirigyben és a környezo szövetekben, szervekben. Klinikai vizsgálatokban az eltávolított pancreas szövetbol, mesenterialis nyirokcsomókból és más szervekbol leggyakrabban izolált kórokozó az Escherichia coli volt (20). Mesterséges táplálás szerepe a gyulladásos hasnyálmirigy betegségekben A jejunalis táplálás létjogosultsága akut pancreatitis kezelésében korábban vitatott kérdés volt, ma már annak ajánlott része (21). Az enteralis tápszonda második jejunumkacsba történo levezetése és a jejunalis táplálás megkezdése kivédi a postprandialis neurohormonalis ingerek kialakulását, hatása az élettanihoz megközelíto és egyben megelozhetok a parenteralis táplálás szövodményei is. A jejunalis táplálás eredményeképpen a bélmozgások fokozódnak, javul a mesenterialis keringés, a mucosasejtek közvetlen táplálása is megvalósul. A mucosa atrophia kivédése, a bélperisztaltika fenntartása segítik a bél integritásának, immunológiai és abszorpciós funkciójának megorzését. Klinikai vizsgálatok során összehasonlították pancreatoduodenectomian átesett betegekben az enteralisan és parenteralisan bejuttatott macronutriensek, fehérjék (aminosavak), szénhidrátok és zsírok hatását a pancreas muködésére. A pancreasnedv mennyiségi és minoségi összetételét vizsgálva az aminosavak és zsírsavak bevitele nem váltott ki jelentos pancreas stimulációt, nem volt különbség parenteralis tápláláshoz viszonyítva a pancreasnedv mennyiségében, összetételében, ha a tápszondát a második jejunumkacsba vezették le (22). A distalis jejunumba történo táplálás esetén volt a 7

bazális elválasztáshoz képest legkisebb az eltérés, az ileumba adott tápoldatok egyáltalán nem váltottak ki stimulációt (23, 24). Qin experimentális vizsgálataiban a jejunalisan táplált csoportban alacsonyabb volt az endotoxin szint, nagyobb volt a villusok magassága, a T lymphocytak száma a vérben és a lépben, mégsem különbözött a két csoport túlélése és a pancreatitis lefolyása (25). Mindez felvetette annak lehetoségét is, hogy a bakteriális transzlokáción és a bélrendszerben zajló gyulladásos folyamatokon kívül más tényezok is szerepet játszanak a betegség lefolyásában. Az enteralis és parenteralis táplálást összehasonlító randomizált prospektív klinikai vizsgálatok egy részében a gyulladásos folyamatok mérséklodését, a szövodmények számának és a kezelés idejének csökkenését észlelték az enteralisan táplált csoportban (26,27), míg más vizsgálatok nem találtak különbséget a két csoport között (28). Ezekben a vizsgálatokban az enteralis táplálás sikeres szövodménymentes alkalmazásáról is beszámolnak. A megfelelo energia- és fehérjebevitel biztosítása a kezelés fontos eleme, a pancreatitis által okozott katabolikus állapot következtében kialakult fokozott energia, fehérje, nyomelem- és vitaminigény miatt. Az energiaszükséglet szignifikánsan nagyobb szeptikus szövodmények, többszervi elégtelenség esetén. Az optimális fehérje és energia bevitel elérését a betegek kezelése során nagymértékben befolyásolja az enteralis táplálás tolerálása, az alkalmazott tápszer kalóriatartalma, ozmolaritása. A legújabb ajánlások elso választandó táplálási formának az enteralis táplálást jelölik meg. Abban az esetben, ha az enteralis úton nem biztosítható a megfelelo bevitel, kiegészíto parenteralis táplálás alkalmazható (21). Az enteralis táplálás terápiás hatása számos tényezobol adódhat: a bélatrophia kivédése, a táplálás kedvezo energetikai és nutritív jellemzoi, bélmotilitás és szekréciós hatások. A klinikai vizsgálatok az enteralis táplálás létjogosultságát igazolták akut pancreatitis kezelésében, de továbbra sem tisztázott pontosan milyen mechanizmus játszik dönto szerepet a kedvezo hatás kifejtésében. A jejunalis táplálással kapcsolatos kedvezo klinikai eredmények, jobb gyógyulási arány, kevesebb szövodmény és csökkent mortalitás a következo kérdést veti fel: befolyásolja-e a gyulladásos mediátorok és reaktív szabadgyökök kezdeti felszabadulását az enteralis táplálás? 8

A reaktív oxigén szabadgyökök szerepe Újabb experimentális és klinikai eredmények is igazolják a szabadgyökök szerepét a gyulladásos folyamatok és szövodmények kialakulásában, a pancreatitis súlyossága és a reaktív oxigén gyökök keletkezése közötti összefüggést (29, 30). Egyre több megfigyelés támasztja alá azt a feltételezést, hogy a szervezetet ért oxidatív stressz valójában a pro- és antioxidáns folyamatok közötti komplexen szabályozott egyensúly felborulása. A sejteket számos enzimatikus (szuperoxid-dismutáz (SOD), kataláz) (1.ábra), illetve nem-enzimatikus (E-, C-vitamin, glutation stb.) antioxidáns védi az oxidativ-stresszel szemben és a sejtkárosodás akkor következik be, amikor az antioxidáns védelem károsodik vagy kimerül (2.ábra). 1. ábra A szervezet primer endogén antioxidáns enzimei 9

