BMGE, Alkalmazott biokémia, transzgénikus organizmusok, 2009 Transzformációs módszerek
Definíció Génbevitel vagy géntranszfer alatt azt a folyamatot értjük, aminek során egy meghatározott DNSmolekuladarab (ált. egy vagy több gén) bejuttatásra kerül a protoplasztokba vagy intakt növényi sejtekbe. Transzgénikus növényről és genetikai transzformációról csak abban az esetben beszélhetünk, ha a bevitt idegen gén stabilan integrálódott a növény genomjába, mely növényt az intakt sejtből regeneráltunk.
Transzformációs módszerek Közvetett (indirekt) transzformáció a DNS bejuttatása közbülső vagy közvetítő organizmusok segítségével történik Közvetlen (direkt) transzformáció a DNS-t közvetlenül juttatjuk be a befogadó szervezet sejtjeibe, általában fizikai-kémiai hatás segítségével Felhasznált növényi sejt alapján: - protoplaszt transzformáció - intakt sejt vagy szövet tr.
Indirekt transzformációs módszerek Agrobacterium fajok közvetítésével működő módszerek Vírus vektorok közvetítésével működő módszerek
Direkt géntranszformációs módszerek (DGT) kémiai PEG poly-l-ornithin ornithin CaCl 2 Protoplaszt transzformáció fizikai Elektroporáció Ultrahangos kezelés - szonikáció Mikroinjektálás Elektrofúzió Liposzómákkal Intakt sejt, szövet transzformációja Biolisztikus módszer Szilikonkarbid kristályos Makroinjektálás Szárított embrió Pollentömlő eljárás
Indirekt, Agrobacterium közvetített transzformáció Agrobacterium tumefaciens- talajban élő Gram-negatív baktérium, sebzési helyeken gyökérgolyvásodást okoz (crown gall) Tumor- differenciálatlan, gyorsan osztódó kalluszszövet Növényi sejt felismerése -cirkuláris Ti plazmid önállóan szaporodik, 100 génje van, opinokat termel N forrásként a baktériumnak -Egy része a T-DNS képes integrálódni a növényi sejt DNS-ébe (kb. 21-23 kb) - a tumor képződésért felelős -Ez a határszekvenciák által közrefogott rész (T-DNS vagy bármely DNS darab) hatékonyan átvivődik a gazdanövény genomjába (50 kb) -Vir gének (A, G, E, B, F, H) - átvitel
Agrobacterium közvetített transzformáció -Baktérium növényi sejt fizikai kölcsönhatása szükséges -ezt segíti a baktérium termelte cellulóz -növényi felületen található receptorok, melyek pektin-hez kötött fehérje vagy glikoprotein molekulák -β-1,2-glükán szintézise és exportja, ciklikus, kis MW ehhez szükséges gének: exoc, chvb, chva exoc - terméke a foszfoglükomutáz, G-6P-ból G-1P, intermedier az UDP-glükóz szintézisében chvb belső membránfehérje, mely az UDP glükózt a B- glükánhoz köti szállítás chva termékéhez chva export fehérjéhez hasonló, kapcsolódás aktivitását növelheti - a baktériumok meghatározott helyre kötnek, néhány 100 baktérium /sejt
Agrobacterium közvetített transzformáció - Window of competence - a sebesülés utáni kritikus periódusban kell az Agrobaktáriumnak jelen lenni a válaszreakció kialakulásához, hatékony transzformáció eléréséhez A sebesülés hatására védekező reakció indul be, enzimek képződnek antimikrobiális vegyületek előállítására, az elhalt sejtrétegek szintén védelmi vonalat képeznek, más sejtek differenciálódnak és elkezdenek osztódni, a sejtfalképződés beindul, helyi savasodás lép fel A sejtosztódás és a sejtfalat alkotó poliszacharidok és a lignin szintézise közben jellegzetes vegyületek szabadulnak fel (fenolos komponensek, cukor és származékai), melyek az Agrobaktérium számára jelek (SIGNAL) Egyszikűekben a fenolos vegyületek és a cukor elkezd termelődik, de nincs sejtosztódás a sebnél, ezért okozhat nehézséget transzformálásuk -Kemotaxis: A. tumefaciens számára vonzó vegyületek (kemoattraktant), szerves savak (szukcinát, p-hidroxybenzoát), bizonyos aminosavak (valine, arginin), szénhidrátok (cukrok), oldható fenolok A baktérium sebessége 60-ról 500 µm/sec-re nő hatásukra laborban chve gén cukor-kötő fehérjét kódol, mely a sejtmembránon található kemotaxis receptorokkal kölcsönhat, sérült sejt felismerésben játszik szerepet
