PhD (doktori) értekezés AZ OLIVOCOCHLEÁRIS RENDSZER ÉS A HALLÓPÁLYA ANATÓMIÁJÁRÓL SZERZETT ÚJABB ISMERETEK Dr. Horváth Miklós Témavezetok: Prof. Dr. Palkovits Miklós és Prof. Dr. Ribári Ottó Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskolája (7) Pathobiokémia Program (7/2) Programvezeto: Prof. Dr. Mandl József Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Z. Szabó László (elnök) Prof. Dr. Sziklai István Dr. Bánhegyi Gábor Opponensek (javaslat): Dr. Büki Béla Dr. Szirmai Ágnes Dr. Küstel Marianna (póttag) Bíráló bizottság (javaslat): Prof. Dr. Z. Szabó László (elnök) Prof. Dr. Pytel József Dr. Tamás László Budapest, 2003
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 1 1. 1. A cochlea afferens és efferens beidegzése. 1. 2. Az olivocochleáris rendszer. 1. 3. A hallópálya anatómiája. 1. 4. Leszálló kapcsolatok a hallópályában. 1. 5. Idegi kapcsolatok kialakulása a gerinces idegrendszerben. 1. 6. Neuronális plaszticitás, GAP-43. 1. 7. Az olivocochleáris rendszer és a hallópálya állatkísérletes kutatásának klinikai vonatkozásai. 2. Célkituzések 14 3. Módszerek 15 3. 1. Immunhisztológiai vizsgálatok patkány agymetszeteken a posztnatális fejlodés során. 3. 2. A cochlea mechanikus léziója és posztoperatív immunhisztológiai vizsgálatok felnott patkány agy metszetein. 3. 3. Neuronpályák jelölésére alkalmas módszerek, a jelen munka során alkalmazott jelöloanyagok. 3. 4. Fluoreszcens jelöloanyagok (diamidino yellow és fast blue) applikációja patkány belsofülbe és az azonos oldali ventrális cochleáris magba. 3. 5. Pseudorabies vírus injekciója tengerimalac cochleába. A vírus immunhisztológiai kimutatása agymetszeteken. 4. Eredmények 23 4. 1. A GAP-43 expresszió posztnatális változása az oliva superiorban és a cochleáris magban. 4. 2. Cochleáris lézió hatása az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziójára. 4. 3. Az olivocochleáris sejtek kettos jelölése fluoreszcens jelöloanyagokkal. 4. 4. Az olivocochleáris sejtek, a hallópálya és monoaminerg agyterületek jelölodése pseudorabies vírus intracochleáris injekcióját követoen. 5. Megbeszélés 60 5. 1. Az oliva superior és a cochleáris mag GAP-43 expressziója. 5. 2. Cochleáris lézió kiváltotta GAP-43 re-expresszió a laterális olivocochleáris sejtekben és a cochleáris magban. 5. 3. Az azonos oldali ventrális cochleáris magba kollaterálist adó olivocochleáris sejtek. 5. 4. Leszálló hallópálya: neuronlánc a hallókéreg és a cochlea között. 5. 5. A hallópálya kapcsolata monoaminerg agyterületekkel. 5. 6. Az eredmények klinikai jelentosége. 6. Következtetések 75 7. Köszönetnyilvánítás 77 8. Irodalomjegyzék 78 9. Saját közlemények jegyzéke 90
Rövidítések jegyzéke ABC = avidin-biotin komplex AuC = auditory cortex (hallókéreg) AVCN = anteroventral cochlear nucleus (anteroventrális cochleáris mag) Aq = aqueductus cerebri BDA = biotinilált dextrán amin CB = cerebellum (kisagy) cg = central gray (központi szürkeállomány) CGRP = calcitonin gene related protein (calcitonin gén asszociált fehérje) CTB = cholera toxin B alegység DAB = diamino benzidine DCN = dorsal cochlear nucleus (dorzális cochleáris mag) DR = dorzális raphe mag DY = diamidino yellow FB = fast blue GABA = gamma-amino-butyric acid (gamma-amino-vajsav) GAP-43 = growth-associated protein-43 (növekedés-asszociált fehérje 43) GC = growth cone (növekedési kúp) HRP = horseradish peroxidase (tormaperoxidáz) IC = colliculus inferior lfp = fasciculus longitudinalis LC = locus coeruleus LL = lemniscus lateralis LOC = lateral olivocochlear cell (laterális olivocochleáris sejt) LSO = lateral superior olive (az oliva superior laterális magja) ml = molecular layer (molekuláris réteg) MGB = medial geniculate body (corpus geniculatum mediale) MOC = medial olivocochlear cell (mediális olivocochleáris sejt) MSO = medial superior olive (az oliva superior mediális magja) MNTB = medial nucleus of the trapezoid body (a trapéztest mediális magja) MVN = mediális vesztibuláris mag
N5 = nucleus tractus spinalis nervi trigemini n7 = nervus facialis n8 = nervus vestibulocochlearis NCAM = neural cell adhesion molecule (idegi sejtadhéziós molekula) PHA-L = phaseolus vulgaris leucoagglutinin Pn = hídmagvak POD = postoperative day (posztoperatív nap) PR = dorzális raphemag hídi szakasza PRV = pseudorabies vírus PRV-Ba = pseudorabies vírus Bartha törzse pt = pyramidal tract (piramispálya) PVCN = posteroventral cochlear nucleus (poszteroventrális cochleáris mag) RPO = rostral periolivary nucleus (rosztrális perioliváris mag) SC = colliculus superior SOC = superior olivary complex (oliva superior magkomplexum) SPO = superior periolivary nucleus (felso perioliváris mag) SubC = subcoeruleus area SyPhy = synaptophysin stt = tractus spinalis nervi trigemini tb = trapezoid body (trapéztest) VCN = ventral cochlear nucleus (ventrális cochleáris mag) VNTB = ventral nucleus of the trapezoid body (a trapéztest ventrális magja) Az anatómiai struktúrák elnevezése és helyesírása során Szentágothai és Réthelyi (1985) Funkcionális anatómia címu tankönyvét tekintettem irányadónak. Az egyéb latin és angol kifejezéseket mindig lefordítva, magyarosan igyekeztem írni. Ettol csak akkor tekintettem el, ha a fordítás eroltetett, a gyakorlatban nem használatos kifejezést eredményezett volna. A helyesírás szempontjából az MTA Helyesírási Tanácsadó Szótárát tekintettem irányadónak.