2. ábra Az oxidatív stressz kialakulása OXIGÉN EREDETU SZABADGYÖKÖK O 2 - H 2 O 2 OH. 1 O 2 Szabadgyökök fokozott termelése egyensúlyi állapot hipoxia, iszkémia-reperfúzió, akut- és krónikus gyulladások, toxinok, égés, uv- és radioaktív sugárzás, tumoros betegségek OXIDATÍV STRESSZ Lipidperoxidáció fokozódás Membrándestrukció ENDOGÉN ANTIOXIDÁNSOK Szuperoxid dizmutáz Glutathion peroxidáz endogén thiolok vitaminok, kataláz Csökkent antioxidáns védelem A reaktív oxigén szabadgyökök lehetséges szerepét akut pancreatitis kialakulásában eloször Sanfey írta le 1984-ben, aki ex vivo perfundált kutya pancreasban vizsgálta az antioxidánsok szerepét három különbözo pancreatitis modellen (31). Az experimentális eredmények alapján az oxidatív szabadgyökök az akut pancreatitis igen korai szakaszában szabadulnak fel, és fontos szerepet játszanak a betegség kialakulásában (32). Az oxigéngyökök egyik lehetséges forrása a pancreas acinussejtek enzime, a xantin-oxidoreduktáz, másrészt a gyulladás helyére migráló leukociták NADPH-oxidáz és myeloperoxidáz enzimrendszere lehet (33). Egyes experimentalis vizsgálatok a cytochrom P-450 enzimrendszer túlmuködését feltételezték, mely fokozott szabadgyök képzodéshez vezethet. A máj microsomalis monooxigenáz poliszubsztrát enzimrendszerének muködése állandó ingerek, különbözo xenobiotikumok hatására változhat meg. A szövetekre, biológiai anyagokra gyakorolt direkt hatásuk mellett a reaktív oxigén szabadgyökök polimorfonuklearis sejtek akkumulációját is kiváltják, melyekbol aktivációjuk következtében solubilis mediátorok, proteolitikus enzimek, további reaktív oxigén gyökök szabadulnak fel kiterjedt szöveti károsodást okozva (34). Állatkísérletek során enyhébb, oedemás 10

pancreatitisben (cerulein kiváltotta) és a súlyosabb haemorrhagias formákban (Nataurochlorat indukálta és cholin deficiens ethioninban gazdag étrend kiváltotta, CDEmodell) is igazolták a reaktív szabadgyökök fokozott képzodését, a primer antioxidáns enzimek és természetes antioxidánsok csökkenését, a lipidperoxidációs termékek korai felszaporodását a pancreasban és a duodénum nedvben (35). A lipidperoxidációs termékek felszaporodása és a primer antioxidáns enzimek aktivitásának csökkenése volt kimutatható 3-6 órával az experimentális pancreatitis indukcióját követoen, az elektronmikroszkópos elváltozások megjelenése elott, ami e reaktív szabadgyökök korai nagy mennyiségu felszabadulására, az antioxidáns rendszer túlterhelodésére utal (36). Transgenikus Cu/Zn-szuperoxid-dismutázt fokozottan termelo egerekben például enyhébb szöveti és biokémiai eltérések alakultak ki cerulein-indukálta pancreatitisben, és az enzimaktivitás csökkenése is szignifikánsan kisebb volt, mint a normál állatokban, ami ugyancsak az intracellularisan felszabaduló reaktív oxigéngyökök szerepét igazolja (37). A kezdeti megfigyelések vizsgálatok sorozatát indították el különbözo antioxidánsok terápiás alkalmazását célozva. Kísérletes akut pancreatitisben antioxidánsok adása enyhítette a szöveti elváltozásokat, tüneteket, de nem védte ki a pancreatitis kialakulását (38). SOD és kataláz intravénás adása képes volt megelozni a pancreatitis okozta lipidperoxidációt, csökkentette a zimogén degranulációt és a szöveti nekrózist (39). A SOD aktivitás ismert csökkenése mellett a sejtszintu antioxidáns védelem másik fontos elemének, a glutationnak az intracellularis koncentrációja is lecsökken akut pancreatitisben (40). A klinikai gyakorlatban többségében sikertelen antioxidáns kezelést azzal magyarázták, hogy a betegek nagy része a korai szakaszt, a jelentos szabadgyök felszabadulást követoen, a tünetek több napos fennállásakor kerül kórházba. A szabadgyökök kiváltotta kóros folyamatok vizsgálata általában indirekt módon történik, a reakciótermékek vagy a primer antioxidáns enzimek, nem enzimatikus antioxidansok koncentrációjának meghatározásával. Szabadgyökök kóroki szerepét feltételezték krónikus hasnyálmirigy-gyulladás különbözo formáiban is. Nagy betegszámot felölelo klinikai tanulmányok igazolták krónikus pancreatitisben szenvedo betegekben különbözo antioxidánsok hiányát (glutation, A-, E- és C-vitamin, szelén), a lipidperoxidációs termékek felszaporodását a 11

