A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN DR. HORVÁTH PÉTER SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZI KÉMIAI INTÉZET BUDAPEST 2000 1
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 2 ÖSSZEFOGLALÓ... 5 1. BEVEZETÉS... 7 2. CÉLKITŰZÉSEK... 10 3. IRODALMI HÁTTÉR... 11 3.1. KÉMIAI EGYENSÚLYOK... 11 3.2. A KIROPTIKAI MÓDSZEREK ANALITIKAI ALKALMAZÁSAI... 12 3.2.1 GYÓGYSZERKÖNYVI MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS... 12 3.2.2 OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA... 13 3.2.3 OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK SZÁRMAZÉKKÉPZÉSEN ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSA... 14 3.2.4. AZ INDUKÁLT OPTIKAI AKTIVITÁS MÉRÉSÉNEK LEHETŐSÉGEI... 15 3.2.5 KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁBAN... 16 3.2.6. ENANTIOMEREK MEGHATÁROZÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA ALKALMAZÁSA NÉLKÜL... 19 4. MÓDSZEREK... 20 4.1 KIROPTIKAI MÓDSZEREK... 20 4.1.1 AZ OPTIKAI AKTIVITÁS ALAPFOGALMAINAK ÁTTEKINTÉSE... 20 4.1.2 A KIROPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA MÓDSZEREI... 22 4.1.3 ELMÉLETI ALAPOK... 22 2
4.1.4 AZ UV-VIS, A CD ÉS AZ ORD SPEKTROSZKÓPIA ÖSSZEHASONLÍTÁSA 24 4.2 A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA /HPLC/ ÉS A KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS... 26 4.2.1.1 CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK... 26 4.2.1.2 A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS ELVE ÉS ALKALMAZÁSÁNAK FELTÉTELEI A CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁBAN... 28 4.2.2.1 ÁTFEDŐ KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSOK DEKONVOLUCIÓJA... 30 4.2.2.2 CSÚCSFELBONTÁS ELVÉNEK LEÍRÁSA A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁST KÖVETŐ HÁNYADOSKÉPZÉS ALAPJÁN... 32 5. EREDMÉNYEK... 36 5.1 A MÉRÉSEKHEZ HASZNÁLT MŰSZEREK, VEGYSZEREK ÉS MÉRÉSI KÖRÜLMÉNYEK LEÍRÁSA... 36 5.1.1 MŰSZEREK... 36 5.1.1.1 KIROPTIKAI MÉRŐMŰSZER... 36 5.1.1.2 KROMATOGRÁFIÁS MÉRŐRENDSZER... 37 5.1.1.3 KIEGÉSZÍTŐ MÉRÉSTECHNIKÁK... 37 5.1.2 VEGYSZEREK, REAGENSEK, OLDÓSZEREK... 38 5.2 ENANTIOMERTISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA... 41 5.2.1 ENANTIOMER TISZTASÁG MEGHATÁROZÁSA SZIMULTÁN KETTŐS SPEKTROSZKÓPIA ALKALMAZÁSÁVAL... 41 5.2.1.1 ELŐVIZSGÁLATOK... 41 5.2.1.2 ENANTIOMERTISZTASÁG KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA A DISZIMMETRIA FAKTOR ALKALMAZÁSÁVAL... 47 5.3 A CD ÉS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁBAN. 54 5.3.1 KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS MEGHATÁROZÁSA A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL... 55 3
5.3.2 KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATA NAGYSEBESSÉGŰ CD SPEKTRUMFELVÉTELEK ALAPJÁN... 62 5.3.3 KROMATOGRÁFIÁS CSÚCSFELBONTÁS A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS SEGÍTSÉGÉVEL... 69 6. MEGBESZÉLÉS... 76 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 78 IRODALOMJEGYZÉK... 79 4
ÖSSZEFOGLALÓ A CIRKULÁRIS DIKROIZMUS /CD/ ÉS KOMBINÁLT CD/UV SPEKTROSZKÓPIA FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI A KÉMIAI ANALÍZISBEN Írta: Horváth Péter Témavezető: Gergely András, a kémiai tudományok kandidátusa Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola,2000 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai A kiroptikai spektroszkópia dinamikusan fejlődő területe a kiroptikai analízis. Korábban ezt a módszert elsődlegesen molekulák szerkezetének meghatározására alkalmazták, azonban napjainkban egyre nő az igény - elsősorban a gyógyszeripar részéről- az enantiomer tisztaság precíz meghatározására. Az elválasztástechnikai eljárások egyre gyakrabban alkalmazzák a kiroptikai detektálást, amely módszer egyik legfontosabb előnye, hogy királis anyagok szelektív mérését teszi lehetővé, továbbá az, hogy segítségével az enantiomer arány az izomerek elválasztása nélkül is meghatározható. Célkitűzéseink között szerepelt, hogy -a technikai feltételek megteremtése után- új módszerek kifejlesztésével a kiroptikai spektroszkópia gyógyszeranalitikai lehetőségeire felhívjuk a figyelmet. Legfontosabb eredményeink közé soroljuk, hogy Magyarországon elsőként, de nemzetközi viszonylatban is az elsők közt oldottuk meg a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia /HPLC/ és a cirkuláris dikroizmus /CD/ spektroszkópia, mint detektálási eljárás összekapcsolását. Fentiek eredményeként az elválasztástechnikában általánosan alkalmazható csúcshomogenitás vizsgáló módszer kidolgozására nyílt lehetőség, amely a szimultán kettős CD/UV detektáláson és az azt követő hányadosképzésén alapuló vizsgáló eljárás. A módszer továbbfejlesztésével átfedő kromatográfiás csúcsok dekonvolúcióját is sikerült elvégezni. Szintén a csúcshomogenitás ellenőrzésére alkalmas a CD-spektrumok nagy sebességgel történő regisztrálása, amely eljárás a látszólag homogén kromatográfiás csúcsok esetében is jól alkalmazható. A fentiek mellett számot adok a CD spektroszkópia közvetlen alkalmazási lehetőségeiről is, mint például kémiai egyensúlyok vizsgálatáról és egy új elven alapuló, enantiomer tisztaság meghatározásra alkalmas módszerről is. 5
METHOD DEVELOPMENTS AND APPLICATIONS OF CICULAR DICHROISM AND SIMULTANEOUS DUAL CD/UV SPECTROSCOPY IN ANALYTICAL CHEMISTRY Péter Horváth Semmelweis University, Department of Pharmaceutical Chemistry Tutor: András Gergely C.Sc. Semmelweis University, School of Ph.D. Studies Programme: Recent trends in pharmaceutical sciences Circular dichroism (CD) is one of the few sensitive indicators of molecular configuration. CD spectroscopy has therefore long been used for structure elucidation. Recent trends show, however, an enormous progress of CD spectroscopy in analytical chemistry, either as an independent method, or as a detector in hyphenated separation techniques. Its uses became especially widespread in pharmaceutical analyses, since enantiomeric purity is a crucial criterion of drug quality. Objectives of the present Ph.D. work included fundamental research in CD and related methodologies, but also, its applications in pharmaceutical analysis. A technical prerequisite of our research work was the instrumental hyphenation of separation and chiroptical detection techniques, which has been achieved by the combination of high performance liquid chromatographic and circular dichroism spectroscopic devices. Our home-built apparatus was the first HPLC-CD instrument in Hungary. Its uses allowed the elaboration of a new method for the determination of peak homogeneity, which applies simultaneous, dual CD/UV detection, and a subsequent ratio-formation. An improved version of this method resulted in the deconvolution of overlapping chromatographic peaks. Another type of peak homogeneity control method was elaborated by rapid, on-line recording of CD spectra in the progress of elution, in order to analyse apparently homogeneous peaks. Circular dichroism has also been applied to quantitate enantiomeric purity in composite samples without any separation of the analytes, and also, to determine equilibrium constants of protonating chiral compounds. 6