1. Bevezetés 1. 1. A cochlea afferens és efferens beidegzése A hallás élettanában kulcsszerepet játszik a cochleában, a membrana basilarison elhelyezkedo Corti-szerv. A Corti-szervet receptorsejtek (külso és belso szorsejtek), valamint támasztósejtek (Deiters, Hensen, Claudius) alkotják (1. ábra). Békésy György a cochlea muködésérol alapveto felfedezést tett, megalkotta a haladó hullám elméletet (16). Eszerint a stapestalp elmozdulása az ovális ablakban a membrana basilarison keresztül ható szinuszoid nyomásgrádienst hoz létre. A keletkezo hullám karakterisztikus, frekvenciaspecifikus helyén a hullám energiáját a membrana basilaris absorbeálja. A haladó hullám burkoló görbéjének amplitúdómaximuma annál közelebb van a cochlea csúcsához, minél alacsonyabb az akusztikus stimulus frekvenciája. A cochlea ezen hidrodinamikai viselkedése az alapja a frekvencia-diszkrimináció képességének. Békésy György a kísérleteit cadaver cochleákon végezte. Az élo fülben a membrana basilaris hullámmozgása megjelenésében hasonló a haladó hullámhoz, attól azonban minoségileg és mennyiségileg is jelentosen különbözik: sokkal élesebben hangolt és kifejezetten nonlineáris. Ennek alapja a külso szorsejtek azon speciális képessége, hogy elektromos ingerlés hatására a hallás frekvenciatartományában rövidülnek és megnyúlnak (34). Ez a jelenség a mechanoelektrikus transzdukció. Újabban Zheng és munkatársai az összehúzódásért felelos proteineket is izolálták (206). Az aktív összehúzódás kísérojelensége és bizonyítéka az otoakusztikus emisszió (82), melyet a klinikai gyakorlatban is kiterjedten alkalmazunk. Legújabb ismereteink szerint a belso szorsejtek a tulajdonképpeni receptorsejtek, míg a külso szorsejtek cochleáris erosítoként muködnek (46, 205). Spoendlin munkássága nyomán vált világossá, hogy a belso és a külso szorsejtek afferens és efferens beidegzése alapvetoen különbözo (158). A ganglion spirale sejtjeinek 95 %-a a belso szorsejtekkel áll kapcsolatban és azok gazdag afferens beidegzését adja. A külso szorsejtek afferens beidegzésében csak a ganglion spirale maradék 5%-át kitevo veloshüvely nélküli neuronok vesznek részt (2. ábra).
1. ábra. A membrana basilarison elhelyezkedo Corti-szerv felépítése. A szorsejtek sejttestjei a perilymphához hasonló Corti-lymphában helyezkednek el, a stereociliumok az endolymphába nyúlnak (122). 2. ábra. A belso és a külso szorsejtek jelentosen különbözo afferens beidegzésének vázlata (122).
A szorsejtek efferens beidegzése ezzel ellentétes: a külso szorsejteken számos efferens rost képez szinapszist, míg a belso szorsejtek efferens beidegzése szegényes, a sejttesteken nem, csak posztszinaptikusan, az afferenseken található efferens szinapszis (3. ábra). Ez a beidegzési mintázat is alátámasztja a külso és belso szorsejtek alapvetoen eltéro funkcióját. 3. ábra. A cochleáris szorsejtek efferens beidegzési mintázata. A mediális olivocochleáris sejtek a külso szorsejteken, a laterálisok a belso szorsejtek afferensein képeznek szinapszisokat (157). 1. 2. Az olivocochleáris rendszer A szorsejtek efferens beidegzését adó sejtek perikaryonjai az agytörzsben a nyúltvelohíd határán levo oliva superiorban találhatók. Rassmussen említette eloször ezt a központi idegrendszer és a cochlea közötti leszálló kapcsolatot és olivocochleáris rendszernek nevezte el (120). Az olivocochleáris sejtek axonjainak anatómiáját a cochlea szintjén Spoendlin írta le eloször (158), majd White és Warr 1983-ban feltárták, hogy az olivocochleáris sejtek két nagy csoportra oszthatók (197). Az oliva superior laterális magvában (LSO) helyezkednek el a kicsiny (10-15 µm átméroju), fuziformis
laterális olivocochleáris neuronok (LOC), melyeknek veloshüvely nélküli rostjai a cochleában a belso szorsejtek afferenseihez futnak. Mediálisabban, a corpus trapezoideum ventrális magvában és periolivárisan találhatók a nagyobb átméroju (20-25? m), multipoláris mediális olivocochleáris sejtek (MOC), melyek veloshüvelyes rostjai a cochleában a külso szorsejteket idegzik be (4. ábra). 4. ábra. A mediális és laterális olivocochleáris sejtek és pályák anatómiája vázlatosan. A mediális olivocochleáris sejtek nagyobb része keresztezodik, míg a laterális olivocochleáris sejtek foleg az azonos oldali cochleába projiciálnak (187). Az efferens neurotranszmitter az acethylkolin és a GABA, de egyéb neuraktív anyagok (pl. CGRP, dopamin, enkephalin, nitrogénmonoxid) szerepét is feltételezik újabban. Számos tanulmány keretében analizálták az olivocochleáris sejtek elhelyezkedését és számát (10, 181, 188). Kiderült, hogy az egyes állatfajok között eltérések vannak, de minden emlosben felismerheto a laterális és a mediális olivocochleáris rendszer. Újabban Vetter és munkatársai a LOC sejteket elhelyezkedésük és dendritikus morfológiájuk alapján két alcsoportba osztották (182). A kicsiny, fusiformis, az oliva superior laterális magvában elhelyezkedo LOC sejtek mellett leírták a mag körül kagyló alakban elhelyezkedo, nagyobb, multipoláris, úgynevezett kagyló sejteket is. A nemzetközi irodalomban számos, különbözo állatfajokat vizsgáló közlemény foglalkozott már az olivocochleáris sejtek kollaterálisainak kérdésével. A következtetések azonban nem egyértelmuek, az egyes állatfajok közt különbségek
mutatkoznak. Ryan és munkatársai szerint a LOC sejtek a ventrális cochleáris mag centrális részébe, a MOC sejtek pedig a ventrális cochleáris mag perifériás területeibe adnak axon kollaterálist (139). Brown és Benson szerint a LOC sejteknek nincsenek kollaterálisai, míg a MOC sejtek nagy része kollaterálist ad a ventrális cochleáris magba (32). Winter és munkatársai eredményei alapján csak a MOC sejtek 3-9 %-a ad axon kollaterálist a ventrális cochleáris magba (200). White és Warr tormaperoxidázt (HRP) használtak retrográd neuronális tracerként. A cochleába adott tormaperoxidáz kimutatható volt az olivocochleáris sejtek nagy részében és azok axon lefutását követve fedezték fel, hogy a sejtek egy része kollaterálist ad a dorzális és a ventrális cochleáris magba (197). Nehezen vizsgálható és kevéssé ismert, hogy mely agyterületek sejtjei képeznek szinapszist az olivocochleáris sejteken (172). Az oliva superiorba adott tracereket nemcsak az olivocochleáris sejtek veszik fel, hiszen azok a magcsoport elenyészoen kicsiny részét alkotják csak. Retrográd terjedo jelöloanyag intracochleáris és anterográd úton terjedo tracer egyéb agyi magba történo injekciójának kombinációjával lehetové vált az olivocochleáris sejtek és a rajtuk szinapszist alkotó axonok identifikálása. Faye- Lund, valamint