szérumban és az eltávolított pancreas szövetben (41,42). A herediter formák esetén felmerült annak a lehetosége, hogy az antioxidáns védekezés primer, öröklött zavara miatt alakul ki a krónikus acinussejt pusztulás, amit a klinikai vizsgálatok nem támasztották alá (43). Krónikus alkoholfogyasztás okozta recidív pancreatitisben a szervezetet állandó oxidatív károsodás éri, és a kialakuló májkárosodás e védelmi rendszer gyengüléséhez vezet (44). Antioxidánsok hosszú távú szupplementációja krónikus pancreatitisben csökkentette a fájdalmas periódusok, a szövodmények és relapszusok gyakoriságát (45, 46). Citokinek szerepe A 90-s években a citokinek szerepére irányult a figyelem különbözo gyulladásos megbetegedésekben. Bizonyítottá vált akut pancreatitisben a gyulladáskelto citokinek szérum és szöveti szintjének emelkedése. Kezdetben a pancreasra lokalizálódó gyulladás mediátorai gyors citokin választ váltanak ki a proinflammatorikus citokinek, IL-1, TNF-?, IL-6, IL-8 szintjének jelentos emelkedésével (47,48). A TNF-? fontos szerepet játszik a gyulladásos folyamatok beindításában, további citokin felszabadulást indukálva. Hatására fokozódik a leukocita hemotaxis és aktivitás, indukálja a HLA II antigének és adhéziós molekulák expresszióját. Nagy mennyiségben történo szintézise szoros összefüggést mutat a szeptikus sokk, többszervi elégtelenség kialakulásával, melyek az akut pancreatitishez hasonló szisztémás jelenségekkel kísért állapotok. Kísérletes akut pancreatitisben emelkedett TNF-? szinteket találtak (49), míg klinikai vizsgálatok során a betegek csak egy részében volt magas a TNF? szint, továbbá a mért értékek nem korreláltak a betegség súlyosságával (50). Szélesköru multicentrikus klinikai vizsgálatok során vizsgálták a pro- és antiiflammatorikus citokinválaszt akut pancreatitisben. Emelkedett IL-1, IL-1 receptor antagonista, IL-2, IL-6 és IL-10 szinteket igazoltak (51). Számos közlemény foglalkozott a citokinek prognosztikai jelentoségével. Az IL-6 az akut gyulladásos válasz központi mediátora, szintje jól korrelált a pancreatitis súlyosságával, kifejezetten emelkedett volt letális esetekben (52). Akut pancreatitisben több összehasonlító tanulmány számolt be a jejunalis táplálás elonyeirol szemben a teljes parenteralis táplálással. Kevés adat áll azonban rendelkezésre a citokinek szintjének változásáról a jejunalis táplálás mellett a kórházi kezelés folyamán. Felmerül a kérdés vajon a táplálék bélrendszerbe történo juttatásával 12

megváltozik e a szervezetben a hasnyálmirigy-gyulladás által kiváltott szisztémás gyulladásos válasz, a különbözo mediátorok felszabadulása. Mint ismeretes a gastrointestinalis traktus immunsejtjei aktív résztvevoi a gyulladásos folyamatoknak szervezetünk legnagyobb immunszerveként. A bélrendszer integritása hatással van a pancreatitis súlyosságára, a szeptikus és késoi szövodmények kialakulásának fontos tényezoje. A bélatrophia humán vizsgálatokban citokinek és más mediátorok felszabadulását váltja ki, melyek tovább súlyosbítják a pancreatitis következményeként kialakult szisztémás gyulladásos választ. A gyulladásos mediátorok és citokinek fokozott felszabadulása miatt felborul a szervezet pro- és antiinflammatorikus mediátorok közötti egyensúlya. Az epitheliumban található T lymphocyták fokozottan termelnek citokineket, melyek csökkentik, vagy éppen fokozzák a baktériumok penetrációját gátló IgA termelést. Citokinek nem csak a bélrendszerben, hanem a májban, a pancreasban és a tüdoben is termelodnek akut pancreatitisben. Akut pancreatitisben a citokin termelodés csúcsa 24-36 órával a fájdalom megjelenését követoen alakul ki (53). Az esetenként kialakuló SIRS a szervezet védekezo mechanizmusa. A betegeknek láza lesz, tachycardia, tachypnoe és enyhe acidózis alakul ki. Néha a gyulladásos válasz kifejezetté válhat és többszervi elégtelenséghez, végso esetben halálhoz vezethet. A bél barrierfunkciója, a bakteriális transzlokáció és többszervi elégtelenség közötti összefüggések nem pontosan ismertek, nem tisztázott alapjában véve az sem, hogy a bélfunkció elégtelensége oka vagy következménye gyulladásos válaszreakciónak (54). Experimentális akut pancreatitisben a fokozott bélpermeabilitás, szisztémás endothel diszfunkció és az akut fázis válasz korábban alakultak ki, mint a bélrendszerbol kiinduló bakteriaemia (55). Protein-energia malnutritio (PEM) akut és krónikus pancreatitisben A hasnyálmirigy központi szerepet tölt be a szervezetbe bejutó tápanyagok emésztésében, anyagcseréjében. Mind exokrin, mind endokrin funkciójának károsodása súlyos anyagcserezavarokat okozhat. Másrészt akár az endokrin, akár az exokrin funkció károsodik, idovel a másik funkció károsodására is számítanunk kell a betegek hosszútávú gondozása során. 13

A heveny hasnyálmirigy-gyulladás igen változatos lefolyású, kisebb vagy nagyobb mértéku, akár a pancreas egészét is érinto károsodás alakul ki. Jellemzo a katabolikus folyamatok kifejezett felgyorsulása, a megnövekedett energiaigény, fokozott fehérje és zsír lebontás. Pontos kiváltó tényezo ismeretének hiányában terápiás törekvéseink e kezdeti fázis megfékezésére irányulnak, annak felderítésére, mely pontokon és hogyan lehetne erosíteni a szervezet védekezo mechanizmusait, megfékezni a gyulladást. Indirekt kalorimetriás vizsgálatok ezekben a betegekben a nyugalmi energiaigény növekedését igazolták, mely elérheti a normál állapotban számított érték 140%-át (56). Klinikai vizsgálatok során jelentos nitrogénvesztés, negatív nitrogénegyensúly kialakulása igazolódott (57). Az izmokban a fehérjék lebontása akár 80%-kal megemelkedhet a normál állapothoz képest, a napi nitrogénvesztés elérheti 20-40 g-ot. Jelentosen csökken a plazma fehérjék koncentrációja, a májban megno az akut fázis fehérjék szintézise. A hyperkatabolikus állapotot a szérum összfehérjéinek és a gyors metabolizmusú fehérjék szintjének, az osztott szénláncú és aromatikus aminosavak arányának kifejezett csökkenése jellemzi (58). Ezért akut pancreatitisben kitüntetett szerepe van a táplálásnak, a megfelelo energia- és fehérjebevitel biztosításának, a katabolikus folyamatok lassításának. Súlyos kórformákban a kialakuló SIRS tovább fokozza az energiaigényt. Az enteralis táplálás bevezetésének idopontját illetoen a legújabb ajánlások szerint, ha a beteg általános állapota és a bélrendszer érintettsége engedi, a táplálást a felvételt követoen el kell kezdeni (59). Ha az enteralis út nem biztosítható, például akut hasi katasztrófa, paralitikus ileus esetén, teljes parenteralis táplálást kell bevezetni átmenetileg. A megfelelo jejunalis táplálással megelozheto, ahogy azt már korábban említettem, a vékonybél-nyálkahártya funkciózavara, atrophiája. Továbbá a colonban fenntartható a rövidszénláncú zsírsavak képzéséhez nélkülözhetetlen normál baktériumflóra, gyorsabban indul be a belek perisztaltikája, csökken a bélfal feszülése és kevésbé károsodik a helyi mikrocirkuláció. A pancreas exokrin emésztofunkcióit a tápanyagok által közvetlenül ingerelt n.vagus és különbözo, a gyomor-bélrendszerben képzodo hormonok befolyásolják (60). Az úgynevezett semielementáris, oligopeptidekbol álló és elemi diéta kevésbé ingerli a pancreast, mint a polimer, alkotórészeire nem bontott tápszer. A tápszerekkel kapcsolatos megfigyelések ellentétesek, a klinikai gyakorlatban mind a semielementáris mind a polimer diéta 14