1. BEVEZETÉS A bennünket körülvevő világ számos titkot rejt, amelyekre keressük a megoldást, de tudományos megalapozottsággal még nem tudunk minden kérdésre válaszolni. Az egyik ilyen filozofikus nagy kérdés az élet keletkezése a földön. Mikor és hogyan keletkeztek az első önreprodukcióra képes molekulák vagy molekuláris halmazok? Miért pont azok a molekulák voltak azok, melyek építőköveivé váltak a mai létformák őseinek? Vagy lehet, hogy azok a biomolekulák, amelyek ma az élet építőkövei, egy szelekció végeredményeinek tekinthetők? Mindenesetre érdekes, hogy az élő szervezeteket felépítő szerves molekulákban aminosavaknál majdnem kizárólagos az L-aminosavak és cukrok esetében a D-cukrok jelenléte. Ha ezeknek a molekuláknak és tükörképi párjaiknak a képződési energiáit tekintjük, akkor azt kell tapasztalnunk, hogy azok gyakorlatilag azonosak, vagy csak olyan kicsi közöttük a különbség, hogy azt a mai technikával még nem tudjuk megmérni. A biológiai homokiralitás eredetére számos teóriát állítottak fel, azonban tudományos megalapozottsággal és minden kétséget kizáróan választ egyik elmélet sem tud nyújtani [1,2,3]. Az emberi szervezet egy magas fokon szervezett királis objektum, a benne lezajló biokémiai folyamatok nagyfokú sztereospecifitással bírnak. Amennyiben ezeket a folyamatokat befolyásolni kívánjuk, úgy tekintettel kell lenni a biológiai homokiralitásra. Ez leegyszerűsítve azt jelenti, hogy a gyógyszeres terápiával megcélzott receptor számára a megfelelő konfigurációjú és konformációjú komplementer molekulát kell a szervezetbe bejuttatni. Ha nem a megfelelő kulcsot használjuk a megfelelő zárhoz, annak számos következménye lehet. Ezen következmények közül a legkevésbé káros, ha a biológiai/terápiás hatást hordozó izomer (eutomer) mellett előforduló másik izomer (disztomer) gyengébb hatást vált ki. Farmakológiai szempontból kevésbé jó, de elfogadható megoldás az is, ha a disztomer hatástalan. Ilyenkor a szervezet méregtelenítő funkcióit ugyan feleslegesen terheljük, de legalább más káros mellékhatás nem jelentkezik. Legkevésbé kívánatos, ha a disztomer valamilyen toxikus 7
mellékhatásért felelős. Ennek egyik legjelentősebb és legnagyobb vihart kavaró példája a Contergan /thalidomid/ botrány volt [4-5]. Egy alapvetően jó, előnyös hatásokkal rendelkező szedato-hipnotikus vegyület az R-(+)-thalidomid enantiomerpárja az S-(-)-thalidomid teratogén hatásúnak bizonyult, aminek következtében súlyos rendellenességgel jöttek világra azok a csecsemők, akiknek az édesanyját a terhesség folyamán thalidomidot tartalmazó gyógyszerrel kezelték. Ez a tragikus eset a gyógyszerkutatással, gyógyszergyártással foglalkozó szakemberek figyelmét a kiralitással kapcsolatos kérdésekre irányította. Napjainkban a Contergan per eredményeként egyre inkább tendencia, hogy az eddig racém gyógyszermolekulák közül csak a hatásos, homokirális komponens (eutomer) kerüljön forgalomba. Természetesen ma még gazdasági megfontolások is szerepet játszanak abban, hogy egy racém keverékből kihagyható-e a disztomer, de a jövőben elsődlegesen a farmakológiai evidenciáknak kell érvényesülniük. Az Európai Közösség az elmúlt öt évben számos ajánlást fogadott el ebben a kérdéskörben. A legfontosabb ezek közül, hogy királis molekulák esetében mind a két izomerrel el kell végezni a fiziko-kémiai, farmakológiai és toxikológiai vizsgálatokat. További, a kutatás költségvetését terhelő vizsgálatsor elvégzése szükséges a szterokémiai stabilitással kapcsolatban [6], amely kiterjed mind az in vitro és az in vivo vizsgálatokra is. Nyomon kell követni a farmakon sorsát az előállítás, a formulálás, a biohasznosíthatósági és farmakológiai vizsgálatok során. A sztereokémiai stabilitás vizsgálat tehát ki kell hogy terjedjen a molekula inverziós és racemizációs tulajdonságainak a vizsgálatára is, ellentétben az akirális molekulákkal, ahol erre a típusú vizsgálatra nincs szükség. A helyzet hasonló a generikus készítményekkel is. Az irányelvek szerint a királis hatóanyagot tartalmazó készítményeknél ugyanazokat a gyártási és ellenőrzési standardokat kell alkalmazni, mint azt az eredeti molekulánál. Mindez talán még kézenfekvőbb, ha figyelembe vesszük azt, hogy az egyik legnagyobb gyógyszer adatbázisban [7] szereplő mintegy 6000 vegyület közül több, mint 50% a királis molekula. Ugyanakkor egy másik felmérés szerint 8
[8] a 100 legnagyobb mennyiségben forgalmazott gyógyszer 20%-a olyan, mely szintetikus eredetű és rendelkezik királis szénatommal. A 20 molekula közül azonban jelenleg még csak három, a naproxen, a methyldopa és phenylephrin az, amelyeket egyes (single) enantiomerként forgalmaznak. A fentiek tükrében úgy vélem, könnyen belátható a kiralitással kapcsolatos kutatások jelentősége, valamint az ilyen jellegű vizsgálatok fontossága. További érv a terület fontossága mellett az a tény is, hogy napjaink modern gyógyszerkutatása is egyre több figyelmet szentel a potenciális új hatóanyagok tervezése során a molekulák 3 dimenziós vizsgálatának, a korábban alkalmazott 2 dimenziós modellekkel szemben. Ebben a megközelítésben a konformáció és a konfiguráció együttes értelmezése minőségileg új szemléletet eredményez. Minél több betegség esetében ismerjük a biokémiai hátteret és minél több betegség esetében ismerjük a gyógyszerek támadáspontját jelentő receptorok szerkezetét, annál könnyebben lehet a receptor kötőhelyére illeszkedő molekulát tervezni, vagy értelmezhetővé válik az enantiomerek és a diasztereomerek esetében a hatás különbözősége. 9