Vetter és munkatársai kimutatták, hogy a colliculus inferior sejtjeinek axonjai a MOC sejteken képeznek szinapszisokat (55, 183). Az ellenoldali poszteroventrális (168) és anteroventrális (210) cochleáris mag sejtjei is szinapszisokat alkotnak az olivoohleáris sejtek egy részén. Feliciano és munkatársai, valamint Weedman és Ryugo kimutatták, hogy a hallókéreg egyes sejtjeinek axonjai az olivocochleáris sejteken végzodnek (56, 193, 194). Immunhisztokémia és neuronpályajelölés kombinációját alkalmazva újabban sikerült feltárni, hogy az olivocochleáris sejtek felszínén szerotoninerg és noradrenerg szinapszisok is vannak (106, 107, 170). Mindezek ellenére az olivocochleáris sejtek centrális kapcsolatainak mibenléte nem kelloen tisztázott. Az olivocochleáris sejteknek a hallás élettanában és pathológiájában játszott szerepe intenzív kutatások tárgya. A keresztezodo, mediális efferens rostok elektromos stimulációja a 4. agykamra ventrális felszínén gátolja a hallóidegen regisztrálható, clickinger által kiváltott akciós potenciált (59). Ezzel szemben zajos környezetben az efferens rostok ingerlése növeli a hallóideg click-inger kiváltotta akciós potenciálját (110). Ez arra utal, hogy a mediális efferenseknek a zaj maszkoló hatásának
csökkentésében lehet szerepük. A mediális efferensek elektromos stimulációja ugyanakkor növeli a cochleáris mikrofonpotenciál amplitúdóját (úgynevezett MOCpotenciál ). A nem keresztezodo laterális efferens rostok stimulációja szintén gátolja a hallóideg click-inger kiváltotta akciós potenciálját, a cochleáris mikrofonpotenciált azonban nem befolyásolja (57). Újabb megfigyelések szerint a mediális olivocochleáris efferensek befolyásolják az otoakusztikus emissziót és a cochleáris erosítoként muködo külso szorsejtekre hatva a cochlea szenzitivitását is (28, 34, 47). Az ipszilaterális és kontralaterális akusztikus stimuláció hatással van a hallóideg akciós potenciáljára és az otoakusztikus emisszióra is: ez az úgynevezett olivocochleáris akusztikus reflex (67). A mediális olivocochleáris efferensek részben bizonyított és részben feltételezett élettani hatásai a következok: 1. A hallás dinamikai tartományának növelése (átlagosan 70 db-rol 90 db-re). 2. A környezeti zajok maszkoló hatásának csökkentése (a hallás javítása zajos környezetben). 3. Részvétel a szelektív figyelem kialakításában (pl. a hallóideg aktivitásának csökkentése intenzív vizuális inger esetén). 4. A szorsejtek védelme az eros zajok károsító hatása ellen (ez a szerep vitatott és csak 10 khz körüli zajok esetén érvényesül). A laterális olivocochleáris rendszer élettani szerepe kevésbé tisztázott. Valószínuleg a hangok lokalizációjában vesz részt, valamint hozzájárulhat a zajok szorsejtkárosító hatásainak csökkentéséhez (67). 1. 3. A hallópálya anatómiája A VIII. agyideg (nervus vestibulocochlearis) pars cochlearisának elsodleges érzo neuronjait tartalmazó dúc a ganglion spirale, mely a cochleában a canalis spiralis modioliban helyezkedik el (165). A ganglion spirale sejtjei bipolárisak, disztális nyúlványaik a lamina spiralis ossea finom csatornácskáin keresztül jutnak el a membrana basilaris fölé és spirális lefutás után érik el a szorsejteket, melyeken végzodnek. Centrális nyúlványaik képzik a nervus vestibulocochlearis pars cochlearisát. Az elsodleges hallóneuronok centrális nyúlványai a pedunculus cerebellaris inferior laterális részén tangenciálisan hatolnak be a nyúltvelo-híd átmenetbe. Itt minden rost mediál felé lead egy ágat a pedunculus cerebelláris inferiorba ventrolaterálisan beékelodo ventrális cochleáris magba. A rostok nagy része tovább futva dorsal felé körülhalad a pedunculus cerebellaris inferior felületes rétegein és kehely alakú szinapszisokkal végzodik a dorzális cochleáris magban. A másodlagos neuronok a
dorzális cochleáris magból mediál felé futnak, majd keresztezodnek és az ellenoldali oliva superiorban végzodnek. A ventrális cochleáris magból induló másodlagos rostok foleg az azonos oldali oliva superiorban végzodnek. Az oliva superior egy magkomplexum, mely laterális és mediális magból áll, de ide sorolják a trapéztest mediális, ventrális és laterális magját, valamint a környezo úgynevezett perioliváris sejteket is. 5. ábra. A felszálló hallópálya anatómiája sémásan (122) Az oliva superiorból eredo harmadlagos rostok a corpus trapezoideumban keresztezodnek, ill. a már keresztezett dorzális cochleáris magból származó rostok által hozott információt közvetíto harmadlagos rostok nem keresztezodve hatalmas felszálló pályát, a lemniscust lateralist alakítják ki. Ez a híd-középagyi határon kívülrol megkerüli a pedunculus cerebellaris superiort, majd egészen felületessé válik (trigonum lemnisci). Itt két közbeiktatott mag (a lemniscus lateralis dorzális és ventrális magja) helyezkedik el, melyekben azonban csak a harmadlagos rostok mellékágai végzodnek. Végül az egész pálya a colliculus inferiorban végzodik. A colliculus inferiorból eredo negyedrendu neuronok a brachium colliculi inferiorisban haladva a corpus geniculatum medialéba vezetnek. Az utolsó-ötödrendu-neuronok a corpus geniculatum mediáléból az
elsodleges kérgi hallómezohöz jutnak (radiatio acustica). A felszálló pályák nagy része tehát keresztezodik, de a hallószervbol boséges vezetés van a saját oldali hallókéreg felé is (138, 165). Az 5. ábra a felszálló hallópálya anatómiáját ábrázolja sémásan. 1. 4. Leszálló kapcsolatok a hallópályában A hallópálya minden szintjén vannak leszálló neuronok, amelyek révén a magasabb szint mintegy kontrollálja a felfelé vezetett információ továbbítását (185). Spangler és Warr 1991-es átfogó közleménye ad képet a leszálló (efferens) hallópályáról, melynek végso közös pályája az olivocochleáris rendszer (157). A hallókéregnek számos efferens, leszálló kapcsolatát írták le (6. ábra, 8, 51, 70, 83, 140), valamint a hallópálya subcorticalis magvaiból is több leszálló pálya veszi kezdetét (75, 80). 6. ábra. A hallókéreg leszálló kapcsolatainak vázlata az agy szagittális metszetén (140). A corpus geniculatum mediáléból a colliculus inferiorhoz futó rostok mellett (75) leírtak a colliculus inferiorból az agytörzsi auditorikus magokhoz futó rostokat is (55, 183). A hallópálya leszálló kapcsolatainak funkciója nem teljesen ismert. Egyes feltételezések szerint a hallókéregtol a cochleáig tartó egységes efferens rendszernek tekintheto (167, 209), míg mások szerint a leszálló hallópálya egymással laza kapcsolatban álló regionális feedback körök láncolata (50, 157). 1. 5. Idegi kapcsolatok kialakulása a gerinces idegrendszerben.