alkalmazása is elterjedt (61, 62). A hasnyálmirigy-gyulladásban alkalmazott tápszerek optimális összetétele a klinikai kutatások egy jelenlegi részét képezik. Az enterális táplálás alapveto feladata a megfelelo energia- és tápanyagbevitel biztosítása. Az oldatok átlagos energiatartalma és ozmolaritása, a beadható mennyiség nagyban befolyásolják az optimális bevitelt. A másik kérdés vajon a legújabb immunstimuláló vagy moduláló tápanyagok biztonságosan alkalmazhatók-e ezekben a betegekben. A szakirodalmat áttekintve egy tanulmány szerint például az arginint, nukleotidokat és omega-3 zsírsavakat tartalmazó immun-stimuláló polimer tápszer sem vált ki jelentosebb pancreas stimulációt (63), de szélesköru alkalmazásához további prospektív klinikai vizsgálatok szükségesek. Glutamin enteralis adása csökkentette a gyulladásos citokinek felszabadulását és a szövodmények számát akut pancreatitisben (64). A hasnyálmirigy idült gyulladása esetén a mirigy-parenchyma irreverzibilis pusztulásával állunk szemben, melyet a pancreas funkció progresszív vagy állandó károsodása jellemez. A megfelelo enzimpótló kezelés mellett fontos a szénhidrátokban dús, fehérjéket optimális arányban tartalmazó és zsírszegény étrend fokozatos bevezetése. A ma alkalmazott enzimpótló kezelések lehetové teszik az emésztoenzimek duodenumba való eljutását és megfelelo keveredését a táplálékkal. A hasnyálmirigy jelentos funkcionális tartalékkal rendelkezik (65). A betegekben gyakran fellépo steatorrhoea a lipáz termelés 65-90%-os kiesésénél jelentkezik, a proteázok és amiláz szekréciójában még jelentosebb a tartalék. A szénhidrátokban dús étrend mellett ügyelnünk kell az esetlegesen társuló inzulinszekréció károsodásra, azaz a szénhidrát anyagcsere rendszeres követése és az idoben megkezdet inzulin pótlás a kezelés szerves része. A fehérjék optimális bevitele és óvatos zsírpótlás fokozza az acinus-sejtek enzimtermelo képességét és regenerálódását. A duodenumba jutott fehérjéknek jelentos szerepe van az itt jelenlevo proteázok inaktiválódásában. Továbbá a fehérjék jó puffer kapacitással is rendelkeznek. A PEM kialakulásának veszélye fokozott krónikus pancreatitisben, a több éve hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedo betegek közül az alkohol okozta kalcifikáló formákban a malnutrició elofordulása akár 90%-os is lehet (66). A krónikus alkoholfogyasztás talaján kialakult irreverzibilis máj és hasnyálmirigy károsodás jelentos morbiditási és mortalitási tényezo, a betegekben a betegségek lefolyása 15

súlyosabb, különösen az akut recidív pancreatitisek, gyakoribbak a szövodmények, malnutritio és letális kimenetel. n 3 többszörösen telítetlen zsírsavak hatása akut pancreatitisben Akut pancreatitisben a kimenetel szempontjából igen fontos, hogy a hasnyálmirigybol kiinduló gyulladásos folyamatok milyen mértéku szisztémás gyulladásos választ és mediátor felszabadulást váltanak ki. Különbözo gyulladáscsökkento és antioxidáns anyagok idobeni bevitele befolyásolhatja a szervezet gyulladásgátló védekezo mechanizmusait. Az n 3 többszörösen telítetlen hosszúszénláncú zsírsavak klinikai jelentosége, a kardiovaszkuláris megbetegedések kivédésében betöltött szerepe jól ismert. Kardioprotektív hatásukat a szérum triglicerid szintek csökkentésével, thrombocyta aggregáció gátlásával, a mikrocirkuláció javításával és a szívritmuszavarok, kamrai fibrilláció kivédésével fejtik ki (67). Klinikai megfigyelések alapján gyulladáscsökkento hatással bírnak krónikus gyulladásos megbetegedésekben, mint például psoriasisban, rheumatoid arthritisben, gyulladásos bélbetegségekben (68). Beszámolnak rövidtávú, 5-7 napos adása után gyulladást csökkento hátasukról nagy mutétet, traumát, súlyos fokú égést követoen, akut respiratorikus distressz szindrómában (69, 70). Hatásukat több szinten fejtik ki. Fokozott bevitelük esetén a sejtmembránokba beépülve no a foszfolipidek n 3 többszörösen telítetlen zsírsav tartalma, minek köszönhetoen megváltozik az eikozanoidok szintézise. Az n-3 zsírsavakból képzodo leukotriének csoportja (LTB5) gyulladásgátló, a thromboxán 3 gyenge thrombocyta aggregátor és nem rendelkezik vazokonstriktor hatással sem, ellentetben az n-6 zsírsavakból keletkezo eikozanoidokkal (71). Gyulladáscsökkento hatásuk részeként csökken a TNF-? és prosztglandin E2 (PGE2) képzodés. Az eikozanoid szintézisen keresztül befolyásoljak a helyi vérkeringési viszonyokat, kivédik az intesztinalis ischaemia kialakulását, ellensúlyozni képesek az endotoxinok által kiváltott szöveti keringéscsökkenést, mely hatásokkal mérsékelhetik a hasnyálmirigy-gyulladás korai szakaszában fellépo vérellátási zavart. A sejtek plazmamembránjának foszfolipidjeibe beépülve fokozzák a membránok fluiditását, hatással vannak a sejtfelszíni receptorok, ioncsatornák muködésére, a nukleáris transzkripciós faktorok aktivitására (72). Experimentális vizsgálatokban parenteralisan adott n 3 zsírsavak szignifikánsan növelték az anti- 16