2. CÉLKITŰZÉSEK A bevezetőben talán sikerült rámutatnom azokra a tényekre, melyek indokolják a kiroptikai analizis létjogosultságát, jelentőségét és korszerű voltát. Céljaink között olyan új elvek és módszerek kidolgozása szerepelt, melyek előrevihetik a kiroptikai analízissel kapcsolatos kutatásokat. 1992-93-ban, amikor két sikeres pályázat (OTKA Műszerpályázat valamint FEFA II) eredményeként, az akkor még csak két főből ( Dr. Gergely András és Dr. Horváth Péter ) álló kutatócsoport megalakította a Gyógyszerészi Kémiai Intézet keretén belül működő kiroptikai munkacsoportot, még nem volt igazán kialakult képünk arról, hogy az új műszer, a Jasco J-720 Spectropolarimeter milyen kitűnő mérési lehetőségekkel rendelkezik. Minden alkalmat felhasználtunk, hogy tudományos kapcsolatokat építsünk ki, kutatási együttműködésekben vegyünk részt és korábbi munkáink során szerzett tapasztalatainkat kamatoztassuk, ötleteinket egy világszínvonalú készülék segítségével valósítsuk meg. Hamarosan láthatóvá vált, hogy a kiroptikai analízis egyik legdinamikusabban fejlődő területe a kiroptika detektálás és még számos lehetőség kínálkozik a CD detektálás előnyeinek a kihasználására. Akkoriban kereskedelmi forgalomban lévő dikrográfot nem, csak ORD készüléket használtak kromatográfiás elválasztást követő kiroptikai detektálásra, de annak hátrányai a kisfokú érzékenység, vagy inkább érzéketlenség és a szelektivitás hiánya- miatt csak igen kisszámú publikáció látott napvilágot. A CD készülékekben alkalmazott technikai fejlesztések és a két módszer /CD-ORD/ elvi különbözőségéből adódó, a CD spektroszkópia javára megmutatkozó előnyök inspiráltak arra, hogy jelentős erőfeszítéseket tegyünk a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia és a CD-spektroszkópia összekapcsolására. Jelen értekezésben ezen erőfeszítések eredményeiről szeretnék számot adni, kiegészítve a fenti alapkutatással összefüggő, a gyógyszeranalitikában előnyösen használható közvetlen CD spektroszkópiás módszerekkel 10
3. IRODALMI HÁTTÉR 3.1. KÉMIAI EGYENSÚLYOK A kiroptikai spektroszkópia (CD és ORD) felhasználása kémiai egyensúlyok tanulmányozására csak szórványosan fordul elő az irodalomban, aminek számos oka van. Elsőként említendő, hogy a kiroptikai készülékek igen drágák, és ez a tény elterjedésüket nagymértékben gátolja. Másodsorban a módszer korlátja a vizsgálható molekulák köre. Mivel kiroptikai berendezésről van szó, magától értetődik, hogy a vizsgált egyensúlyban résztvevő anyagok közül legalább az egyiknek királis anyagnak kell lennie. A módszer előnyeként feltétlenül megemlítendő, hogy abban az esetben, amikor csak az egyik komponens optikailag aktív, nagymértékű szelektivitás érhető el a kiroptikai módszerekkel, mivel csak a királis komponens fiziko-kémiai tulajdonságaiban beálló és a kiroptikai tulajdonságokra hatással lévő effektusok okoznak a mért jelben változást. A kiroptikai spektroszkópia használata során a mért jel intenzitása és a mérendő anyag koncentrációja közötti összefüggés analóg a fényelnyelés és a koncentráció közötti összefüggéssel, így ez utóbbira alkalmazható elvek érvényesek a kiroptika módszerekre is [9]. Protonálódási állandók meghatározására az abszorpciós spektrofotometria mintájára mind az ORD, mind pedig a CD spektroszkópia előnyösen alkalmazható. Katzin és Gulyás [10] valamint Beck és munkatársai [11] polarimetriás módszerrel a borkősav savi disszociációs egyensúlyait határozták meg. A CD spektroszkópia szelektivitása és érzékenysége számos előnyt jelenthet, ennek ellenére csak szórványosan fordul elő használata protonálódási egyensúlyok vizsgálatában [12,13] Szarvas és Tibély az almasav molibdát-komplexeit vizsgálta [14]. Mannit és szorbit hidrogénhidas anion-komplexeinek stabilitási állandóinak [15]* valamint borát- molibdát-komplexeinek [16] stabilitási állandóinak meghatározására is alkalmazták a polarimetriát. Purdie efedrin és pszeudoefedrin enantiomer-tisztaságának meghatározására alkalmazta a réz- 11
borkősav és a réz-efedrin illetve réz pszeudoefedrin komplexek közti stabilitás különbségen alapuló ligandumcserés eljárást [17]. A biokémiai folyamatok között alapvető tejsav oxidációt végző laktát dehidrogenáz enzim laktát kötőhelyén kialakuló, az arginin guanidinó és a laktát karboxilát-csoportja között létrejövő kölcsönhatást modellező laktát-guanidinium asszociáció egyensúlyi állandóit szintén polarimetriás módszerrel határozták meg [18]*. Kirkwood a 2- hidroxi-bután rotációs egyensúlyait [19], míg Noszál az almasav rotamikrospeciációját tanulmányozta[20]*. 3.2. A KIROPTIKAI MÓDSZEREK ANALITIKAI ALKALMAZÁSAI 3.2.1 GYÓGYSZERKÖNYVI MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS Mind a külföldi, így az európai [21], mind pedig a hazai gyógyszerkönyvek [22] királis anyagok esetében gyakran előirják az optikai tisztaság vizsgálatát. Az optikai forgatóképesség használatos hosszú évtizedek óta az optikai tisztaság vizsgálatára, amely mérés egyben az anyag tisztaságának is fokmérője egyben. A mérést általában a Na D -vonalán elvégezve, a bemérési koncentráció és a leolvasott forgatási érték ismeretében kiszámolható a fajlagos forgatóképesség. A gyógyszerkönyvek megadják az elfogadhatóság alsó és felső határát, az ezek közé eső értéket elfogadhatónak tekintik. A forgatóképesség mérése azonban nem tekinthető szelektívnek, mert az oldatban jelenlévő összes anyag (ami magában foglalja a szennyezésként jelenlévő anyagokat is) együttes forgatási értékét méri, ezért csak az összes többi, a cikkelyben szereplő tisztaságvizsgáló módszerrel együttesen értékelhető. Sokkal informatívabb lenne a CD spektrumon alapuló optikai tisztaságvizsgálat, azonban ez a CD készülékek igen magas ára miatt ma még általánosan nem kivitelezhető, bár az Európai Gyógyszerkönyvben már hivatalos fiziko-kémiai vizsgálati módszer a CD spektroszkópia. Hasonló a helyzet a vegyszerkatalógusokkal illetve egy új szintetikus vegyület jellemzése esetén is. A jelenlegi, Na D -vonalra vonatkoztatott forgatási értékek helyett az abszorpciós- vagy infravörös spektroszkópia mintájára az anyag jellemző Cotton-hatás görbéjének maximum helyein mérhető intenzitás 12