A különbözo etiológiájú halláscsökkenések az otoakusztikus emisszió és az agytörzsi kiváltott válasz segítségével már újszülött korban diagnosztizálhatók és a betegek hallókészülék, illetve cochleáris implantátum segítségével rehabilitálhatók (123). Megfigyelték, hogy a korai rehabilitáció eredményei sokkal jobbak, mint a késon alkalmazott hallókészülékkel vagy cochleáris implantátummal elérheto hallás és beszédértés (104). A hallórendszer fejlodése során vannak olyan idoszakok, amikor különösen fontos a megfelelo szenzoros input (54, 134, 136). Munkám során a hallópálya fejlodésének, plaszticitásának egyes aspektusait is vizsgáltam, ezért a következokben röviden áttekintem az idegi kapcsolatok kialakulásával és a neuronális plaszticitással kapcsolatos alapfogalmakat. A gerinces idegrendszerben a neuronok közötti kapcsolatrendszer kialakulásának bonyolult folyamata nagy vonalakban öt jól elkülönítheto, finoman koordinált fázisból áll (166): 1. Axonképzodés és axonnövekedés a célsejt irányába. Az idegi nyúlványok (axonok és dendritek) az úgynevezett növekedési kúp (growth cone = GC) segítségével növekszenek. A GC az idegnyúlvány végén egy kiterjesztett tenyérhez hasonló képlet, ami csak akkor fejlodik ki, ha a nyúlvány megfelelo kapcsolatban van valamilyen szubsztráttal. A GC irányítását a neuron környezetében, az extracelluláris mátrixban elhelyezkedo molekulák, a környezo sejtek membránjához kötött fehérjék (sejtadhéziós molekulák), valamint a GC közelében felszabaduló kismolekulájú diffuzibilis faktorok (neurotranszmitterek, növekedési faktorok) irányítják. Ugyanazon ingerkombinációra a különbözo GC-k receptorkészletüktol függoen eltéroen reagálhatnak. Egyesek irányt változtatnak, mások elágaznak vagy egyenes irányban folytatják útjukat. A receptorok az általuk felvett információt a citoplazmatikus oldalra továbbítják, ahol másodlagos hírvivo rendszereket (camp, Ca 2+, protein kináz C) aktiválnak. 2. A megfelelo célsejt kiválasztása az axonok által. Amikor az axon növekedése során a célsejtrégióba érkezik, megváltozik a sejtadhézió erossége. Ezt elsosorban sejtadhéziós molekulák (neural cell adhesion molecule = NCAM) és antiadhéziós hatások (pl. az adhéziós molekulákhoz kötodo polisziálsav) szabályozzák. 3. Kezdetleges szinaptikus kapcsolatok és struktúrák kialakítása. A specifikus sejt-sejt kapcsolatok kialakulásának elso lépése a szinaptikus partnerek kölcsönös felismerése. Ezt követi a pre- és posztszinaptikus struktúrák kialakulása. Egyes megfigyelések arra
utalnak, hogy a célsejtterületen belül a szinapszisok kialakulása nem elore eldöntött, hanem próba-szerencse alapon történik. Ez a folyamat az úgynevezett kritikus periódus. Ezt elsosorban a látókéreg kialakulásánál vizsgálták (198). A kritikus periódus azt jelenti, hogy az idegvégzodés és a célsejt között a dialógus ekkor a legintenzívebb és a környezetbol származó információ (hatás) ekkor a leghatékonyabb (54, 58). A preszinaptikus idegvégzodés és a posztszinaptikus sejt belso program alapján elore rendelkeznek a leendo szinapszis elemeinek a nagy részével (neurotranszmitter termelés és felszabadítás a preszinaptikus oldalon és neurotranszmittert felismero receptorok szintetizálása és a membránban való megjelenése a posztszinaptikus oldalon). Ezekbol az elemekbol áll össze a muködo szinapszis a pre- és posztszinaptikus sejt-sejt kapcsolat által aktivált antero- és retrográd jelzések hatására. 4. Pontatlan és felesleges szinaptikus kapcsolatok felszámolása, ezzel párhuzamosan szükségtelen axon- és dendritágak, valamint neuronok kiiktatása. A felesleges szinapszisok eltávolítása javítja a posztszinaptikus sejt plasztikus alkalmazkodó, kapcsolatkialakító képességét a késobbiekben. 5. A végleges szinaptikus kapcsolatok funkcionális megerosítése. Az emlos idegrendszerben a fejlodés során eloször kialakult idegi kapcsolatrendszer csak megközelítése a végleges formának. A neuronhálózatok összehangolt, hatékony muködéséhez további finomításra, átrendezésre, bizonyos szinapszisok megerosítésére, mások leépítésére van szükség. Ehhez a folyamathoz a már kapcsolatban levo neuronok együttes elektromos aktivitása is szükséges. Az akciós potenciálok idozítése kritikus tényezo egyes szinaptikus összeköttetések megerosödésében, illetve mások kiküszöbölésében. 1. 6. Neuronális plaszticitás, GAP-43 Neuronális plaszticitáson sokféle jelenséget értenek. Egyesek az idegrendszer fejlodése közben mutatkozó változásokat, mások az idegi sérüléseket követo regenerációt, ismét mások kondicionálási, tanulási folyamatokat neveznek így. Mindezeket lefedo meghatározás, hogy a neuronális plaszticitás az idegrendszer többé-kevésbé tartós adaptív változásokra való képessége (166). Ma már nyilvánvaló, hogy az idegrendszer
plaszticitása nem korlátozódik a születés utáni kritikus fejlodési szakaszra. Az idegrendszer felnottkorban is komoly plaszticitással rendelkezik (113). Az idegi kapcsolatok kialakulásában és a neuronális plaszticitásban számos extra- és intracelluláris molekula vesz részt. Az egyik legjelentosebb a growth-associated protein- 43 (GAP-43, régebbi nevei: B-50, F1, pp46, P-57, neuromodulin). A GAP-43 az ontogenezis során növekvo axonok és a növekedési kúp membránjának citoplazmatikus oldalán elhelyezkedo foszfoprotein (66, 100, 155). A növekedési kúpban a protein kináz C legfobb szubsztrátuma a GAP-43 (102), amely kulcsszerepet tölt be az axonok kialakulásában és a növekedési kúp célsejtrégió felé vándorlásában (177). A GAP-43 nem idegi típusú sejtekben is filopodium képzodést indít el (208). Axonsérülését követoen a GAP-43 expressziója fokozódik a perikaryonban és a regeneráció során gyors axonális transzport segítségével jut a sérülés helyére (17, 71, 147, 153, 154, 178). Számos kutató immunhisztológiai módszerrel vizsgálta a GAP-43 immunreaktivitást az agy ontogenezise során (48, 49, 99). Az idegnyúlványok képzodése és növekedése során intenzív GAP-43 immunrektivitás detektálható az axonok egész hosszában. Ez az intenzív axonális immunreaktivitás a szinaptogenezis során csökken és ekkor a GAP-43 döntoen a neuropilban, a szinaptogenezis és szinapszis-stabilizáció helyszínén található. Itt, a neuropilban a GAP-43 immunfestodés a szinaptogenezis kritikus periódusának és a szinapszis-stabilizációnak a végéig intenzív, majd fokozatosan csökken. Felnott állatok agyában csak minimális GAP-43 festodést találtak, elsosorban a plasztikus, remodellizációra képes rostrális agyi területeken (48, 109). Az ontogenezisben betöltött szerepe mellett a GAP-43 a neuronok adaptív változásokra adott reakcióiban is résztvesz. Axotomizált szenzoros (142) és motoros rostokban (116) nagymértékben megno a GAP-43 expresszió. Felnott állatok központi idegrendszerében szinaptikus reorganizáció kapcsán emelkedett GAP-43 immunfestodést találtak (62, 161). Collingridge és Bliss (1995) bizonyították a GAP-43 részvételét a tanulás és a memória sejtszintu folyamataiban (42, 60 95, 96). Mindezek alapján a GAP-43 az axonogenezis, a szinaptogenezis és a neuronális plaszticitás egyik legspecifikusabb markerének tekintheto. Jelen munka egyik célkituzése volt a GAP-43-expresszió meghatározása a hallópálya magvaiban az ontogenezis során és cochlea léziót követoen.