Agrobacterium közvetített transzformáció -vir gének a T (transzfer)-dns szintézisében és növényi sejtbe való átvitelében játszanak szerepet Ez a folyamat szabályozott és függ attól, hogy a baktérium milyen érzékenyen reagál a növény megsebzésre adott válaszára (fenolok, cukrok) chve-cukor komplex képződése és kölcsönhatása megváltoztatja a VirA konformációját, melynek hatására az érzékenyebb lesz a fenolos molekulákra VirA-VirG-kéttagú szabályozó rendszer: - VirA érzékeli a növény signáljait, foszfokináz aktivitása lesz, melynek hatására egyik hisztidinjének foszfát csoportját átadja a VirG aszpartát aminosavának, - a VirG-nek ezután transzkripciót aktiváló hatása lesz, mivel tartalmaz egy DNS és egy ATP kötő helyet is, saját promóterét írja át, aktiválja a szabályozó rendszert
Agrobacterium közvetített transzformáció A T-DNS szállítás folyamata 1. Szállítható intermedier előállítása - VirD1 kitekeri a DNS-t, VirD2 elhasítja az alsó szálat - DNS szintézis kezdődik, a keletkező egyszálú DNS a T-strand - VirE2 fehérje hozzákötődik, hogy megvédje a nukleázoktól T-komplex
Agrobacterium közvetített transzformáció 2. T-komplex szállítása - A mechanizmus kevéssé ismert -vir-specifikus membrán pólus keletkezik, melyen a T-komplex bejuthat a sejtbe -A 11 virb közül legalább 3 részt vesz a szállításban, géntermékeik membránhoz kötöttek, befolyásolják a virulenciát, a T-DNS szállító rendszer szubsztrát specificitását befolyásolják 3. T-DNS mozgása és integrációja sejten belül -Nem ismert a folyamat, modellek vannak -Alapjuk: T-komplex részei a VirD2 és a VirE vezetik a T-DNS-t a sejtmagba - VirD2 a sejtmag szignáljait ismeri fel -VirE a tumorképződést okoz, védi az egyszálú DNS-t (valószínű) -VirD2 okozta polaritás segíti a növényi genomba integrálódást -Integráció: -véletlenszerűen, tandem épül a növényi genomba a T-DNS -Egy vagy több inzerció is létrejöhet -A T-DNS határszekvenciái mentén a növényi genom átrendeződésre képes, duplikációk, deléciók -Az integrálódott DNS a növényi DNS-el azonos módon működik tovább (transzkripció, poliadenlált mrns képződése, RNS mozgása, transzláció)
Agrobacterium közvetített transzformáció Opinok termelése - Aminósav + cukor vagy cukor sav-ból jön létre Oktopin piruvát és arginin-ből képződik Nopalin α-ketoglutarát és arginin-ből jön létre -Bioszintézis enzimeinek génjei a T-DNS-en találhatók -Kizárólag a transzformált növényi sejtekben termelődik -Egyedi szén és nitrogénforrást biztosít a baktérium számára -A növényi sejtek nem tudják metabolizálni az opinokat ez szelekciós előny a baktérium számára -T-DNS hordozza a géneket (növényi onkogének), mely a tumorképződést létrehozza -A transzformált sejtek olyan komponenseket termelnek, melyek stimulálják a sejtosztódást (auxin, cytokinin hormonok)
Agrobacterium közvetített transzformáció Vektorok 1. Ti-plazmid T-DNS génjei helyére építjük be a gént a határszekvenciák közé 2. T-DNS és a határszekvenciákat eltávolítjuk, vir gének maradnak + határszekvenciák ismétlődéseit tartalmazó kisebb plazmidok Definíció: Az a DNS szakasz vagy molekula, mely egy adott sejten belül képes replikálódni, pl. - növényi vírusok (kettős szálú, egyszálú, RNS vírus) - baktériumok plazmidjai - organelláris cirkuláris DNS Követelmények: - önállóan replikálódjon - restrikciós enzim hasító hely - antibiotikum-rezisztencia marker - idegen gén beépítésére alkalmas - riporter gén, promóter