értékeit kellene megadni, ami nem csak az anyag tisztaságára, hanem kémiai szerkezetére is adna némi utalást. 3.2.2 OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK KÖZVETLEN MEGHATÁROZÁSA A CD spektroszkópia alapelvét tekintve (lásd 23.old.), mindazok a méréstechnikák alkalmazhatók, amelyek az abszorpciós spektrofotometriában, természetesen azzal a megkötéssel, hogy alkalmazhatósági köre csak az optikailag aktív anyagokra terjed ki. Ennek megfelelően, ahol a mért jel és a koncentráció között lineáris összefüggés áll fenn, ott mennyiségi meghatározásra alkalmas a módszer. Különösen gyakori területe a CD spektroszkópia alkalmazásának a szteroid analitika. Gergely összefoglaló munkájában [23] részletes képet ad a szteroidok körében elvégzett vizsgálatokról. A CD spektroszkópia kábítószeranalitikai célokra történő általános felhasználására tesznek javaslatot Purdie és mtsai [24-29]. Tetrahidrokannabinol és kannabinol egymás mellett meghatározható, a két hatóanyag arányából a drog földrajzi származási helyére is következtetni lehet [25]. Lizergsav dietilamid /LSD/ kvantitatív meghatározását lehetett szelektíven elvégezni elkobzott mintákból, a segédanyagok szeparálása nélkül [26]. Morfinvázas alkaloidok körében, azok meglehetősen előnyös kiroptikai tulajdonságai miatt a módszer szintén jól használható [27]. Az egyik leggyakrabban alkalmazott kemény drog, a heroin szelektíven határozható meg a hígítására használt egyéb anyagok mellett [28]. Ópium extraktumban és pantoponban különböző ópium alkaloidok együttes jelenléte esetén is szelektíven meghatározható a morfin, a kodein, a tebain és a noszkapin [29]. Palma és munkatársai kodein és kokain tartamú tabletták spektropolarimetriás meghatározását írták le [30]. Módszerüket összehasonlították az Amerikai Gyógyszerkönyv (USP-XXII) azonos cikkelyeivel és azt találták, hogy a pontosság tekintetében ugyan azonos teljesítőképességű a módszerük, de a kiroptikai eljárás gyorsabb és specifikusabb. 13
Az antibiotikumok, köszönhetően természetes eredetüknek, gyakorlatilag mind királis molekulák. Ezt felhasználva számos antibiotikum, mint pl. tetraciklinek [31] és β-laktám származékok [32] meghatározására lehetett felhasználni a CD spektroszkópiát. Gortazar és mtsai vizelet mintákból határoztak meg sikeresen ampicillint, cephalexint és cephoxitint [33]. 3.2.3 OPTIKAILAG AKTÍV ANYAGOK SZÁRMAZÉKKÉPZÉSEN ALAPULÓ MEGHATÁROZÁSA Az élő szervezetekben leggyakrabban előforduló biomolekulák, mint pl. cukrok, aminosavak többnyire nem rendelkeznek olyan kromofór csoporttal, amelyek lehetővé tenné ezen molekulák közvetlen CD spektroszkópiás meghatározását. Szükség lehet továbbá olyan esetekben is származékképzési reakcióra, amikor a molekula CD és UV jelének hányadosa, az anizotrópia faktor nagyon kis érték. A származékképzési reakciókat olyankor érdemes tehát végrehajtani, ha a kidolgozott eljárás az alább felsorolt előnyök közül legalább egyet kiaknáz: 1.) a kromofór csoport bevitele új, optikailag aktív elnyelési sávot eredményez, 2.) szelektív hullámhosszon történő mérést tesz lehetővé, 3.) növeli a meghatározás érzékenységét. Fenti előnyöket jól mutatja egy, kutatócsoportunk által javasolt eljárás, amely a Sanger reagens (2.4-dinitrofluorbenzol /DNFB/) alkalmazásán alapul. Segítségével fenil-alkil-amin tipusú gyógyszer- és kábítószer-molekulák meghatározását [34] végeztük el. A Sanger reagenst több, mint ötven éve primer és szekunder aminok, /pl.: aminosavak/ meghatározására használják. Egyik általános felhasználási területe a kromatográfia, ahol a fentebb említett vegyületek kromatográfiás UV-detektálhatóságának javítására alkalmazzák [35]. A másik felhasználási terület a spektrofotometria, amikor nagy moláris abszorpciós koefficiensű származék képzése és ezen keresztül a kvantitatív mérés kivitelezése a cél [36]. 14
A Sanger reagens alaninamiddal módosított változata a Marfey reagens (1-fluor-2,4-dinitrofenil-5-L-alaninamid), amely királis származékképzőként nem csak a kiroptikai tulajdonságok javítására, hanem enantiomerek elválasztásának szándéka esetén diasztereomerpár-képző reagensként is alkalmazható. [37] 3.2.4. AZ INDUKÁLT OPTIKAI AKTIVITÁS MÉRÉSÉNEK LEHETŐSÉGEI Az indukált optikai aktivitás mérésén alapuló közvetlen analitikai mérések száma igen csekély, aminek oka, hogy ezeknél a módszereknél mindig található egyszerűbb, szelektívebb vagy érzékenyebb eljárás. Az indukált optikai aktivitás mérésének két olyan területe van mégis, amely mindenképpen említést érdemel. Az egyik felhasználási terület az optikai izomerek kromatográfiás elválasztása ciklodextrinnel képzett zárványkomplexeik alapján. A zárványkomplexek eltérő stabilitása lehetőséget ad kromatográfiás elválasztásukra. A ciklodextrin belső üregében a nagyobb stabilitással kötődő részecske több időt tölt el, mint a kevéssé kötődő. Ezen zárványkomplexek vándorlási tulajdonságai viszont különböznek a nem zárványként vándorló molekuláétól. Ez igaz az állófázishoz kötött és a mozgófázisban oldott ciklodextrinek esetében is. Akirális komponensek kötődésének jellemzésére is felhasználható az indukált optikai aktivitás mérése [38]. Kellően nagy stabilitás különbség vagy az üreg belsejének szerkezetét módosító származékképzők révén létrejövő sztérikus gátlás esetén királis molekulák felismerésére is alkalmasak lehetnek a ciklodextrin-származékok [39]. Királis anyagok inkorporálódása során az eredeti CD spektrum gyökeres megváltozása figyelhető meg pl. L-cocain és β- ciklodextrin illetve retinolsav és β-ciklodextrin kölcsönhatásakor [40,41]. A másik érdekes terület a fehérjék és gyógyszermolekulák kötödésének vizsgálata. A CD spektroszkópia alkalmas oldatfázisban lévő fehérjék rendezett szerkezeti elemeinek (β-kanyar, α-hélix, β-redőzött réteg) vizsgálatára illetve a fehérje spektrumából következtetni lehet egyes szerkezeti elemek százalékos mennyiségére [42]. A humán szérum albumin (HSA) esetében nem csak becsülni lehet ezen rendezett szerkezeti elemek mennyiségét a fehérjén belül, 15