1. 7. Az olivocochleáris rendszer és a hallópálya állatkísérletes kutatásának klinikai vonatkozásai Cochleáris eredetu halláscsökkenés, fülzúgás Az emberi cochlea a temporális csontban rendkívül rejtetten helyezkedik el. A cochleáris struktúrák finom volta, a szövettani vizsgálat in vivo kivihetetlensége a cochlea megbetegedéseinek kutatását rendkívül megnehezíti. A különbözo károsító behatásokra a cochlea meglehetosen egyhangú válaszokat produkál, halláscsökkenés, fülzúgás jön létre. Ezen tényezok miatt a cochlea megbetegedéseinek anatómiai és élettani alapjai nem teljesen tisztázottak. Állatkísérletetes vizsgálatok alapján felteheto, hogy a különbözo, a cochleát károsító tényezok (genetikai eltérések, ototoxikus anyagok, zaj, hormonális eltérések, traumák, infekciók) elsosorban a szorsejteket, a ganglion spiralet és a cochlea homeostasisát károsítják. Újabb megfigyelések szerint azonban a szorsejtek efferens beidegzésének károsodása is jelentos tényezo a halláscsökkenés és a fülzúgás kialakulásában (119, 184). Az olivocochleáris rendszer anatómiájának pontosabb megismerése így alapvetoen hozzájárulhat a hallás élettani és kóros muködésének megértéséhez. Cochleáris implantáció Az utóbbi 15 évben terjedt el világszerte a cochleáris implantáció, melynek lényege a süket, illetve súlyosan nagyothalló gyermekek és felnottek hallásrehabilitációja a cochleába ültetett implantátum segítségével (123). A készülék egy külso mikrofonból és peszédprocesszorból, valamint egy belso egységbol áll, melynek elektródáját a cochleába vezetjük (93). Az elektróda segítségével a készülék elektromosan ingerli a ganglion spirale sejtjeit és ez hangélményt vált ki. Az új eljárás számos olyan kérdést vet fel, melyek részben állatkísérletek segítségével válaszolhatók meg. Megfigyelték, hogy süket gyermekek esetében a korai cochleáris implantációval jobb hallás- és beszédfejlodés érheto el, mint késoi mutét esetén (104). A jelenlegi álláspont szerint 2-3 éves korban elvégzett implantáció esetén várható a legjobb eredmény. Késobb, a beszédmegértés szempontjából kritikus idoszak után már nem alakul ki jó beszédértés az implantátummal. Klinikai szempontból is érdekes a hallópálya fejlodésének, a szinapszisok kialakulásának állatkísérletes kutatása. Felnottkorban kialakult süketség esetén a cochleáris implantációval kiváló hallás- és beszédértés érheto el (118). Kivételes esetekben veleszületett süketek felnottkori implantációja is sikeres volt. E
megfigyelések arra utalnak, hogy a hallórendszer felnottkorban sem veszti el teljesen plaszticitását. A neuronális plaszticitás állatkísérletes kutatása is hozzájárulhat a klinikai tapasztalatok jobb értelmezéséhez és az implantációs stratégia továbbfejlesztéséhez. Ribári és munkatársai (124) felfedezték, hogy egyes betegeknél a cochleáris implantáció után az ellenoldalon is hallásjavulás alakul ki. Ez a hallásjavulás olyan mértéku lehet, hogy hallókészülék használata is lehetové válhat és bizonyos esetekben szükségtelenné teheti a kétoldali cochleáris implantációt (125). E jelenség jobb megértéséhez is hozzájárulhat a hallórendszer plaszticitásának, valamint az afferens és az efferens hallópálya anatómiájának alaposabb megismerése. Agytörzsi implantáció Kétoldali hallóideg daganat esetén kialakult süketségben újabban lehetoség van úgynevezett agytörzsi implantációra (76). Az agytörzsi implantáció során egy, a cochleáris implantációhoz hasonló elven muködo készüléket ültetnek be, melynek lapszeru elektródáját a cochleáris magra helyezik (89). Az elektróda segítségével a cochleáris mag sejtjei direkt úton ingerelhetok, mely a felszálló hallópálya aktiválódásához vezet. Nem kelloen tisztázott azonban, hogy a hallóideg pusztulása ill. mutéti eltávolítása milyen központi idegrendszeri változásokhoz vezet. Állatkísérletek segítségével tisztázható, hogy a cochlea vagy a hallóideg léziója milyen reakciókat, molekuláris és anatómiai változásokat vált ki a hallópálya magvaiban és a hallókéregben. 2. Célkituzések A jelen dolgozat alapját képezo állatkísérletek során az olivocochleáris rendszer és a hallópálya anatómiájának, fejlodésének egyes aspektusait kutattuk. Vizsgáltuk továbbá, hogy a cochlea mechanikus léziója hatással van-e a cochleáris mag és az oliva superior GAP-43 expressziójára. 1. Célul tuztük ki, hogy kimutassuk az axonogenezisben és a szinaptogenezisben kulcsszerepet betölto GAP-43-at az oliva superiorban és a cochleáris magban patkányban. Vizsgálni kívántuk, hogy miként változik a GAP-43 expressziója ezen magvakban a születés utáni kritikus periódusban és kimutatható-e felnottkorban.
