Tubulin, mikrotubuláris rendszer és mikrotubulus asszociált fehérjék Talián Csaba Gábor PTE ÁOK, Biofizika Intézet 2012. február 21. Transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel egy Heliozoa axopódiumának keresztmetszetéről spirálisan elrendezett microtubulusokkal. Nagyítás- 65,000x.(Wikipedia)
Mikrotubulusok Harris, 1962. első mikroszkópos felvételek Üreges, hengeres, merev cső, ált. hosszú és egyenes Kisméretű fehérjealegységekből felépülő polimer Dinamikus rendszer: folyamatos fel-és leépülés, alegységek állandó cseréje Számos fehérje kapcsolódik hozzá: működés szabályozása Membránorganellumok pozícionálása, intracelluláris transzport pálya, mitotikus orsó, csilló/ostor, sejtalak meghatározása
Tubulin Globuláris fehérje, emberben 444-475 aminosav, 50-55kDa Emberben 5 fő típus Mikrotubulusokban leginkább α és β Centroszóma és poláris test: γ mikrotubulus nukleáció Centriolum és magorsó: δ és ε Számos gén β3 tubulin pl. csak neuronokban Igen nagyfokú hasonlóság, C-terminális változékonyabb Kopolimerizálnak, de specifikus sejten belüli eloszlás is Prokariótákban evolúciós rokon fehérje: FtsZ sejtosztódásban fontos
Dimerizáció Heterodimer képződés α és β tubulin csak együtt, komplexben fordul elő (intracelluláris [tubulin] ~20µM, fele dimerben) polarizált: - és + vég GTP kötőhely Alegységek között mindig GTP nem kicserélhető β-alegységen hidrolizálható lehet GTP vagy GDP kicserélhető
Szerkezeti felépülés Protofilamentumok α(-) β(+) típusú vég-vég kapcsolódás hasonló a dimeren belülihez, erős kötés Szomszédos protofilamentumok α-α és β-β egységek közti kapcsolatok azonos alegységek helikális vonalban Mikrotubulus 13 párhuzamos protofilamentum 20-30nm külső átmérő 14nm belső átmérő hossza 200 nm-25 µm Minden dimer és protofilamentum azonos irányban áll szerkezeti polaritás Egy emlős sejtben (6 pl) 16,5 mm a mikrotubulusok összhossza; egy békapetében(1 µl) 2,500 m!
Szerkezeti változatok Menetemelkedéstől függően képződhet varrat α és β alegységek találkoznak laterálisan Instabilitást okoz a mikrotubulusban In vitro megfigyelt forma β-gtp α-gtp + β-gdp α-gtp seam microtubule 3-start helix
A képződés lépései Protofilamentumok felépülése dimerekből hosszirányban Lapok kialakulása protofilamentumokból oldalirányban Lapok begörbülése, csővé záródás Szabad végekhez további dimerek kapcsolódása Az egyes protofilamentum végek többé-kevésbé eltérő hosszúak lehetnek
Filamentum növekedés Cc A két vég növekedési sebessége elvileg egyforma (szabadenergia változás és kritikus koncentráció megegyezik) Valójában egy gyorsabban változó (+) és egy lassabban változó ( ) vég k + onés k + off, illetve k - onés k - offkülön-külön eltérő a szerkezeti polaritás miatt
Növekedési kinetika Egy dimer beépülése során az utolsó β-tubulin +végéhez egy α-tubulin vége kapcsolódik Az így bezáródó GTP hidrolízise felgyorsul! (polimerben nagyobb sebességgel zajlik) A hidrolízis során felszabaduló energia a fehérje-gdp komplexben marad, és csak leváláskor adódik le ez nagyobb szabadenergia-változást jelent, mint a GTP formáról történő leválás GDP GDP GDP GTP GTP GTP Ezért: K = k / k > K = k / k illetve C GDP c > C GTP c D off on D off on Egyensúlyban: df + / dt = k N c k N = 0 ezért C c + = k / k
Treadmilling Szabad alegységek többnyire GTP-kötött állapotban az alegység beépülésének és a GTP hidrolízis sebességének a mértékétől függ, hogy a végen milyen nukleotid van (Mitchison és Kirschner): a + végen az előbbi gyorsabb: GTP-sapka alakul ki a végen gyorsabb a hidrolízis: GDP-tartalmú alegységek A +vég kritikus koncentrációja kisebb, mint a végé köztes koncentrációkon: a +vég növekszik, a vég lebomlik TREADMILLING A folyamatot a GTP hidrolízis energiája hajtja