hanem pontosan lokalizálni is lehet őket. A fehérjének ugyanis ismert a teljes aminosav szekvenciája, másodlagos és harmadlagos szerkezete [43,44] valamint legjellemzőbb kötőhelyei is. A tiszta fehérje CD spektruma a gyógyszermolekula kötődése után megváltozik. A spektrum változása jó indikátora a vendég-molekula kötődésének, sőt a kötődés helyére is következtetni lehet. CD spektroszkópiás módszerrel tanulmányozták a HSA benzodiazepin-kötő helyét [45], a szulfadimetoxin és fő metabolitjainak [46] valamint kinolon-karbonsavak kötő helyeit [47]. Ascoli és mtsai különböző gyógyszermolekulák sztereospecifikus és kompetitív kötődési tulajdonságait tanulmányozták differencia CD spektroszkópiás vizsgálattal HSA esetében [48]. 3.2.5 KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁBAN Az elválasztástechnikai módszereket (GC, HPLC, TLC, CE) széles körben alkalmazzák mind a rutin vizsgálatokban mind pedig a kutatás-fejlesztés során. A bevezetőben említett okok miatt a legdinamikusabban fejlődő ágazat a királis anyagok elválasztásával foglalkozó terület és ezen belül is az enantiomerekkel foglalkozó közlemények nagy száma érdemel figyelmet. Jól mutatja a fejlődés ütemét az 1. ábra. Enantiomerekkel kapcsolatos közlemények száma (db/év) 800 Enantiomer 'Enantiomer' and 'Separation' 730 744 722 757 650 600 585 568 508 438 400 303 200 0 221 200 211 151 131 98 81 65 51 32 29 34 33 37 5 10 5 6 11 12 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 1. ábra. Enantiomerekkel illetve enantiomerek elválasztásával kapcsolatos közlemények száma az SCI. alapján 16
Az ábrán látható adatok nem abszolút számokat tükröznek, mivel csak azokat az irodalmi hivatkozásokat tudtam figyelembe venni, amelyeket a Science Citation Index (SCI) referál. A keresés során kulcsszóként elsőként csak az enantiomer, majd az enantiomer AND separation kombináció szerepelt. Az 1998-as évre kapott értékeket túl alacsonynak tartottam (57 és 13) ezért a statisztikából kihagytam. A 2000. évre beírt adat becsült adat. A 2000 október 22.-i dátummal frissített adatbázis 631-es enantiomer találata és a 253-as kombinációs keresés eredménye alapján becsültem meg az éves mennyiséget. A grafikonból jól látszik, hogy az enantiomerekkel kapcsolatos cikkek száma ugrásszerűen nőtt meg 1991-ben, de azóta is növekvő tendenciát mutat. Az enantiomerek elválasztásával kapcsolatos cikkek száma szintén növekedést mutat, de ez a növekedés sokkal egyenletesebb, mint az enantiomerekkel kapcsolatos összes publikáció mennyisége. Az utolsó másfél évben (1999-2000 június) megjelent összesen 370 enantiomer elválasztással foglalkozó tudományos közlemény 48%-a (177) kapilláris elektroforézist (CE), 44%-a (163) nagyhatékonyságú folyadék kromatográfiát (HPLC) és a maradék 8% egyéb technikát alkalmaz. Tovább szűkítve a kört a HPLC-s technikára, összesen 3 közlemény jelent meg, amelyekben CD detektort alkalmaztak [49,50,51] és két alkalommal használtak egyéb optikai aktivitáson alapuló detektort. A közeljövőben várhatóan tovább fog emelkedni a királis CE használatának aránya a HPLC-vel szemben, viszont a technikai lehetőségekből adódóan a CE/kiroptikai detektálás kombináció kivitelezése kereskedelemben is hozzáférhető műszerek esetében jelenleg még nem megoldott. Szintén növekedés várható a HPLC-CD technikát alkalmazó eljárásokkal kapcsolatos publikációk számában, amelyet alátámaszt az a tény, hogy 1998- ban jelent meg az első, kimondottan CD-detektorként forgalmazott berendezés [52]. Megjelenéséig csak házilag barkácsolt illetve a kereskedelmi forgalomban kapható spektropolariméterek átalakítása tette lehetővé ilyen irányú felhasználásukat. Gergely összefoglaló munkájában [53] áttekintő képet ad a kiroptikai detektorokról (OR és CD), azok felhasználási és alkalmazási lehetőségeikről. A CD detektálás előnyeit és hátrányait ismerteti részletesen Zukowski [54]. A 17
módszer legnagyobb előnye a szelektivitás. Akirális molekulák nem zavarnak, és így elvileg az eluens megválasztásában sincsenek korlátok. 1. Előnyös, hogy elégtelen elválasztás esetén az akirális komponensek nem zavarják a meghatározást. Enantiomerek elválasztásánál pedig a szelektivitás egyedülálló, mivel ellentétes előjelű kromatográfiás csúcsokat ill. spektrumokat detektálhatunk. Hátrányként sorolható fel, hogy az érzékenység nem mindig kielégítő, továbbá elsősorban az alacsonyabb hullámhosszaknál történő detektálások esetén a jel/zaj viszony intenzívebben romlik mint az UV detektorok esetében. A kiroptikai detektálás speciális esete az a módszer, amikor a kiroptikai detektort egy másik detektorral sorbakötve vagy szimultán használják. Ilyenkor a kiroptikai detektor a királis komponensek, -többnyire enantiomerek arányát méri-, míg az akirális detektor a minta összmennyiségéről ad felvilágosítást. E téren Mannschreck és mtsai [55 a-d] valamint Bertucci és mtsai [56 a-c] fektették le az alapokat, elsősorban enantiomer tisztaság vizsgálatra alkalmas HPLC-CD/UV eljárást kidolgozva, másodsorban az elválasztás során történő CD-spektrum regisztrálás terén volt úttörő jellegű munkájuk. Fentiek ismeretében sikerült az elveket általánosítani valamint a módszer alkalmazási területét lényegesen bővíteni és mind az on-line CD spektrum regisztrálás terén [57]* mind pedig a kettős detektálás témakörében új eredményeket elérni [58,59]*. Enantiomerek elválasztásának és az elválasztás nyomon követésének egyik speciális esete, -ahol a kettős detektálás előnyösen alkalmazható-, amikor olyan molekulák izomerjeit kell elválasztani, ahol a királis szénatom konfigurációja mellett a helikális kiralitásnak is döntő szerepe van, ráadásul a két módosulat (P, M) egymásba át is alakulhat. Ha az átalakulás sebessége és a kromatográfiás elválasztás időskálája azonos nagyságrendbe esik, úgy lehetőség van az egyes speciesek jellemzésére, azonban az elúció sorrendjének megállapításához szükség van az elválasztás során az egyes 1 Az eluenssel kapcsolatban azonban feltétlenül meg kell jegyezni, hogy a túl nagy abszorpció a disszimetria faktort előnytelenül befolyásolja valamint alulról korlátozza a detektálás hullámhosszát és rontja a jel/zaj arányt. 18