2. A cochlea mechanikus léziója révén megszüntettük a periféria felol az agytörzsbe jutó auditorikus inputot, elpusztítottuk a ventrális cochleáris magba projiciáló ganglion spirale sejtjeit, valamint axotomizáltuk az olivocohleáris sejteket. Célul tuztük ki, hogy immunhisztológiai vizsgálatokkal igazoljuk a hallóideg rostok degenerációját, valamint meghatározzuk a GAP-43 expresszióban a cochlea mechanikus léziójának hatására létrejövo változásokat az oliva superiorban és a cochleáris magban. 3. Célul tuztük ki, hogy fluoreszcens jelöloanyagok segítségével feltérképezzük a cochleába projiciáló olivocochleáris sejteket. Két különbözo jelöloanyag egyideju beadásával és kimutatásával vizsgálni kívántuk, hogy az olivocochleáris sejtek adnak-e axon kollaterálist a hallópálya elso átkapcsoló állomásaként muködo ventrális cochleáris magba. 4. A retrográd transzportálódó és transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírus intracochleáris injekciója és immunhisztológiai kimutatása révén meg kívántuk határozni, hogy fertozheto-e a tengerimalac agy a cochlea felol. Célul tuztük ki, hogy különbözo túlélési idoket követoen feltérképezzük a retrográd terjedo pseudorabies vírus által fertozött agyterületeket. A túlélési idok helyes megválasztásával meg kívántuk határozni a vírus által a cochlea felol megfertozött primér, szekundér és tercier neuronok elhelyezkedését. 3. Módszerek Az értekezés eredményei és következtetései állatkísérleteken alapulnak. Az állatkísérletek során összesen 75 patkányt és 17 tengerimalacot használtunk fel. Az állatok gondozása, érzéstelenítése, mutétjei és leölése során mindvégig betartottuk a vonatkozó törvényeket és rendeleteket, valamint az Európa Tanács 1986 november 26- án nyilvánosságra hozott irányelveit (86/609/EEC). 3. 1. Immunhisztológiai vizsgálatok patkány agymetszeteken a posztnatális fejlodés során
A cochleáris magok és az oliva superior GAP-43 expressziójának posztnatális vizsgálata céljából patkányokat tenyésztettünk és születésük után különbözo életkorban leöltük oket. Összesen 30 patkány agyát vizsgáltuk. A patkányok születéstol számított (posztnatális) életkorát napokban kifejezve P betuvel jelöljük. A legfiatalabb állatokat (P0: 3 db; P1: 1 db; P2: 1 db; P4: 3 db; P6: 1 db; P8: 1 db; P10: 1 db; P12: 1 db; P14: 1 db; P16: 1 db) barbiturát halálos adagjával altattuk el. Az állatok agyát gyorsan eltávolítottuk és jéghideg fixáló oldatba helyeztük. Az oldat összetétele 0.1 M-os foszfát pufferben oldott paraformaldehyd (4%), glutáraldehyd (0,1 %) és pikrinsav (15%) volt. Az agyak immerziós fixálása 3 napig tartott. A kicsit nagyobb patkányokat (P4: 1 db; P8: 2 db; P12: 3 db; P16: 2 db; P21: 1 db; P28: 1 db; P35: 1 db; P42: 2 db; P50: 1 db; P120: 2 db) Nembutal (Abbott, North Chicago, USA) halálos adagjával öltük le, majd transzkardiálisan perfundáltuk a fenti összetételu, 4 C o -os fixáló oldat 1 literjével. A perfúziót követoen kipreparáltuk a patkányok agyát. A fixálást követoen az agyakat 0,1 M-os foszfát pufferben oldott 25 %-os szukróz oldatba helyeztük egy éjszakára. Ezután kriosztát segítségével 30 mikrométer vastag frontális és szagittális agymetszeteket készítettünk. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 0,05% H 2 O 2 -ben, 30 percig 1 %-os tejporban, végül 30 percig 10 %-os marhaszérum és 0,05%-os Triton X-100 oldatában úsztattuk a metszeteket. A GAP-43 immuncitokémiai kimutatásához egérben eloállított primér antitestet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) és egér elleni, biotinilált szekunder antitestet (Vector Laboratórium, Burlingame, USA) használtunk. A metszeteket 72 óráig inkubáltuk 4 C o -on a primér antitestet tartalmazó oldatban (1 : 5000; 0,1? gramm/ml). Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotinperoxidáz komplex oldatába helyeztük (74). A peroxidázzal történt jelölést 0,05 % diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) és 0,3 % ammoniumnikkel-szulfátot tartalmazó 0,1 M-os Tris pufferrel és 0,0015% H 2 O 2 -vel tettük láthatóvá. Az inkubációs ido 3 perc volt. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést.
A kísérletek során ügyeltünk arra, hogy az eredményeket esetleg befolyásoló tényezok (inkubációs idok, homérséklet, oldatok koncentrációja) konstansak legyenek. Az azonos korú immerziós és perfúziós módszerrel fixált agyak (P4, P8, P12 és P16) összehasonlítása arra utalt, hogy a fixálási módszer a GAP-43 immunreaktivitás jellegét nem, de intenzitását minimális mértékben befolyásolta. 3. 2. A cochlea mechanikus léziója és posztoperatív immunhisztológiai vizsgálatok felnott patkány agy metszetein. A cochlea machanikus léziója A cochlea mechanikus léziója által kiváltott hatások vizsgálatára 29 felnott patkányt használtunk. Az állatokat Ketanest (100 mg/kg, Parke-Davis, USA) és Rompun (5mg/kg, Bayer Leverkusen, Németország) injekciójával altattuk el. A bal fülkagyló mögötti, retroauricularis metszés után kipreparáltuk a bulla tympanicát. A külso hallójárat felol szélesen megnyitottuk a bullát, látótérbe hoztuk a bulla mediális faláról eloemelkedo cochleát. Kerekfeju fúróval megnyitottuk, majd eltávolítottuk a cochleát. A cochlea bazális és apikális kanyarulatait, valamint a ganglion spiralét is eltávolítottuk. A bullát Gelfoammal (Gelita, B. Braun, Németország) töltöttük ki, majd csomós öltésekkel zártuk a bormetszést. A mutétet követoen az állatok fájdalomcsillapítót (Novalgin, 10 mg/kg, Hoechst, Németország) kaptak intramuszkulárisan, majd visszakerültek az állatházba. Immunhisztológia Különbözo túlélési idoket (2, 4, 7, 14, 28 és 56 nap) követoen az állatokat Nembutal (Abbott, North Chicago, USA) halálos adagjával öltük le, majd transzkardiálisan perfundáltuk 4% paraformaldehydet, 0,1% glutáraldehydet és 15% pikrinsavat tartalmazó 4 C o -os fixáló oldat 1 literjével. A perfúziót követoen kipreparáltuk a patkányok agyát. A fixálást követoen az agyakat 0,1 M-os foszfát pufferben oldott 25 %-os szukróz oldatba helyeztük egy éjszakára. Ezután kriosztát segítségével 30 mikrométer vastag frontális és szagittális agymetszeteket készítettünk. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 0,05% H 2 O 2 -ben, 30 percig 1 %-os tejporban, végül 30 percig 10 %-os marhaszérum és 0,05%-os Triton X-100 oldatában úsztattuk a metszeteket.