steady-state treadmilling
Ha az egyik végen a polimerizáció és a hidrolízis sebessége hasonló, akkor növekedés közben is elveszhet a GTP-sapka Random és hirtelen folyamat, valószínűsége függ a dimerkoncentrációtól Az ilyen végek gyorsan elkezdenek lebomlani Később újra kialakulhat a GTP-sapka, és megint beindul a növekedés lebomló és felépülő állapotok váltakozása: katasztrófa és megmentés Dinamikus instabilitás Mikrotubulus egyik vége általában rögzített: dinamikus instabilitás jellemző
Dinamikus instabilitás Relaxáció egy görbültebb GDP filamentum-konformációba
Mi a dinamikus viselkedés haszna? Mikrotubulusok percenként többször is változtatják a hosszukat, ez fénymikroszkóppal is követhető Nagy mennyiségű energiát igényel Az alegységek gyorsan diffundálnak, könnyen eljutnak a nukleációs helyekre ez a sebességmeghatározó lépés 1. A sejt folyamatosan monitorozza a sejtvázat 2. Elég a nukleációs helyeket szabályozni 3. Csak a hasznos struktúrákat stabilizálja 4.Nagyfokú tér-és időbeli flexibilitás 5. Külső hatásokra gyorsan képes változni
Toxinok Taxol a mikrotubulusokhoz kötve azokat stabilizálja, befagy a sejtváz Colchicin a monomerekhez kötve gátolja a polimerizációt Vinblasztin szintén polimerizációgátló Antimitotikus, daganatellenes szerek
Mikrotubuluskötő fehérjék 1. Motorfehérjék Dineinek: - vég motorok, legnagyobb és leggyorsabb (14μm/s) Citoplazmatikus: homodimer, vezikulatranszport, Golgi-apparátus rögzítése Axonémális: heterodimer vagy -trimer, csilló és ostor Kinezinek: +vég motorok, miozinhoz hasonló szerkezet, 2-2 nehéz és könnyű lánc, két globuláris fej, megnyúlt coiled-coil farok
Mikrotubuluskötő fehérjék 2. Mikrotubulus asszociált proteinek (MAP) Szerkezeti funkciók: Stabilizálás Destabilizálás Keresztkötés
I. Típus kb. 100nm, pálcikaszerű, MT-kötő domén az N-terminálison Számos (Lys-Lys-Glu-X) ismétlődés; A:11, B:21 C-terminális projekciós domén: kiáll a felszínről: távtartás, kötegképzés polimerizációt serkentik (C c -t csökkentik), stabilizálnak II. Típus MT-kötő domén a C-terminális felől (+ töltésű), több is lehet N-terminális projekciós domén változatos hosszúságú Számos kináz fehérje dokkoló helye Sok foszforilálható hely (~40) - MAP-kinázok foszforiláció csökkenti az affinitást a mikrotubulusokhoz Sok PEST (Pro-Glu-Ser-Thr) szekvencia: proteolitikusan érzékeny Tau: hiperfoszforiláltformája kóros neurodegeneratívfolyamatokban (pl. Alzheimer-kór) lerakódik páros helikális filamentumok
Filamentumvég dinamika Stathmin két dimert szekvesztrál, csökkenti a szabad alegységkoncentrációt, fokozza a depolimerizációt és a dinamikus instabilitást Katanin mikrotubulusokat elhasítja gyors depolimerizálódás szabályozása a sejtosztódás során Mikrotubulus dokkolás
Mikrotubulus organizáló központ (MITOK) Mikrotubulus nukleáció γ-tubulint tartalmaz, számos MAP fehérjével egy gyűrűkomplexet képez, ehhez kapcsolódik az α-tubulin vége Centroszóma Csillagszerű, membránmentes organellum A mikrotubulusok szervezésének helye a sejtben Centroszóma mátrixból és gyűrűkomplexekből áll Gombákban és növényekben a magmembránhoz kapcsolódik Állati sejtekben egy pár centriólumot is tartalmaz Egymásra merőlegesen állnak 9 rövid mikrotubulus-triplet Egymáshoz kapcsolódó A, B és C gyűrűk A két utóbbit csak 10 protofilamentum alkotja
Csilló/ostor Keskeny, mozgékony sejtnyúlványok Központi része az axonéma, amelyet membrán borít