csúcsokból felvett spektrumok vizsgálatára is. A racém keverékként forgalomba kerülő Tofizopám esetében a kromatografálás közben felvett on-line CD és UV spektrumok alapján lehetőség volt az egyes izomerek spektrumának rögzítésére és a négy izomer elúciós sorrendjének a megállapítására is [60]. 3.2.6. ENANTIOMEREK MEGHATÁROZÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA ALKALMAZÁSA NÉLKÜL Enantiomerek egymás mellett történő meghatározásának kétségkívül leggyakrabban alkalmazott módszere az, ha az enantiomerpárokat egymástól valamilyen szeparációs technika segítségével elválasztják. Ez vagy királis állófázison történő elválasztást jelent, vagy az elválasztás során az eluensben valamilyen királis segédanyagot oldanak és az on-line képződő diaszereomerek különböző tulajdonságai alapján válnak el az enantiomerek. Ilyenkor már nincs szükség királis állófázisra sem. A harmadik lehetőség az, amikor valamilyen diasztereomerpár-képző reagenssel előzetesen diasztereomerré alakítják az enantiomereket, majd szintén akirális körülmények között történik meg az elválasztás. Elválasztástechnika alkalmazása esetén azonban nincs feltétlenül szükség kiroptikai detektálásra, legfeljebb az elúció sorrendjét nem lehet a regisztrált kromatogramból közvetlenül megadni. A szakirodalomban leggyakrabban alkalmazott, nem syeparáción alapuló módszer az enantiomer arány meghatározására az H NMR spektroszkópia [61]. Királis shift reagenseket alkalmazva a képződő diasztereomer komplexekben különböző kémiai eltolódással jelennek meg bizonyos protonok jelei az egyik illetve a másik diasztereomer komplexben [62,63] Ladányi és mtsai termoanalitikai eljárást dolgoztak ki selegilin enantiomer összetételének vizsgálatára [64]. Purdie réz(ii)-tartarát tartalmú komplexek segítségével vizsgálta efedrin és pszeudoefedrin enantiomerek tisztaságát [17]. A kromatográfiában alkalmazott kettős CD/UV detektálás alapelvét felhasználva a két jel hányadosán alapuló enantiomer arány meghatározására szolgáló általunk kidolgozott módszerünkről [65]* e dolgozat későbbi fejezetében írok részletesen. 19
4. MÓDSZEREK 4.1 KIROPTIKAI MÓDSZEREK 4.1.1 AZ OPTIKAI AKTIVITÁS ALAPFOGALMAINAK ÁTTEKINTÉSE Az optikai aktivitás jelenségét kvarckristályok optikai vizsgálata során 1811-ben Arago fedezte fel, aki megállapította azt is, hogy a kristályrács felbomlásával az optikai aktivitás megszűnik. Nem sokkal később Biot (1815) a borkősav oldatában is felfedezte ezt a jelenséget. A következő nagy lépést Pasteur tette meg, amikor szőlősavból jobbra és balra forgató borkősavat izolált. Feltételezése szerint a különbségeket a molekulák térszerkezetére lehetett visszavezetni és egyben arra is magyarázatot adott, hogy oldatfázisban miért mérhető optikai aktivitás. Az idő és a tudomány Pasteurt igazolta. A szerkezetvizsgáló módszerek fejlődésével manapság már igen nagyméretű és bonyolult molekulák (pl. fehérjék) térszerkezetét is fel lehet deríteni. Egy molekula térszerkezetét két alapvető izoméria, a konfigurációs és a konformációs izoméria határozza meg. A konfiguráció az egy atomhoz közvetlenül kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok relatív helyzetét írja. le. Azonos konstitúciójú, de különböző konfigurációjú molekulák egymásba csak kémiai kötés/ek/ felszakításával alakíthatók át. A konfiguráció leírására elsőként az Emil Fischer által javasolt D és L megkülönböztetést használták. Fischer a cukrok konfigurációját kémiailag a jobbra forgató és általa D-vel jelzett glicerinaldehidre vezette vissza. Centrális kiralitás esetén a centrális atomhoz kapcsolódó szubsztituensek sorrendjének leírására napjainkban a Cahn-Ingold-Prelog konvenció alapján történik és attól függően, hogy a körüljárási irány az óramutató járásával megegyező, vagy ellentétes, annak függvényében az R (rectus=jobb) vagy S (sinister=s) jelölést alkalmazzuk. A konformáció az egymáshoz közvetlenül nem kapcsolódó atomok vagy atomcsoportok egymáshoz viszonyított relatív helyzetét írja le. Az egyszeres kötések mentén történő rotáció során az egyes rotamerek különböző energiájú állapotokat képviselnek, ennek megfelelően energetikailag kedvezőbb energiaminimumok és kedvezőtlenebb energiamaximumok jellemzik az egyes 20
konformációkat. A konformerek energiatartalmuktól függően eltérő populációval rendelkeznek egymásba átalakulhatnak, így konformációs egyensúlyok jöhetnek létre. A rotáció időskálája meglehetősen kicsi, így a legtöbb fizikokémiai vizsgáló módszerrel csak az egyensúlyi állapotot tudjuk vizsgálni. Meglehetősen nagy, mintegy 25 kcal/mol energiagát szükséges ahhoz, hogy két konformert el lehessen választani egymástól, azaz a molekulának ekkora energiával kell rendelkeznie, hogy egyik stabil konformációból egy másik stabil konformációba billenjen át. Fentiek alapján a térszerkezet leírásakor a konfiguráció, a konformáció és a molekula dinamikáját együttesen kell szemlélni. A centrális kiralitás mellet (amely a molekulák kiralitásának hordozója az esetek túlnyomó többségében) feltétlenül meg kell említeni az axiális, a planáris és a helikális kiralitás lehetőségét is [66]. Gyógyszer és biomolekulák kiroptikai vizsgálata során elsősorban a centrális és a helikális kiralitásnak van nagy jelentősége. Amennyiben egy molekula esetében csak egy királis centrum van, akkor konfigurációját tekintve ennek a molekulának csak egy konfigurációs izomerje lehet. A két molekula egymásnak tükörképi párja és egymásnak enantiomerjei. Több királis centrum (n) esetén 2 n sztereoizomer építhető fel, azonban ezek közül csak a tükörképi molekulák enantiomer párok, a többi izomer egymással diasztereomer viszonyban áll. A diasztereomer vegyületek fizikai-kémiai tulajdonságai eltérőek /pl. oldódási vagy megoszlási tulajdonságaik különbözőek, így kromatográfiásan egymástól akirális körülmények között is elválaszthatók/, az enantiomer párok esetében a legtöbb fiziko-kémiai tulajdonságban nincs különbség, közvetlenül csak királis kromatográfiával szeparálhatók. Kiroptikai módszerekkel azonban az enantiomerek megkülönböztethetőek és meghatározhatók. 21
4.1.2 A KIROPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA MÓDSZEREI A kiroptikai spektroszkópia tárgykörébe két alapvető spektroszkópiás módszer tartozik: 1.) Az optikai rotációs diszperzió (ORD) és 2.) A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia. E két alapmódszer mellett számos, napjainkban még analitikai célra kevéssé használt eljárás, mint pl. a lineáris dikroizmus /LD/, a külső mágneses tér által indukált optikai aktivitás mérésére alkalmas magnetooptikai eljárások /MORD, MCD/, a folyadékkristályok által indukált cirkuláris dikroizmus /LCICD/, a fluoreszcenciás emissziós CD /FDCD/ és a cirkulárisan polarizált lumineszcencia /CPL/ említhető. 4.1.3 ELMÉLETI ALAPOK Az abszorpciós spektrofotometriában használatos fénysugár összetevői között nem találunk kitüntetett rezgési síkot. A kiroptikai spektroszkópiában azonban ebből a heterogén rezgési sík halmazból kiszűrik azokat a komponenseket, melyeknek rezgési síkja eltér egy meghatározott síktól és csak az egy engedélyezett síkban rezgő komponens halad át a szűrőn, amelyet lineárisan polarizált fénysugárnak neveznek. A lineárisan polarizált fénysugár két egymással ellentétes, cirkulárisan polarizált komponensre bontható fel (más szemszögből nézve azok eredőjének is tekinthető). A cirkulárisan polarizált fénykomponensek bal vagy jobb csavarmenetnek megfelelően mozognak. A helikális és az előre mutató elmozdulás egy időben történik meg és rezgési amplitúdója állandó. Akirális közegen áthaladva mindkét komponens azonos mértékben abszorbeálódik, a rezgési sík változatlan marad, csak a rezgés amplitúdója csökken az abszorpció következtében. Abban az esetben azonban, amikor a polarizált fény királis közegen halad keresztül, a két komponens törésmutatója /n j és n b / -ezzel összefüggésben a közegben való haladás sebessége- valamint abszorpciója is különböző lesz. Az abszorpció különbségből adódóan a két fénysugár eredő vektora egy ellipiszist fog leírni, a fáziseltolódásból adódóan pedig ennek az ellipszisnek a 22