inflammatorikus citokinek szintjét, a pancreatitis szövodményeként kialakult renalis károsodás és légzési elégtelenség is mérséklodött (73,74). Az irodalmat áttekintve eddig klinikai vizsgálat során nem vizsgálták az n 3 zsírsavak hatását akut pancreatitisben. Akut pancreatitis korai stádiumában gyulladáscsökkento hatásuk révén csökkenthetik a gyulladásos mediátorok kontrollálatlan felszabadulását, a mikrocirkuláció javításával kivédhetik a hipoperfúzió okozta vérellátási zavarokat, szöveti károsodásokat. A szérum trigliceridszint csökkento hatásuk révén a betegségben gyakran észlelt hiperlipidaemiát mérsékelhetik. A zsírok parenteralis adását korábban sok bizonytalanság övezte, mai ismereteink szerint sem pareneteralis, sem enteralis adásuk nem kontraindikált akut pancreatitisben. Vizsgálati eredmények alapján a jejunumba juttatott zsírsavak nem váltottak ki jelentos pancreas stimulációt (75). A kezelés során a trigliceridszintek rendszeres monitorizálásával követheto a szérum lipidszintek változása. Az n-3 zsírsavak hatását vizsgálva, enteralis immun-moduláló tápszer (arginin, n-3 zsírsavak, nukleotidok) adása nem váltott ki fokozott pancreas stimulációt (63). 17

Célkituzések Hazánkban a heveny hasnyálmirigy-gyulladás kezelésében a 90-es évektol fokozatosan terjedt el az enteralis táplálás alkalmazása a nemzetközi szakmai ajánlásoknak megfeleloen. Munkacsoportunk, majd más magyarországi centrumok is, sikeres alkalmazásról, a klinikai lefolyás enyhülésérol és a szövodmények számának csökkenésérol számolhatnak be. Vizsgálataim experimentális részében metabolikus pancreatitis modellen vizsgáltam: - milyen tényezok játszanak szerepet a pancreas destrukció kialakulásában a biokémiai, szövettani és elektronmikroszkópos elváltozások alapján. Munkám során korai jejunalis táplálásban részesülo, akut pancreatitisben szenvedo betegek vizsgálatával arra kerestem a választ: - miképpen befolyásolja az enteralis táplálás a betegség lefolyását, a gyulladásos folyamatokat, citokinek és szabadgyökök felszabadulását, - milyen gyakorisággal kell számolni az oxidatív stressz kialakulásának lehetoségével, mutat-e összefüggést az antioxidáns aktivitás csökkenése a gyulladásos folyamatokat jellemzo egyéb mutatókkal, - hogyan változik a kórházi kezelés folyamán az enteralis táplálásban részesülo betegek tápláltsági állapota és fehérje statusa, a protein-energia malnutrito miképpen befolyásolja a betegség lefolyását, a fellépo szövodményeket, - akut pancreatitisben alkalmazott enteralis tápszerek n 3 többszörösen telitetlen zsirsavakkal történo kiegészitése befolyásolja-e a betegség kezdeti szakaszában létrejövo gyulladásos folyamatokat, csökkentheto-e a súlyos lefolyású, nekrotikus formák gyakorisága. Munkám célja, hogy megkeressem azokat a lehetoségeket, amelyek a táplálás optimális formáját biztosítva akut pancreatitisben, javíthatják a klinikai kimenetelt. Vizsgálati eredményeim ismeretében javaslatot dolgoztam ki az akut és krónikus hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedo betegek megfelelo táplálásának és kezelésének megvalósításához. 18

2. Rövidítések ALA: alfa-linolénsav AP: akut pancreatitis BMI: testtömeg index CCP: krónikus kalcifikáló pancreatitis CP: krónikus pancreatitis DHA: dokozahexaénsav DM: diabetes mellitus EM: elektronmikroszkóp EPA: eikozapentaénsav ER: endoplazmatikus retikulum ET: enteralis táplálás GPOX: glutation peroxidáz IL-6: Interleukin-6 JT: jejunalis táplálás LA: linolsav LC-PUFA: hosszúszénláncú többszörösen telítetlen zsírsavak MOF: többszervi elégtelenség (multiorgan failure) PEM: protein-energia malnutritio PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak REE: nyugalmi energiaszükséglet SIRS: szisztémás gyulladásos válaszreakció szindróma SOD: szuperoxid-dismutáz TAS: teljes antioxidáns status TNF-a: tumornecoris faktor- a TPN: teljes parenteralis táplálás TTR: transthyretin (prealbumin) A helyesírás ellenorzése a 2002 ben az Akadémiai Kiadó által kiadott Orvosi Helyesírási Szótár alapján történt. 19

