PTECIÁLISA BILÓGIAILAG AKTÍV MAKRCIKLUSK SZITÉZISE, AALITIKAI ALKALMAZÁSUK ÉS KRDIÁCIÓS KÉMIAI TULAJDSÁGUK VIZSGÁLATA Doktori (PhD) értekezés Iványi Tímea Debreceni Egyetem Természettudományi Kar Debrecen, 2005
Ezen értekezést a Debreceni Egyetem TTK kémiai Doktori Iskola koordinációs kémiai programja keretében készítettem a Debreceni Egyetem TTK doktori (PhD) fokozatának elnyerése céljából. Debrecen, 2005. Iványi Tímea Tanúsítom, hogy Iványi Tímea doktorjelölt 1999-2003 között a fent megnevezett Doktori Iskola koordinációs kémia programja keretében irányításommal végezte munkáját. Az értekezésben foglalt eredményekhez a jelölt önálló alkotó tevékenységével meghatározóan hozzájárult. Az értekezés elfogadását javasolom. Debrecen, 2005.... Dr. Lázár István egyetemi docens
KÖSZÖETYÍLVÁÍTÁS szinte köszönetemet szeretném kifejezni témavezetmnek, Dr. Lázár István egyetemi docensnek a munkám során nyújtott hasznos tanácsaiért, sokoldalú segítségéért, türelméért és a zavartalan munkavégzést biztosító baráti légkör megteremtéséért. álával tartozom Dr. Emri József egyetemi docensnek az évek során nyújtott szakmai segítségeiért és nem csak szakmai jelleg, de sokkal inkább baráti jó tanácsaiért. Köszönöm Dr. Király Róbert egyetemi docensnek, Rózsa Béla vegyésztechnikusnak a potenciometriás mérések, Dr. Török János tanársegédnek a Maldi-TF mérések elkészítését, és a kiértékelésben nyújtott szakmai segítségét, Dr. Bényei Attila krisztallográfusnak a röntgendiffrakciós szerkezet meghatározásban, Agárdiné Antek Évának az IR spektrumok felvételében és Gálné Remenyik Juditnak a fajlagos forgatóképesség mérések elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm a VRIJE UIVERSITEIT BRUSSEL-FABI minden tagjának, hogy a kapilláris elektroforetikus mérések kivitelezését lehetvé tették, nélkülözhetetlen szakmai tanácsokkal láttak el. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm a D505-ös Makrociklusos-labor minden egykori és jelenlegi tagjának, a laborban dolgozóknak, hogy munkám elvégzésében mindvégig támogattak, lelkesítettek. álával tartozom családomnak.
A DLGZATBA ASZÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Acetát Bu Bn CE CEC CD Ciklén DMF DMPS DMSA DTA DTAGly DTATC DTP DTPA EDTA EEDQ Et EDTA P-D3A PLC i-pr 2 Et Kryptofix-22 K22-R-AlaGly K22-R,R-di(AlaGly) K22-di(AlaGly) Me MeC Me DASA TA TAGly TMP TPME DDA DDAGly DDM PIDA TF TMS Tritil Ts TSP 18C6 18C6 4 :karboximetil- :butil- :benzil- :kapilláris elektroforézis :kapilláris elektrokromatográfia :ciklodextrin :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán :dimetil-formamid :dimerkaptopropán-szulfonsav :dimerkapto-borostyánksav :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetraacetát :1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10-tetrakisz(acetil-amino-ecetsav) :DTA-D-Phe-Tyr-ctreotide :1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7,10-tetrafoszfonát :dietilén-triamin-pentaecetsav :etilén-diamin-tetraecetsav :-etoxikarbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin :etil- : -(2-hidroxi-etil)-etilén-diamin-,, -triecetsav :10-(2-hidroxi-propil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-1,4,7-triacetát :nagynyomású folyadékkromatográfia :,-diizopropil-etil-amin :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán :[2R-2-(1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadec-7-il)-propionilamino]- ecetsav :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2R-2- propionil-amino-ecetsav) :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(2- propionil-amino-ecetsav) :metil- :acetonitril :metanol :1,4,7-triazaciklononán-1-szukcinát-4,7-diacetát :1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-triacetát :1,4,7-triaza-ciklononán-1,4,7-trisz(acetil-amino-ecetsav) :1,4,7-trisz(metilén-foszfinát-monometil)-1,4,7-triaza-ciklononán :1,4,7-trisz(metilén-foszfonát-monoetil)- 1,4,7-triaza-ciklononán :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-diacetát :1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(acetilamino-ecetsav) :1,4,7,10-tetraoxa-7,16-diaza-ciklooktadekán-7,16-bisz(malonát) :piperazin-, -diacetát :tetrahidrofurán :tetrametil-szilán :trifenil-metil- :p-toluol-szulfonil- :trimetilszilil-propánszulfonsav :18-korona-6 : 18-korona-6-tetrakarboxilát
TARTALMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 1 2. IRDALMI ÁTTEKITÉS 3 2.1. rvosdiagnosztikai és terápiás alkalmazások 3 2.1.1. MR tomográfia 3 2.1.2. Radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek 5 2.1.3. Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása 6 2.1.4. Fémmérgezések terápiás kezelése 9 2.1.5. Fiziológiás körülmények között hidrolizáló észterek alkalmazása 13 2.2. Enantiomer szeparáció analitikai eljárások 15 2.2.1. Királis szelektorok 16 2.2.2. Makrociklus komplexképzkkel módosított szilikagél állófázisok 20 3. KÍSÉRLETI EREDMÉYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 25 3.1. idrolizáló oldalláncot tartalmazó észterszármazékok elállítása 25 3.2. Az elállított makrociklusos-észterszármazékok hidrolízisének vizsgálata 35 3.3. ldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos molekulák elállítása 44 3.3.1. Peptidkötést tartalmazó oldalláncok elállítása 44 3.3.2. -(2-bróm-acetil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó származékok elállítása 46 3.3.3. -(2-propionil-amino)-ecetsav oldalláncot tartalmazó diaza-koronaéter származék elállítása 47 3.4. ldalláncban peptidkötést tartalmazó makrociklusos molekulák komplexképz tulajdonságainak vizsgálata 56 3.5. ldalláncban peptidkötést tartalmazó származékok analitikai alkalmazhatóságának vizsgálata 66 3.5.1. Királis diaza-koronaéter származékok alkalmazhatósága a kapilláris elektroforézis technikában 66 3.5.2. Akirális diaza-koronaéter származék, mint módosítószer a mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfiában (MEEKC) 76 3.5.3. Királis diaza-koronaéter származék felhasználása szilikagél állófázisok módosítására, a módosított állófázis vizsgálata 77 4. KÍSÉRLETI RÉSZ 79 5. ÖSSZEFGLALÁS 98 6. SUMMARY 101 7. IRDALMI IVATKZÁSK 104 8. Függelékek 111
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai 1. BEVEZETÉS A makrociklusos vegyületek, ezen belül a poliaza-, poliaza-polioxacikloalkánok az elmúlt néhány évtizedben jelents vegyületcsaláddá fejldtek a laboratóriumi alapkutatások, az alkalmazott kutatások és a gyakorlati alkalmazások tekintetében egyaránt. A makrociklusos effektusnak köszönheten kimagasló komplexképz tulajdonsággal rendelkez vegyületek 1-5 felhasználása önmagukban is igen széleskör, a nitrogén és foszfor donoratomot tartalmazó makrociklusok esetében pedig komplexképzésre alkalmas oldalláncok segítségével a vegyületek koordinációs tulajdonsága tovább növelhet 