nagytengelye α fokkal el fog hajolni. Ez az α érték az elforgatás szögét (forgatóképesség) adja meg egy adott hullámhossznál. Az egyes anyagokra jellemző forgatási értéket a fajlagos vagy a moláris forgatóképességgel szokás megadni. A fajlagos forgatás [10-1 fok cm 2 g -1 ] (1) és moláris forgatás [10 fok cm 2 mol -1 ] (2) a következő egyenletekkel adható meg: [ ] T α λ = α l c (1.) ahol l a rétegvastagság [dm], c pedig a koncentráció [g ml -1 ] [ Φ] T λ = [ α] T λ M 100 (2.) A forgatóképesség változását a hullámhossz függvényében ábrázolva ORD spektrumot kapunk. Az ellipszis kis- és nagytengelye által bezárt szög arcus tangense az ellipticitás ( Θ ). A moláris ellipticitást [Θ] a 3. képlet fejezi ki. Θ M l c 100 T [ Θ] λ = = 3300 ε (3.) ahol ε a moláris cirkuláris dikroizmus. [ 1 mol -1 cm -1 ]. Az ellipticitás változása a hullámhossz függvényében a CD spektrumot eredményezi. A harmadik egyenletben szereplő ε tag egyben a diszimmetria faktor (g) megadásánál is fontos. A diszimmetria faktor a molekula moláris cirkuláris dikroizmusának és moláris abszorbanciájának a hányadosa. (4.) Az ellipticitás annál előnyösebben mérhető, minél magasabb a g-érték az adott hullámhossznál. g = ε ε (4.) 23
4.1.4 AZ UV-VIS, A CD ÉS AZ ORD SPEKTROSZKÓPIA ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mindhárom módszer hullámhossz-tartománya ugyanaz. Az UV spektrum nagy intenzitású sávokat, széles burkológörbéket ad. Míg az UV-VIS spektrumok a molekulában előforduló ε j kromofór csoportok minőségére és esetenként elhelyezkedésére jellemzőek, a CD spektrumok a kromofórok ε b térbeli elrendeződéséről, vagyis a molekulák térszerkezetéről adnak n j felvilágosítást. A CD spektrum esetén a jobbra (ε j ) és a balra (ε b ) cirkulárisan polarizált fény abszorbanciájának különbségét detektáljuk, ebből következően a CD sávok lehetnek pozitív vagy negatív előjelűek. A spektrum előjele a molekula kiralitásától függ. A sáv intenzitásának maximuma ugyanannál a hullámhossznál jelentkezik, mint az UV-VIS (ε b -ε j )= ε ε CD (n j -n b ) α spektrumban. Az elektrongerjesztéses spektrumok átfedő sávjai itt jobban 2. ábra.: CD, UV és ORD görbék elkülönülnek, élesebbek és a rezgési összefüggései finomszerkezet is jobban megfigyelhető. A CD és az ORD spektrum egymásba átszámítható, az egyik a másik ismeretében megszerkeszthető. Az átszámítást a Krönig-Kramers egyenlettel lehet megoldani. Az ORD spektrum egy maximummal és egy minimummal rendelkező görbe királisan perturbált kromofór csoportot tartalmazó molekula esetén. Elvileg kétszer annyi maximumot és minimumot tartalmaz, mint egy CD spektrum, ezek azonban a valóságban gyakran összeolvadnak, ezért nehezebben értelmezhetők, mint a CD spektrumok. Az n b 24
ORD görbe inflexiós pontja megegyezik a λ max értékével. A görbe elnevezése a nagyobb hullámhosszú Cotton hatás előjele szerint történik. Az ORD görbe csak a jelváltás hullámhosszán egyenlő nullával, így kiértékelése nehéz, több komponens esetén bonyolult spektrumot eredményez. A CD spektrum előnye, hogy az ellipticitás gyakran nulla, így kiértékelése egyszerűbb. Az ORD spektrum akkor előnyös, amikor a vizsgált molekulának a távoli UV tartományban (λ<180 nm) van elnyelése. Ebben a tartományban már nem lehet rutinszerűen mérni, viszont ezeknek a sávoknak hatása magasabb hullámhosszaknál is érvényesül, ellentétben a CD-vel, ahol csak az abszorpciós sáv hullámhossz tartományában van ellipticitás. A fentebb elmondottakat az 1. táblázatban foglalom össze. 1. táblázat: Az ORD és CD spektroszkópia legfontosabb tulajdonságainak összehasonlítása ORD CD Háttér vagy vázhatás Van Nincs Mit mérünk? Alkalmazási tartomány Kromofór sávok között átfedés Szelektív mérési hullámhossz Háttér vagy vázhatás okozta optikai rotáció Abszorpciós sávokon kívül (is) Van Nincs Királis vagy királisan perturbált kromofórok okozta ellipticitás Csak az abszorpciós sáv Többnyire nincs Van A CD spektrumok fölvételére a dikrográf, míg az ORD spektrum mérésére a spektropolariméter szolgál, bár az utóbbi időben a dikrográf helyett is spektropolariméter elnevezés használatos mind az irodalomban, mind pedig a műszergyártó cégek kiadványaiban. A Jasco cég által gyártott dikrográfot amilyennel a disszertációs munkám során én is dolgoztam- a gyártó cég is spektropolariméter megnevezéssel illeti, ezért dolgozatomban a továbbiakban a spektopolariméter elnevezést használom. 25
4.2 A NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA /HPLC/ ÉS A KIROPTIKAI DETEKTÁLÁS A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia működési elvével, elméleti hátterével és általános felhasználási lehetőségeivel jelen dolgozatban nem kívánok foglalkozni, mivel napjainkra minden fontos információ könnyen hozzáférhető tankönyvekből, szakkönyvekből és tudományos folyóiratokból. Napjainkban a jelentős műszergyártók (Hawlett Packard, Merck stb.) és kromatográfiás kiegészítőket (pl.: oszlopok, állófázisok stb.) forgalmazó cégek is külön kézikönyveket jelentetnek meg egy-egy analitikai célfaladat kivitelezéséhez szükséges információk minél könnyebb áttekintéséhez. A nyilvánvaló reklám mellett ezek a kézikönyvek számos, jól használható információval és tanáccsal segítik munkánkat. A legjelentősebb kromatográfiás szakfolyóiratok mellett az analitikai profilú folyóiratok is nagy számban közölnek kromatográfiás meghatározásokat, új eljárásokat és műszerfejlesztésről szóló cikkeket. Jelen fejezetben a többkomponensű elválasztások esetében gyakran előforduló részleges elválasztások felismerésével, átfedő kromatográfiás csúcsok felbontásával /dekonvolució/ és a csúcshomogenitás meghatározásával kívánok részletesen foglalkozni. 4.2.1.1 CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK A kromatográfiás csúcshomogenitás vizsgálata napjaink analitikájának nagyon fontos területe, amelyet az e témával foglalkozó közlemények magas száma is alátámaszt. Gyakran előfordul, hogy egymástól megfelelően el nem választható anyagok esetében a kromatográfiás csúcs nem mutat észrevehető torzulást. Gyakori, hogy két igen közeli retenciós idővel eluálódó komponens hasonló intenzitású csúcsa olvad össze megfelelőnek látszó szimmetriájú csúccsá vagy a retenciós idők teljes azonossága esetén valóban egyetlen csúcs jelentkezik. Több ízben előfordul, hogy közeli retenciós idők esetében a viszonylag kis koncentrációban lévő anyag jelenlétét nem lehet felismerni a kromatogramon. 26