3. Experimentális vizsgálatok Aminosavak hatásának vizsgálata nagy dózisú lizin és arginin okozta pancreas destrukció patkányban 3.1. Bevezetés A hasnyálmirigy gyulladásos megbetegedéseinek kialakulásában jelentos szerepet töltenek be a metabolikus és toxikus hatások, valamint a különbözo diétás tényezok. Kísérletes akut pancreatitis nekrotizáló formáinak kiváltásában jól ismert és gyakran alkalmazott az L-arginin intraperitonealis injekciójával és a cholin hiányos, ethioninban gazdag diétával (CDE) kiváltott nem-invazív modell (77,78). Tekintettel a hasnyálmirigyben zajló fokozott fehérje és enzimszintézisre az aminosavak bevitelének kifejezett csökkentése, akárcsak jelentos növelése funkciókárosodáshoz vezethet. A két bázikus aminosav, az L-arginin és az L-lizin sejtnövekedésre és anyagcserére gyakorolt hatásával több kutatócsoport is foglalkozott. Az arginin endokrin hormonelválasztást fokozó, antikancerogén, immunstimuláló hatása és nitrogén-oxid szintézisében betöltött szerepe jól ismert (79,80). Ezzel szemben nagy dózisú intraperitonealis bevitele dózisfüggoen nekrotizáló pancreatitis kialakulásához vezet. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálata arra utal, hogy az arginin nagy dózisú parenteralis bevitele, szemben az intraperitonealissal, a szekretoros válasz átmeneti növekedésével együtt csak enyhe fokú szövettani eltéréseket vált ki (81). Kevesebbet tudunk a másik bázikus aminosav, az L-lizin hatásáról. Japán szerzok pancreas nekrózist, rapid sejtszétesést észleltek nagy dózisú L-lizin intraperitonealis beadását követoen (82). Vizsgálatom célja az L-lizin kiváltotta pancreatitis tanulmányozása, a szövettani eltérések és a sejtszintu destrukció jellemzése volt, összehasonlítva az elváltozásokat a jól ismert arginines pancreatitis modellel. 20

Módszerek Kísérleti állatok: A vizsgálathoz 170-240 g-os hím Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat anyagcsere ketrecben adaptáltuk standard laboratóriumi táp és szabad vízbevitel mellett 5 napon át. Ezt követoen a kísérlet további részében az intraperitonealis injekció beadásától a patkányokat ad libitum folyadékbevitel mellett éheztettük a leölésig, kivéve a 7 napos csoportot, ahol a per os táplálást a 3. naptól újra kezdtük. A leölés elott az állatok minden csoportban 12 órán át éheztek, az etetéssel kiváltott pancreas enzimszekréció kivédése céljából. A kísérlet leírása: Az állatokat 3 fo csoportba osztottuk. Az I. csoport (n:32) egyedei 20%-os L-lizin oldatot kaptak intraperitonealisan 350 mg/100 g testtömeg dózisban két részre osztva 1 órás különbséggel. A II. csoport (n:20) állatainak 20%-s L-arginin oldatot adtunk intraperitonealisan 500 mg/100 g testtömeg dózisban két részre osztva 1 órás idoközzel. A dózist korábbi kísérleteinknek megfeleloen két részletre osztva adtuk be az egyszeri beadást követoen észlelt magas mortalitás miatt. A III. csoport állatai (n:20) alkották a negatív kontroll csoportot, két alkalommal 2 ml fiziológiás sóoldatot kaptak intraperitonealisan. Mind a három csoport állatainak leölése 4 különbözo idopontban történt 12, 24, 48 óra és 7 nap múlva. A lizines csoportban idopontonként 8, a másik két csoportban 5 állatot öltünk le Na-pentobarbitalos altatásban. Az abdominalis aortából vért vettünk, ezt követoen az állatokat kivéreztettük és hasnyálmirigyüket gyorsan eltávolítottuk. A pancreasok tönegét lemértük, a pancreas fejbol fény- és elektronmikroszkópos vizsgálat céljára mintát vettünk. A hasnyálmirigyet a teljes eltávolítás után jégre tettük, megtisztítottuk a perimezenterialis zsírszövettol és nyirokcsomóktól. További vizsgálatok elvégzéséig 20 o C-on fagyasztva tároltuk. Szövettani vizsgálatok: A szövettani mintákat 4%-os pufferolt formalinban tároltuk a feldolgozásig. A metszeteket hematoxilin és eozin festést követoen számszeruen is értékeltük egy általunk kidolgozott pontozási rendszer segítségével: Intersticiális oedema: 0= nincs 1= enyhe 2=mérsékelt 3= súlyos fokú Nekrózis: 0= nincs 1=<20% 2=20-50% 3=>50% Leukocyta infiltráció: 0= nincs 1=enyhe 2=mérsékelt 3=kifejezett Fibrózis: 0= nincs 1=<10% 2=20-50% 3=50-80% 4=>80% 21