6. Sok esetben a megnövekedett stabilitás az egyes fémionokkal szemben mutatott szelektivitás mértékének csökkenését eredményezi, ami a kutatások irányvonalát újabb és újabb származékok elállítása felé irányítja. Sokrét felhasználási területük között szerepel az él szervezetben történ szelektív fémionmegkötés és transzportálás 7-9, a létfontosságú fémionok meghatározására alkalmas fluoreszcens markerek elállítása 10-15, az intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása 16-21, a szövetek állapotának ellenrzésére szolgáló MRI kontrasztanyagok 22-31, valamint radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek szintézise 32-37, és egyes fémmérgezések kezelése 38,39. A fémionok mellett kisebb molekulákkal host-guest komplex kialakítására is alkalmasak, ezen alapulnak azok a fémionok, valamint gyógyszerhatóanyagok minségi és mennyiségi meghatározására szolgáló kromatográfiás analitikai módszerek, amelyek makrociklusos molekulákat használnak szelektorként. 40-48 A Debreceni Egyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén közel 15 éve folynak kutatások új, kimagaslóan nagy fémion-szelektivitással bíró, a gyakorlatban több területen is alkalmazható makrociklusos vegyületek elállítására. Ennek a munkának a folytatásaként olyan új makrociklusos származékok elállítását, koordinációs kémiai és kromatográfiás vizsgálatát tztük ki célul, amelyek specifikus komplexképz tulajdonságuk révén magukban hordozzák a gyakorlati alkalmazás lehetségét akár biokémiai, orvosdiagnosztikai és analitikai téren. Munkánkat részben az motiválta, hogy a megnövekedett ipari tevékenységek és az egyre gyakrabban bekövetkez ipari katasztrófák eredményeként a toxikus fémionok él szervezetben történ felhalmozódása egyre nagyobb veszélyt jelent. Szükség van tehát olyan terápiás szerekre, amelyek az él sejtekbe bejutva a toxikus fémionok szervezetbl történ kiürülését elsegítik, meggyorsítják. A kiváló és specifikus komplexképz tulajdonsággal rendelkez makrociklusos vegyületek ilyen jelleg felhasználása korlátozott, ezért szükségszernek láttuk olyan származékaik kifejlesztését és vizsgálatát, amelyek alkalmasak lehetnek a mérgez fémionok szervezetbl történ, szelektív eltávolítására. Munkánk további fázisában célunk volt olyan, amid oldalláncot tartalmazó, makrociklusos származékok elállítása, amelyek az orvosdiagnosztikai és terápiás területek mellett akár analitikai téren is 1
1. Bevezetés alkalmazásba kerülhetnek. Céljaink között szerepelt, hogy az elállítani kívánt amidok közül, a koronaéterek és azok származékainak gyógyszerhatóanyagok, vegyipari alapanyagok tisztaság- és szerkezetvizsgálatára, különböz izomerjeinek elválasztására alkalmas analitikai felhasználhatósága alapján a Kryptofix-22 származékok analitikai területen (CE, PLC) történ alkalmazhatóságát is tanulmányozzuk. Kutatási munkánk eredményei két egyetemen való közös munkaként jöttek létre. A vegyületek elállítását, tisztaság- és szerkezetvizsgálatát (vékonyrétegkromatográfia, oszlopkromatográfia, MR, IR, röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálat, Maldi-TF, forgatóképesség mérés, elemanalízis), komplexkémiai vizsgálatát (p-potenciometria, MR-titrálás), az elállított észterek hidrolitikus tulajdonságának meghatározását, valamint a vegyületek konformációs tulajdonságainak molekulamechanikai és szemiempirikus kvantumkémiai számításokkal és modellezéssel történ tanulmányozását egyetemünkön, a Debreceni Egyetemen végeztük. A munkánk második fázisában elállított vegyületek kromatográfiás alkalmazhatóságát a kapilláris elektroforetikus méréseket Brüsszelben, a Vrije Universiteit Brussel-FABI tanszékén hajtottuk végre. 2