Indirekt, vírus vektor közvetített transzformáció CaMV, karfiol mozaikvírus Gemini vírusok kettős szálú DNS vírus, hossza 8 kb, rövid kb 1 kb DNS vihető át vele fertőzés vektorai a levéltetvek vagy mechanikus szűk a fertőzhető növények köre, betegségben el is pusztulnak egyfonalas DNS vírusok, genomméret kb 2.5 kb beépítendő DNS mérete nem limitált a köpenyfehérje hiánya miatt fertőzés vektorai a levéltetvek gazdaspecificitásuk széles RNS-vírusok cdns formában integrálódik a gazdagenomba, terméke mrns vagy vírus genom Kis valószínüséggel integrálódik a genomba Ajánlott, ha csak egy generációban szeretnénk bevinni egy tulajdonságot pl. vírus rezisztencia Transzpozon vektorok Két szomszédos inszerciós elem+közbeékelődött gén komplexe, mely bármely DNS lehet Ez a DNS szekvencia képes ugrálni a genom mentén Létezését először kukoricában mutatták ki
PEG - polietilén glikol kezelés protoplaszt - víz H - [HOCH 2 -(CH 2 -O-CH 2 ) n -H 2 COH] H víz protoplaszt -Fehérje H - - szénhidrát H-H - - - - Ca 2+ - - H fehérje - - H szénhidrát - A lipidmembrán instabillá válik - A szomszédos protoplasztok fúzionálhatnak - Az instabil lipidmembrán pólusokon jut be a DNS a protoplasztba - Hátrány, hogy a protoplasztokból történő növényregeneráció korlátozott - PEG mérgezés, életképesség csökkenés
Elektroporáció -Elektromos impulzusokkal a sejtek DNS-felvétele fokozható -Rövid, megfelelő erősségű elektromos erőtér (5ms, kv/cm) tranziens lyukakat eredményez a membránban -DNS felvétel a pórusokon keresztül -Alkalmazott protoplaszt, intakt növényi sejt, éretlen embrió esetén -Egyszerű, gyors, olcsó -Hatékonysága alacsony
Elektrofúzió 10-100 µs -Váltóáramú elektromos térben a protoplasztok dipólusként viselkednek -Láncszerűen összetapadnak -Nagyfeszültségű egyenáram hatására a protoplasztok összeolvadnak -Ezt követi a magok fúziója -A fúziós gyakoriság nagy -A fúziós termékek életképesek -Nincsenek mérgezési tünetek, mint a PEG-nél 200-2000 V/cm 10-50 s, 0.5-5 MHz 10-300V + - + - + - + - + - + - + - + -
Génbevitel liposzómákkal Liposzóma Liposzóma- célsejt kölcsönhatás - membránnal határolt vezikulum - kívül foszfolipid, belül vízben oldott molekulák, DNS - uni- vagy multi-lamelláris membrán -előállítás: apoláris oldószerből felületre párolt lipidfilmet vizes oldattal feloldjuk és diszpergáljuk rázással - fúzió membránok összeolvadása, külső multilammeláris m géntranszfer - endocitózis - liposzóma egyben bekerül a célsejtbe - stabil abszorpció felületek kölcsönhatnak - lipidtranszfer egy vagy kétirányú lipidkicserélődés a membránban
Ultrahanggal történő génbevitel Szonikáció -A protoplaszt sejteket 20 khz ultrahang hatásának teszik ki, a megfelelő génkonstrukciót tartalmazó plazmid jelenlétében, oldatban -A túlélő protoplasztok életképesek és nagy regenerációs kapacitással rendelkeznek -DMSO hatására a regenerációs képesség még tovább nő és a tranziens génexpresszió is nő -Előnye, hogy egyszerűbb módszer, mint a PEG vagy az elektroporáció
Mikroinjektálás -A mechanikai úton történő génbevitel hatékony formája -A DNS oldat közvetlen beinjektálása a protoplasztba vagy a sejtmagba -A műveletet mikroszkóp alatt, mikromanipulátorral végzik - manipulátor egyik karja rögzíti a protoplasztot, a másik beinjektálja a DNS oldatot (2 pl) adagoló szivattyú segítségével áthatolva a sejthártyán