A GAP-43 immuncitokémiai kimutatásához egérben eloállított primér antitestet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) és egér elleni, biotinilált szekunder antitestet (Vector Laboratórium, Burlingame, USA) használtunk. A metszeteket 72 óráig inkubáltuk 4 C o -on a primér antitestet tartalmazó oldatban (1 : 5000; 0,1? gramm/ml). Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotin-peroxidáz komplex oldatába helyeztük (74). A peroxidázzal történt jelölést 0,05 % diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) és 0,3 % ammoniumnikkel-szulfátot tartalmazó 0,1 M-os Tris pufferrel és 0,0015% H 2 O 2 -vel tettük láthatóvá. A cochlea lézió eredményességének a megítélése céljából párhuzamos metszeteken glutamát (1:15000, Sigma-Aldrich, Németország) és calretinin (1:5000, Swant, Svájc) ellenes primér antitestekkel is elvégeztük az immunhisztológiai eljárást. Néhány metszeten a prészinaptikus struturákat jelölo synaptophysin (1: 100, Boehringer Mannheim, USA) ellenes primér antitesteket is használtunk. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést. 3. 3. Neuronpályák jelölésére alkalmas módszerek, a jelen munka során alkalmazott jelöloanyagok Az idegrendszer anatómiájának, kapcsolatainak feltérképezése a XIX. század második felében kezdodött. Eleinte léziók segítségével, az idegsejtek retrográd és anterográd degenerációja alapján következtettek a sejtek közötti kapcsolatokra, az axonok lefutására (30). A XX. század 70-es éveiben kezdték alkalmazni a tormaperoxidázt, mely kituno retrográd transzportálódó jelöloanyagnak bizonyult (90). Cowan és munkatársai vezették be az anterográd transzportálódó, radioaktív izotópokat tartalmazó aminosavak autoradiográfiás kimutatását (45). Az elmúlt 20-30 évben számos anterográd és retrográd transzportálódó neuronális jelöloanyagot alkalmaztak az idegrendszer anatómiájának mind pontosabb megismerése érdekében. A fluoreszcens jelöloanyagok szenzitív, megbízható eszköznek bizonyultak. Elso képviseloik a diamidino yellow, a fast blue és a fluorogold (24). Újabb fluoreszcens
jelöloanyagok a carbocyanine festékek és a fluoreszcens dextránok (72). A fluoreszcens jelöloanyagok az idegszövetben könnyen, egy adott hullámhosszú fényben mutathatók ki. Különbözo színben fluoreszkálnak, így több jelöloanyag szimultán használatára is lehetoség van. Kísérleteink során az olivocochleáris sejtek kollaterálisainak vizsgálata céljából fluoreszcens neuronális jelöloanyagokat, a diamidino yellowt és a fast bluet alkalmaztuk. Ezek a jelöloanyagok alkalmasak egyazon idegsejt szimultán jelölésére, hiszen a diamidino yellow a sejtmagot sárgára, míg a fast blue a citoplazmát kék színure festi (43). Számos kutató alkalmazta már ezeket a fluoreszcens festékeket az olivocochleáris sejtek jelölésére (11, 127, 128, 200). A fluoreszcens jelöloanyagok mellett sok egyéb, foleg anterográd transzportálódó jelöloanyag használatos egy adott sejtcsoport efferenseinek feltérképezésére: a cholera toxin B alegysége (CTB), a Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L), a biocytin, a neurobiotin és a biotinylált dextrán amin (BDA). Az utóbbi években egy újabb módszer terjedt el a neuroanatómiában: az idegpályák transzneuronális jelölése neurotróp vírusok segítségével (5, 25, 40, 88). Ezen vírusokra jellemzo, hogy az idegek perifériás végzodései specifikus receptorok segítségével megkötik és felveszik oket. A vírusok a sejtben retrográd (ill. kisebb mértékben anterográd is) transzportálódnak, a perykarionban elszaporodnak. Még mielott kikerülnének a sejtbol, megfertozik a szinapszison keresztül az adott sejten szinapszist képzo neuront, abban ismét retrográd transzportálódnak és a folyamat ismétli önmagát (12). Az elsoként megfertozött sejt a primer, a második a szekunder neuron. A vírussal megfertozött sejtek immunhisztokémiai módszerrel kimutathatók. A beadás utáni túlélési ido változtatásával multiszinaptikus neuronpályák feltérképezése válik lehetové (175). Jelen munka során a neurotróp, transzneuronálisan terjedo pseudorabies vírust (az Aujeszky féle sertésbetegséget okozó vírust) a cochleába injektáltuk. Az általunk használt vírust már sikeresen alkalmazták számos más szerv efferens innervációjának vizsgálata során (81, 112, 133, 141, 160, 164, 173, 191). 3. 4. Fluoreszcens jelöloanyagok (diamidino yellow és fast blue) applikációja patkány belsofülbe és az azonos oldali ventrális cochleáris magba.
Az olivocochleáris sejtek és a ventrális cochleáris magba adott kollaterálisaik vizsgálata céljából 16 felnott patkányt használtunk. A kísérletek során diamidino yellow (DY, Sigma-Aldrich, Németország) és fast blue (FB, Sigma-Aldrich, Németország) fluoreszcens jelöloanyagokat juttattunk a cochleába és az azonos oldali ventrális cochleáris magba. Az állatokat Ketanest S (50 mg/kg, Parke-Davis, USA) és Rompun (5 mg/kg, Bayer Leverkusen, Németország) intraperitonealis injekciójával altattuk el. Az állatokat két csoportra osztottuk. Az egyik csoportban (6 állat) a fluoreszcens jelöloanyagokat a cochleába juttattuk. A másik csoportban (10 állat) FB-t injekcióztunk a ventrális cochleáris magba, majd DY-t juttattunk az azonos oldali cochleába. Intracochleáris applikáció (6 állat) Az altatást követoen retroauriculáris metszést végeztünk a bal fül mögött, szabaddá preparáltuk és megnyitottuk a bulla tympanicát. Látótérbe hoztuk a cochleát. Óvatosan két piciny lyukat fúrtunk basalisan és apikálisan a csontos falon. A kifolyó perilymphát kis gelfoam darabokkal felfogtuk. Fluoreszcens jelöloanyaggal (4 esetben FB-vel, 2 esetben DY-al) feltöltöttük lassan a cochleát. Sebészi viasszal zártuk a nyílásokat a cochleán. A bullát Gelfoammal (Gelita, B. Braun, Németország) töltöttük fel, majd csomós öltésekkel zártuk a sebet. Intracochleáris applikáció és injekció a ventrális cochleáris magba (10 állat) Az állatok ezen csoportjában FB-t injekcióztunk a ventrális cochleáris magba, majd DY-val töltöttük fel az azonos oldali cochleát. Altatást követoen a bal oldalon occipitálisan craniotomiát végeztünk. Eltávolitottuk a kisagy flocculusát és paraflocculusát, látótérbe hoztuk a cochleáris magot. Ötven mikrométer átméroju üveg mikropipettával 0,15 mikroliter telített FB oldatot injektáltunk lassan a ventrális cochleáris magba. Az injekciót követoen 10 percig hagytuk bent a mikropipettát, majd lassan eltávolitottuk. A flocculus és paraflocculus helyét gelfoammal töltöttük ki. Ezt követoen a fent leírt módon DY-t jutattunk az állatok cochleájába, a cochleáris magba adott injekcióval megegyezo oldalon. A mutéteket követoen az állatok fájdalomcsillapítót (Novalgin, 10 mg/kg, Hoechst, Németország) kaptak intramuscularisan, majd visszakerültek az állatházba.