Elektronmikroszkópos vizsgálatok: A mintákat 2,5%-os glutaraldehid, majd 1%-os ozmium tetroxid oldatban fixáltuk. A metszetek festése 5%-os uranyl-acetattal és ólomcitráttal történt. A felvételek Joel C transzmissziós elektronmikroszkóppal készültek. Biokémiai vizsgálatok: A vérminták levétele heparinos kémcsobe történt az állatok aortájából. A mintákat ezt követoen 2000 g-n 15 percig centrifugáltuk. A szérum amiláz, alanin transzferáz (ALAT), aszpartát aminotranszferáz (ASAT), laktát dehidrogenáz (LDH) szinteket kinetikus UV teszttel, Unimat kittel (Roche, Basel, CH) határoztuk meg. A fagyasztott minták homogenizálását, centrifugálását követoen a felülúszóban meghatároztuk a pancreas teljes amiláz, lipáz és tripszin, összfehérje tartalmát korábban közölt módszerünk szerint (83). Az értékeket a pancreas teljes súlyára vonantkoztatva adtuk meg (IU/ pancreas). Az amiláz meghatározás a fent említett kittel történt, a tripszin aktivtást enterokinázzal történo aktiválás után BAPNA szubsztrát alkalmazásával határoztuk meg (84). A fehérjetartalom mérését Lowry módszerével végeztük (BioRad, Hercules, CA, USA). 3.3. Eredmények A lizinnel kezelt csoportban 48 óra múlva 20%-os, a 7. nap végére 50%-os mortalitást észleltünk, szemben az arginines csoporttal (5%). Biokémiai vizsgálatok: A szérum amiláz szintek szignifikáns emelkedését észleltük 12 h után az I. csoportban, mely a kontroll csoport értékeihez képest ötszörös csúcsértéket 24h múlva érte el, korábban mint a II. arginines csoportban. Az ALAT szintek szignifikánsan magasabbak voltak a lizines csoportban a kezelést követo 12, 24 és 48 órával az argininines és kontroll csoporthoz képest, feltehetoen a lizin kifejezettebb hepatotoxikus hatása miatt. Az ASAT szintek szignifikáns emelkedést mutattak a lizines, az LDH szintek mindkét aminosavval kezelt csoportban, de az emelkedés ismételten nagyobb mértéku volt a lizinnel kezelt állatokban (1. táblázat). 22

1. táblázat: Szérum ASAT, ALATés LDH szintek nagy dózisú lizin intraperitonealis beadását követoen patkányban Amiláz U/l Lizin (n:32) 12 h 24 h 48 h 7 nap 5615 * 6230* 2350 1786?2812?2682?854?111 Arginin (n:20) 12 h 24 h 48 h 7 nap 2812 4687* 2750 1580?1813?2264?185?403 Kontroll (n:5) 1110?137 ASAT U/l 246,8* 480,6* 392,8 77,3 34,3?181,1?300,1?24,9 88,6 146,6* 119,6 66,8?8,9?54,2?60,6?6,34 88,8?14,5 ALAT U/l 82,5* 163,1* 350,0* 33,0?34,3?78,9?170,3?14,1 42,6 44,2 151,8 26,0?13,2?24,1?98,79?8,27 23,6?13,4 LDH U/l 569,8 2049* 1100* 268,3?210,4?1575?770,4?155,8 217,4 347,8 1282* 270?48,2?102,8?801,2?83,0 243?27,7 *p<0,05 a kontroll csoporthoz képest Tizenkét óra múlva a pancreas nedves súlya szignifikánsan nott a lizines csoportban, míg az arginines csoportban 24 h-val a kezelés után. Nem volt szignifikáns különbség a két csoport között 24 h elteltével (3. ábra). A pancreas enzimtartalma fokozatos csökkenést mutatott, az amiláz szint csökkenés 24 h múlva érte el a szignifikanciát az I csoportban, 48 h-kor a II. csoportban. Mindkét csoportban a legalacsonyabb aktivitás értékeket 48 h elteltével észleltünk (4/A ábra). A lipáz és tripszin aktivitás kisebb mértéku csökkenést mutatott, szignifikánsan alacsonyabb csak 48h múlva volt a lizines és 7 nap múlva az arginines csoportban, szemben a kontroll állatokban észlelt aktivitással. Mindkét csoportban a pancreas lipáz tartalma egy héttel az aminosavak beadása után volt a legalacsonyabb, de a tripszin aktivitás már ebben az idopontban emelkedést mutatott a lizinnel kezelt állatokban (4/B-C ábra). A fehérje tartalom maximális csökkenését egy hét múlva észleltük minkét csoportban (4/D ábra). 3. ábra Pancreas nedves súly kontroll % 200 100 0 * * * 12h 24h 48h 7.nap *p<0.05 a kontroll csoporthoz képest 23

4. ábra A) Pancreas amiláz tartalom 150 kontroll % 100 50 * ** ** * * lizin arginin 0 12h 24h 48h 7nap * p<0,05 és ** p<0,01 a kontroll csoporthoz képest B) Pancreas lipáz tartalom 200 kontroll % 150 100 50 * * * lizin arginin 0 12 h 24 h 48 h 7. nap C) * p<0,05 a kontroll csoporthoz képest Pancreas tripszin tartalom kontroll % 150 100 50 * * lizin arginin 0 12h 24h 48h 7.nap * p<0,05 a kontroll csoporthoz képest 24

D) Pancreas fehérje tartalom 200 kontroll % 150 100 50 * * * 0 12h 24h 48h 7.nap *p<0,05 a kontroll csoporthoz képest Szövettani elváltozások: A lizin kezelés következtében fokozottabb volt az oedema képzodés a perilobaris kötoszövetben, mint az arginines csoport állataiban, de nem érte el a szignifikáns szintet 12 h alatt. Az acinus sejtekben a degenerativ és nekrotikus eltérések súlyossága és kiterjedése szignifkánsan nott 24 h után (5./A-B-C). 5. ábra A) Szöveti oedema # átlagos pontszám 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 * * * * * * # lizin arginin 0,5 0 12h 24h 48h 7 days kontroll * p<0,05 kontrollhoz képest # p<0,05 csoportok között 25