Transzformáció szilikon karbid tűk felhasználásával - A mechanikus génbevitel egy másik formája - Intakt növényi sejtek használhatók kiindulásként - A sejteket DNS-tartalmú folyékony táptalajban rázatják szilikonkarbid tűkkel együtt - A szilikon karbid tűk mikroméretű injekciós tűkként működnek (0.6 µmx10-80µm), áthatolnak a sejtfalon és sejtmembránon és ily módon bejuttatják a rájuk tapadt DNS-t a sejtbe - Előny: egyszerű, olcsó - Hátrány: sejtek károsodása, regenerációs hatékonyság alacsonyabb
Szárított embriók DNS oldatban történő rázatása -A száraz növényi szövetek membránjának fiziko-kémiai tulajdonságai erősen megváltoznak a kiszáradás folyamán - így a DNS óriásmolekulák megfelelő gyakorisággal bejuthatnak a sejtekbe, áztatással -Pillangós és gombafajok embrióin próbálták ki a módszert -Tranziens génexpresszió kiváltására alkalmas
Biolisztikus transzformáció, génágyú -Intakt sejtek transzformációjára alkalmazott leghatékonyabb módszer -A DNS-t 0.5-2 µm átmérőjű arany vagy wolfrám részecskére rögzítik (mikrokarrier) -Ezeket a részecskéket nagy sebességre felgyorsítják, nagynyomású He vagy N 2 gázzal -A részecskék eltalálják a célszövetet, áthatolnak a sejtek falán, és a DNS is bejut velük a sejtbe - a túlélő sejtek osztódnak és belőlük megfelelő körülmények között növény regenerálható -Előny: valamennyi növény esetén alkalmazható, a leghatékonyab módszer jelenleg
Biolisztikus transzformáció, génágyú Nagy nyomású He gáz
Biolisztikus transzformáció előnyei -Könnyű kezelni -Egy lövéssel számos sejtbe juttatunk DNS-t -A sejtek képesek túlélni a belövést -Az Au szemcsékre tapadt gének biológiailag aktívak -A lehetséges célsejtek köre széles: pollen, embrió, levél, gyökér, sejtkultúra -Felszíni vagy mélyebb rétegek is megcélozhatók -A módszer hatékonyságát csak a fizikai paraméterek befolyásolják
A transzgén expresszióját befolyásoló fizikai-kémiai paraméterek -Aranyszemcse mérete (0.4-1.2 um) -Aranyszemcse mennyisége (29-235 ug/lövés) -A mirohordozóra vitt oldat összetétele -2.5-20 ug plazmid vagy lineáris DNS -8-16 mm spermidin -0.2-1.9 M Ca 2+ ion - a He gáz nyomása (4.5-7.6 MPa, 68-71Hgmm a kamrában) -A lövési távolság (2.5-5.5 cm)
Biolisztikus transzformáció
Génkonstukciók Célzott funkciójú gén Szelekciós gének Riporter gének Promóterek Transzformációhoz használt plazmid
Transzformáció céljai -Betegség ellenállóság kialakítása (lisztharmat, levélrozsda, fuzárium) -Terméshozam növelés -Termésminőség javítása (sütőipari minőség, szemkeménység, stb) -Gének és termékeik funkciójának vizsgálata
Szelekciós rendszer Rezisztencia gének: Antibiotikum szelekció (kanamycin( kanamycin, geneticin, hydromycin, etc.) Herbicid szelekció (bar vagy phosphinitricin acetyl transferase) Funkcionális szelekciós gének: Pozitív funkcionális szelekció (pmi( pmi, ipt, rol) Látható marker gének/riporter gének: Luciferáz Zölden fluoreszkáló fehérje (GFP) Antocián uida/gus pdsred
Szelekciós rendszer Rezisztenciaagének -Aminogglikozid alapú antibiotikumok (kanamicin, sztreptomicin stb.) baktériumölő, irreverzibilisen kötődnek a riboszómákhoz Enzimek képesek inaktiválni az amiloglikozidokat (pl. AadA, NptII) -Növényvédőszerekkel (herbicid) szembeni rezisztencia bar foszfinotricin acetiltranszferáz enzim génje, foszfinotricin (PPT) alapú gyomírtószerekkel szemben ad rezisztenciát Negatív mellékhatásuk a sejtosztódás és a differenciáció gátlása Glifozáttal és szulfonilureával szembeni rezisztencia