További problémát jelenthet, ha az egyik komponens nagy feleslegben van a másikhoz képest és a minor komponens detektorjele kisintenzitású. Ilyenkor viszonylag tömény oldatokat kell alkalmazni, aminek eredménye a leadinges vagy tailinges csúcs. Fentiek miatt magasabb igényű kromatográfiás munka megköveteli a csúcs homogenitásának vizsgálatát. Ennek legelterjedtebb - ma már klasszikusnak számító - módszere az un. hányados módszer, amikor két megfelelően kiválasztott hullámhosszon megmért abszorpció arányát vizsgálják az idő függvényében. Homogén csúcsok esetében csúcs teljes hosszában konstans értéket kapunk. [67 a-e]. A diódasoros detektorok elterjedésével tetszés szerinti számú abszorbancia érték folyamatos regisztrálása is megoldható, így a két hullámhosszon történő detektálásnál érzékenyebb és több információt nyújtó matematikai megoldások születtek csúcshomogenitás vizsgálatára. [68 a-l]. A spektrumszupressziós technikát is megfelelő érzékenységgel alkalmazták a csúcshomogenitás ellenőrzésére[69 a-c]. A kiroptikai detektorok illetve a szimultán kettős kiroptikai/abszorpciós detektorok hasonló elven képesek átfedő kromatográfiás csúcsok homogenitásának ellenőrzésére, mint a diódasoros UV-detektorok. A nagysebességű spektrumfelvétel a kromatográfiás csúcs környezetében a komponensek teljes spektrális analízisét teszi lehetővé [57]*, részleteiről az Eredmények és a Megbeszélés fejezetben lesz szó. A CD/UV kettős detektálás sok tekintetben hasonlít a két hullámhosszú UV-detektáláshoz, azonban az előbbihez képest számos előnye van. Két eltérő fiziko-kémiai módszerrel történő detektálás esetében nagyobb annak a statisztikai valószínűsége, hogy két hasonló szerkezetű, tehát kromatográfiásan hasonló tulajdonságokkal rendelkező és ezért nem, vagy csak részlegesen elváló anyag esetében különbséget lehet találni a fiziko-kémiai paraméterekben. Ez elvileg bármilyen két detektortípus kombinálására érvényes, mi a lehetőségeinkből adódóan a CD/UV detektálást alkalmaztuk az elvek gyakorlati megvalósításakor. [58]* 27
4.2.1.2 A SZIMULTÁN KETTŐS CD/UV DETEKTÁLÁS ELVE ÉS ALKALMAZÁSÁNAK FELTÉTELEI A CSÚCSHOMOGENITÁS VIZSGÁLATÁBAN Elválasztástechnikai műveletek során gyakran előfordul, hogy az eluálódó anyagok mindegyikét nem tudjuk tökéletesen elválasztani, az anyagok csúcsai átfedik egymást. Ilyen esetekben fontos tudni, hogy melyik az a tartomány, amely tisztán tartalmazza az egyes komponenseket és a kromatogram melyik része az, ahol az elválasztás elégtelenségéből adódóan egynél több komponenstől származik a detektorjel. Kémiailag nagy hasonlóságot mutató anyagok esetében a fizikai-kémiai (pl. spektroszkópiás és kromatográfiás) tulajdonságok is általában nagy hasonlóságot mutatnak. Amennyiben a kétféle detektorjel a koncentrációval egyenes arányban változik, úgy felírható a következő két összefüggés: S A =A C és S B =B C (4., 5.) ahol S A az A típusú detektorjel (signal), S B a B típusú detektorjel, A és B az anyagra jellemző intrinsic mérőszám (pl. ε a spektrofotemetria esetén) és C a minta koncentrációja. A kétféle jelet elosztva egymással jutunk a (6) összefüggéshez: S G = S A B = A C B C (6.) A 6. egyenletből következik, hogy az így kapott hányados, -mivel a koncentrációkkal egyszerűsíteni lehet- gyakorlatilag csak A és B értékektől (amelyek az anyagra jellemző intrinsic paraméterek) függ, és a koncentrációtól független, az anyagra jellemző konstans érték lesz. Egynemű minta esetén az időtengellyel párhuzamosan fut, eltérése a kromatogram alapvonalától fenti konstans értékkel egyenlő abban a tartományban, ahol a detektor az anyagot érzékeli. Minimális a valószínűsége annak, hogy két anyag esetében A és B minden hullámhossznál megegyezzen, ezért a kapott hányados különböző anyagok esetében más és más lesz. Fenti elv alkalmas lehet bizonyos körülmények között az anyag azonosítására is. 28
Két vagy több komponens esetében az egymást részlegesen átfedő csúcsoknál az átfedés helyén a két el nem váló komponens detektor-jeleinek arányát fogja mutatni a hányados kromatogram a tiszta anyagra jellemző vízszintes szélsőértékek között (3.ábra). Kiroptikai detektáláskor további 8 t R1 t R2 S1 S2 S3 előnyt jelent, hogy az előjel 4 függvényében a kapott hányados 0 negatív értéket is felvehet. A módszer elvileg bármilyen két -4 detektor esetén alkalmazható, gyakorlatban azonban akkor van lehetőség felhasználására, ha a kétféle detektálási módszer közel azonos érzékenységű. Ha ez a feltétel nem teljesül úgy előfordulhat az az eset, hogy S A >0 míg S B =0 (azaz a B típusú detektor még nem érzékeli az anyagot). Ebben az esetben a hányados-képzés matematikai szempontból értelmetlen (osztás 2 1 0-1 0 5 10 TIME S1/S2 S3/S1 S3/S2 0 5 10 TIME 3. ábra.: Különböző típusú detektorokból származó modellezet detektorjelek (S1, S2, S3) /fent/ és a belőlük képezhető hányadosok /lent/ zéróval). Gyakorlati szempontból a problémát az jelentheti, hogy az alapvonal viszonylag nagy frekvenciájú, de kis intenzitású jelsorozatnak tekinthető /zaj/ és a két különböző tipusú zajból képzett hányados igen nagy abszolút értékű hányadosokat szolgáltathat. Ez a tényező elsődlegesen az eredmények prezentációját zavarhatja, eliminálására több megoldás adódik. Legkézenfekvőbb, ha a hányados képzést ténylegesen csak a kromatográfiás csúcs/ok/ közvetlen környezetében végezzük el. Matematikai módszerekkel (pl.:fourier-analízis) szintén eliminálható a zaj, ehhez azonban többnyire nagyon drága célszoftver szükséges. A zaj csökkentésére a simítást végző algoritmusok nem használhatók, mivel ezek az egymást követő mérési adatok 29