B) Szöveti nekrózis átlagos pontszám 4 3,5 3 2,5 2 1,5 # # ** * * * # # 1 0,5 0 12h 24h 48h 7. nap * p<0,05 ** p<0,01 a kontrollhoz képest # p<0,05 a csoportok között kontroll C) Szöveti fibrózis # 3 * 2,5 átlagos pontszám 2 1,5 1 * * # * lizin arginin 0,5 0 12h 24h 48h 7. nap * p<0,05 kontrollhoz képest # p<0,05 a csoportok között kontroll Az acinussejtek nagy citoplazmatikus vakuolumokkal kisért kifejezett nekrózisa fokozatosan alakult ki 48 h alatt mindkét csoportban. A kezelést követo 7. napon a szöveti oedema és nekrózis jelentosen csökkent az atrophiara utaló eltérések megjelenésével. A pancreas sejtek regenerációja mellett enyhe oedema és kisfokú fibrotikus eltérések még észlelhetoek voltak mindkét csoportban (6./A-B-C-D ábra, appendix). 26

Intraperitonealis arginin adását követoen hasonló pancreas károsodást észleltünk, a nekrotikus elváltozások lassúbb megjelenése mellett (7/A ábra,appendix). Subtotalis atrophiát találtunk a kezelés után 1 héttel, kezdodo sejtregeneráció megjelenésével mellett (7/ B ábra, appendix). Elektronmikroszkópos elváltozások: Mind a lizinnel, mind az argininnel kezelt csoportban már 12 h múlva a zimogén granulumok számának csökkenését és a sejtmag degenerativ elváltozásait észleltük. Duzzadt, köralakú mitochondriumok voltak láthatók a feltöredezett kriszták mentén. Az endoplazmatikus retikulum (ER) dilatációja és vakuolizációja gyakori jelenség volt. Nagy, amorf részecskéket, feltehetoen szétesett sejtorganellumokat tartalmazó autophag vakuolumok jelentek meg 24 h múlva mindkét csoportban. A nagyfokú sejtnekrózis és degeneráció következtében az acinus sejtek teljes szétesését, a maradék sejtek kifejezett vakuolizációját észleltük 48 h-nál (8/A-B- C-D-E-F ábra, appendix). 3.4. Megbeszélés Nagy dózisú L-lizin intraperitonealis adásával, hasonlóan, mint az L-arginin bevitelével, súlyos nekrotizáló pancreatitis váltható ki. E két bazikus aminosav excessziv dózisával okozott destrukciót összehasonlítva, a lizin esetében a nekrotikus elváltozások kialakulása gyorsabb volt és kiterjedtebb, kifejezett korai oedema képzodéssel és a késobbiekben jelentos leukocyta infiltrációval járt. A lizines csoportban gyorsabban alakult ki a szérum amiláz szint emelkedése és korábban érte el a csúcsértéket. A szövettani és elektronmikroszkópos elváltozások nagyfokú hasonlóságot mutattak, mindkét csoportra jellemzo volt a kifejezett szöveti oedema mellett az acinus sejtek vakuolizációja, autophag granulumok megjelenése és a zimogén szemcsék számának csökkenése. Mindkét modellben az acinus sejtek membránkárosodását, az endoplazmatikus retikulum kiszélesedését és a mitokondriumok szerkezeti eltéréseit észleltük, végül sejtnekrózisra jellemzo elváltozások alakultak ki. Korábbi állatkisérletek során felmerült a kérdés, miért a pancreas acinus sejtjeit éri a károsodás. Izotóppal jelölt aminosavak beadásakor a pancreasban kifejezett aktivitást, az aminosavak akkumulálódását észlelték (85). 27

A pancreasban kialakult korai morfológiai elváltozások és LDH emelkedés alapján mindkét aminosav feltehetoen nem specifikus módon membránkárosodást, majd sejtnekrózist okoz, mely már az intraperitonealis beadást követoen 1 óra múlva is észlelheto volt korábbi EM vizsgálatokkal (86). A lizin és arginin kiváltotta hasnyálmirigy-gyulladásban észlelt vakuolumok másodlagos, autophag vakuolumok, melyekben szétesett sejtorganellumok láthatók. A jelentos intersticiális oedema, a gyulladásos sejtek infiltrációja viszont egy szupracellularis, kiszélesedett gyulladásos folyamatot igazol. A szövettani elváltozások sejtnekrózishoz és kifejezett atrophiahoz vezetnek. Középsúlyos pancreatitist követoen, a jelentos atrophia ellenére, már a kezelés után 1 héttel a regeneráció jelei figyelhetok meg. Munkacsoportunk korábbi vizsgálata során, a pancreas proenzimek acinus sejtkultúrában észlelt in vitro aktivációja alapján (87), e két aminosav által kiváltott károsodás létrejöttében alapveto szerepet játszhat pozitív töltésük. Ezek a bázikus aminosavak amino csoportjukkal a negativ töltésu, savas foszfolipidekkel reagálnak, így megváltozik a membránok töltése és permeabilitása. A bázikus aminosavak excesszív mértéku bevitele membránkárosodást kiváltva vezet a zimogén granulumok és lizozomalis enzimek kolokalizációjához, ami különösképpen érzékennyé teszi az emésztoenzimekben gazdag pancreas acinus sejteket, a pancreas jelentos károsodását okozva. Ennek következtében alakul ki a más szerzok által leírt reaktiv oxigén szabadgyök képzodés, a fokozott lipidperoxidáció és a proinflammatorikus citokinek felszabadulása (88,89). Eredményeink alapján a lizin és arginin által okozott pancreas károsodást döntoen az aminosavak fiziko-kémiai tulajdonságai okozzák. A korábbi kisérletek során észlelt korai mortalitás pédául ozmotikus hatásukkal magyarázható, mely a hirtelen beadást követoen hypotenziót, intracellularis folyadékcsökkenést, a vitális szervek súlyos károsodását, szívmegállást okoz. A bázikus aminosavak és más toxikus noxák kiváltotta pancreas modellek tanulmányozása és a patofiziológiai háttér felderitése lehetoséget nyújthat a pancreas gyulladásos megbetegedéseiben szerepet játszó tényezok vizsgálatára. 28