Szelekciós rendszer Funkcionális szelekciós gének -Pozitív funkcionális szelekció a transzgénikus sejteknek metabolikus előnyt ad, ártalmatlan a fogyasztókra és a környezetre pmi foszfomannóz izomeráz E. coli-ból, mannóz-6p- ot fruktóz-6p-á alakítja, mannóz-6p tartalmú táptalajon képes osztódni a transzgénikus sejt Transzformáció vizuális felismerése: rol - ipt - Agrobacterium tumefaciens sejtburjánzást indukáló génje, citokinin bioszintézis egyik génjét kódolja, transzgénikus növényben a citokinin szint nő, a gyökérképződés gátlódik izopentenil transzferáz Agrobacterium rhizogenes eredetű gén, hairy roots kialakulásáért felelős Gének kikapcsolása: normál fenotípus -Negatív szelekciós markerek coda citozin deamináz gén, 5-fluorcitozint az eukarióta sejtek számára 5- fluoruracillá alakítja
Látható markergének / Riporter gének -Segít a transzformáció hatékonyságának gyors értékelésében - -A DNS bejuttatását követően 12-48 órával kimutatható a bevitt gén tranziens expressziója -A riporter génnek még nem kell integrálódnia a genomba, hogy működni tudjon -uida - E- coliból izolált béta-glükuronidáz gén (GUS) a béta glükuronidok lebontását katalizálja, külső szubsztrát jelenlétét igényli, az enzim aktivitása hisztokémiai úton vagy fluometriával kimutatható, a sejtek irreverzibilisen károsodnak -luc - A szentjánosbogár (Photynus pyralis) luciferáz génje az enzim katalizálja a luciferin ATP függő oxidációját, nincs toxikus hatása a gabonasejtekre, luminométerrel mérhető -GFP - Green fluorescens protein medúza eredetű, a sejtben zölden fluoreszkál (könnyű detektálni, oxigénre van szükség, alkalmas génexpresszió, szignál-transzdukció, proteinmigráció és lokalizáció vizsgálatára, sejtvonalak nyomonkövetésére), fluoreszcensz mikroszkóppal kimutatható -kukorica R génje antocianin szintézist szabályozó enzimek génje, nincs szükség külső szubsztrátra, feltűnő látható pigmentációt okoz
Promóterek Biztosítják a génkek folyamatos átíródását Konstitutív promóterek minden szövetben és fejlődési szinten általános génexpresszió CaMV 35S karfiol mozaikvírus 35S rrns promótere Act1 rizs aktin promótere Ubi1 kukorica ubiquitin promótere Adh1 kukorica alkohol dehidrogenáz promóter Emu - kukorica alkohol dehidrogenáz promóterből készült promóter
Szövet specifikus promóterek 1Ax1, 1Dx5 - a búza HMW glutenin tartalék fehérje génjei endospermium specifikus expresszió GBSS - granule bound starch synthase, amilóz szintézis génje expresszió a búz endospermiumban és a pollenben RSS - rizs szacharóz szintáz génje háncsszövetben expresszálódik RUBISCO - ribulóz-1,5-biszfoszfát- karboxiláz-oxigenáz klorofillt tartalmazó szövetekben aktívak, fény által szabályozott promóter Indukciós promóterek Promóterek külső változás hatására indítják el a génexpressziót: Sérülés - RC24 rizs kitináza, OSGRP1- glicin gazdag sejtfal fehérje Kémiai - növényvédőszer, etanol stb Stresszhatás - T sokk, anaerob környezet, patogének Vst1 stilbene szintáz gén promótere szőlőből gombafertőzés indukált
Általános összefoglalás A transzformációs módszerek alkalmasak egy meghatározott DNSmolekuladarab (ált. egy vagy több gén) bejuttatására protoplasztokba vagy intakt növényi sejtekbe. Amennyiben a bevitt gén stabilan integrálódik a genomba és növény regenerálható a transzformált sejtekből, úgy transzgénikus növényt kapunk. A növények transzformációjára legelterjedtebben használt és leghatékonyabb transzformációs módszerek - Biolisztikus transzformáció - Agrobacterium közvetített transzformáció