Hat nappal a mutétek után az állatokat Nembutal (Sanofi, Francoiaorság) halálos adagjával öltük le és transzkardiálisan perfundáltuk 4 % paraformaldehydet tartalmazó, 0,1 M-os, 4 C o -os foszfátpufferrel. Harminc mikrométer vastag frontális agymetszeteket készítettünk majd tárgylemezre húztuk oket. A fluoreszcens jelöloanyagot tartalmazó sejteket Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Az injekciós hely és a jelölt sejtek meghatározása céljából camera lucida rajzokat készítettünk. A jelölt sejteket megszámoltuk, az egyes metszeteken kapott sejtszámokat összeadtuk. A metszéspontokban levo sejtek dupla számolását elkerülendo a kapott sejtszámokat Abercombie egyenlete alapján korrigáltuk (1, 68). 3. 5. Pseudorabies vírus injekciója tengerimalac cochleába. A vírus immunhisztológiai kimutatása agymetszeteken. A leszálló hallópálya vizsgálata céljából az Aujeszky-féle, sertésbetegséget okozó pseudorabies vírusának gyöngített, Bartha-féle törzsét (14) injektáltuk tengerimalacok cochleájába. Különbözo túlélési idoket követoen immunhisztológiai eljárással mutattuk ki a vírust az agyban. Összesen 17 tengerimalacot használtunk a kísérletekhez. Intracochleáris vírusinjekció A pseudorabies vírus Bartha törzsét (PRV-Ba) sertés vese sejttenyészetben szaporítottuk. A vírosból oldatot (10 9 plakk-képzo egység/ml) készítettünk és 70 o C-on tároltuk. A vírust tartalmazó oldatot használat elott gyorsan 37 o C-ra melegítettük. A vírusfertozött állatokat elkülönítve tartottuk. Az állatokat ketamin (80 mg/ml) és xylazine (15mg/ml) intramusculáris injekciójával altattuk el. Baloldali retroauriculáris metszés után szabaddá tettük és megnyitottuk a bulla tympanicát. Felkerestük a kerekablakot. A kerekablakot megnyitottuk és a kicsorgó perilymphát Gelfoammal felfogtuk. A kerekablakon keresztül mikropipettával 50 mikroliter vírusoldatot injektáltunk lassan, fokozatosan a cochleába. Az injekciót követoen sebészi viasszal zártuk a kerekablakot. A bulla tympanicát alaposan kitakarítottuk és kitöltöttük Gelfoammal. A sebet csomós boröltésekkel zártuk.
A vírus immunhisztológiai kimutatása A tengerimalacokat különbözo túlélési idoket követoen ismét elaltattuk, majd transzkardiálisan fiziológiás sóoldattal (50 ml) és fixáló oldattal (400 ml 4% paraformaldehydet és 15% pikrinsavat tartalmazó 0,1 M-os foszfát puffer) perfundáltuk oket. A túlélési idok a következok voltak: 15 óra (n=1), 25 óra (n=2), 37 óra (n=3), 40 óra (n=2), 48 óra (n=3), 72 óra (n=2), 90 óra (n=2), 96 óra (n=1), 108 óra (n=1). A perfúziót követoen kipreparáltuk az agyakat és 50 mikrométeres frontális sorozatmetszeteket készítettünk fagyasztásos technikával a nyúltvelotol a hallókéregig. A metszeteken 3 lépcsos preinkubációt végeztünk: 45 percig 3% H 2 O 2 -ben, 20 percig methanolban, végül több foszfát-pufferes mosás után 1 óráig 10 %-os kecskeszérumban úsztattuk a metszeteket. Többszöri ismételt mosás után a metszeteket 48 órán át inkubáltuk a primér, vírusellenes antitestet (1: 5000 higításban) tartalmazó oldatban. Az antitestet nyúlban termelték és R. R. Miselis (Philadelphia) bocsátotta rendelkezésünkre. Ezt követoen a metszeteket a biotinilált szekunder antitestet tartalmazó oldatba (1:200) helyeztük. Végül a metszeteket 30 percre avidin-biotinperoxidáz komplex oldatába (Vectastain Elite ABC Kit, Vector, Burlingame, USA) helyeztük. A peroxidázzal történt jelölést 0,05 % diaminobenzidint (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) tartalmazó 0,1 M-os Tris pufferrel és 0,0015% H 2 O 2 - vel tettük láthatóvá. Az immunhisztokémiai reakció után a metszeteket többször foszfát pufferben mostuk, majd tárgylemezre húztuk. Száradás és dehidrálás után fedtük a metszeteket. A primér antitestben nem inkubált kontroll metszeteket is készítettünk. Ezeken sohasem láttunk festodést. A jelölt sejtek lokalizációjának meghatározásához tengerimalac agy atlasz segítségét vettük igénybe (126). 4. Eredmények 4. 1. A GAP-43 expresszió posztnatális változása az oliva superiorban és a cochleáris magban 4. 1. 1. Oliva superior
Újszülöttkorban (P1-P8) az oliva superiorban intenzív GAP-43 immunreaktivitást detektáltunk (7. ábra, A). Ez az eroteljes festodés fokozatosan csökkent és felnottkorban az oliva superiorban csak alacsony GAP-43 szintet találtunk (7. ábra, B). Nagy nagyítású objektívvel is áttekintve a metszeteket jól láthatóvá vált, hogy az intenzív újszülöttkori GAP-43 festodés diffúzan az oliva superior neuropiljére terjedt ki (8. ábra). Az elso két posztnatális hét során ez az intenzív, diffúz festodés (8. ábra, P1) fokozatosan granulárissá vált és az intenzitása is jelentosen csökkent. Felnottkorban a GAP-43 az oliva superiorban futó rostok varikozitásaiban, pontszeruen helyezkedett el, a sejttestekben csak minimális GAP-43 szint volt sejtheto (8. ábra, felnott). 4. 1. 2. Cochleáris mag Az oliva superiorhoz hasonlóan a cochleáris magban is újszülöttkorban intenzív GAP- 43 immunreaktivitást találtunk (9. ábra, A). Ez az eroteljes festodés felnottkorra drámaian lecsökkent (9. ábra, B). Nagy nagyítással vizsgálva a metszeteket az elso posztnatális napokban eroteljes, diffúz neuropil festodést találtunk a cochleáris magban, a sejttestek nem festodtek (10. ábra, P1). Az elso két posztnatális héten a festodés fokozatosan granuláris jelleguvé vált és intenzitása jelentosen csökkent. A 16. posztnatális napra eltunt az intenzív, diffúz GAP-43 immunreaktivitás (10. ábra, P16). A GAP-43 ekkor már csak pontszeruen, varikozitásokban, prészinaptikus axonvégtalpacskákban volt kimutatható. A pontszeruen festodo végtalpacskák nemegyszer sejttestek körül helyezkedtek el (10. ábra, felnott). A cochleáris mag GAP- 43 immunreaktivitása felnottkorban nem volt teljesen homogén, hiszen a dorzális cochleáris mag mélyebb rétegeiben intenzívebb GAP-43 festodést találtunk mint a ventrális cochleáris magban (11. ábra).
7. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superiorban a 8. posztnatális napon (P8, A) és felnott állatban (felnott, B) patkány agytörzs frontális metszeteinek részletein. Az újszülöttkori intenzív, diffúz neuropil festodés felnottkorra nagymértékben csökken és pontszeruvé válik az oliva superiorban (SOC). Méretjel = 0, 5 mm. n7 = arcideg; tb = trapéztest;
8. ábra. GAP-43 immunreaktivitás az oliva superior laterális magvában nagy nagyítással, különbözo posztnatális napokon. Az újszülöttkori intenzív, diffúz immunreaktivitás (P1, P4) fokozatosan csökkent és a 16. napra (P16) pontszeruvé vált. Felnottkorban csak minimális, pontszeru festodést detektáltunk axonális struktúrákban (felnott, nyilak). Méretjel = 20 µm.