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai 2. IRDALMI ÁTTEKITÉS 2.1. rvosdiagnosztikai és terápiás alkalmazások A poliaza- és poliaza-polioxa-makrociklusos komplexképzk - amelyek dolgozatban elforduló legfontosabb szubsztituálatlan képviselit az 1. ábrán tüntettük fel (3-6) - felhasználása kiváló komplexképz tulajdonságából ereden igen széleskör. Az orvosdiagnosztika számos területén elfordulnak, pl. gammavagy béta-sugárzó radioaktív izotópok szövetspecifikus molekulákhoz kötött komplexeiben, lumineszcens komplexekben, paramágneses kontrasztanyagokban, de intracelluláris fémionkoncentráció meghatározására és toxikus fémionok szervezetbl történ eltávolítására is megfelelnek bizonyultak. A poliazamakrociklusok kémiai reakcióinak és MR spektrumának modellezésére, valamint újabban komplexképzként is alkalmazott piperazin és homopiperazin származékok (1, 2) pedig a gyógyszergyártásban kerültek eddig felhasználásra. 49,50 n n = 0 1 n = 1 2 3 4 n = 0 5 n n = 1 6 1. ábra Gyrs diaminok, valamint poliaza- és poliaza-polioxa-cikloalkánok szerkezete 2.1.1. MR tomográfia Az MRI (magnetic resonance imaging = mágneses rezonancia tomográfia) a szervezetben lév -atommagok által visszasugárzott, összetett rádiófrekvenciás jelet jeleníti meg képi formában, ezáltal alkalmazható az emberi test tanulmányozására, a rákos elváltozások kimutatására. Az eljárás kontrasztanyag nélkül is jó felbontású képet ad a különféle lágy szövetekrl, azonban a paramágneses makrociklusos kontrasztanyagok a lokális mágneses tér megváltoztatásával a közvetlen molekuláris környezetükben lév vízmolekulák protonjainak relaxációs sebességét megnövelik, ezáltal azok zavaró hatását az MRI képalkotásban lecsökkentik, és jobb felbontású felvételt eredményeznek. A gyakorlatban jelenleg a legnagyobb mágneses momentummal rendelkez Gd(III)- ionokat tartalmazó kontrasztanyagokat használják, amelyekben a gadolíniumion valamilyen nyíltláncú (DTPA = Magnevist ) vagy gyrs komplexképzvel 3
2. Irodalmi áttekintés (DTA = Dotarem, P-D3A = Proance ) alkotott megfelel termodinamikai és kinetikai stabilitással rendelkez és szigorú toxicitási feltételeknek eleget tev komplexe formájában található meg 51-53 (2. ábra). 2 Gd 2-2 Gd - 2 Gd [Gd(DTPA)] 2- (7) [Gd(DTA)] - (8) [Gd(P-D3A)] (9) 2. ábra MRI kontrasztanyagként alkalmazott nyíltláncú DTPA és ciklénszármazékok gadolíniumkomplexeinek szerkezete Az MRI kontrasztanyagok tökéletesítése jelenleg is a kutatások figyelmének középpontjában áll. A fejlesztések során elállítottak már olyan, foszfonát és karboxilát funkciós csoportokat tartalmazó, ciklén-alapú gadolínium-komplexeket, amelyek negatív töltés csoportjaikon keresztül alkalmasak poliaminosavakkal (pl. polilizin, poliornitin, poliarginin) történ kölcsönhatás kialakítására azok pozitív töltés aminocsoportjain keresztül (3. ábra). 28 - P 2 R R = -C Gd 2 -P 3 2 -C 2 -C - (10) 3. ábra MRI kontrasztanyagként kifejlesztett vegyes funkciós csoportokat tartalmazó makrociklusos gadolínium-komplex szerkezete A pozitívan töltött poliaminosavak szelektíven kötdnek az egészséges sejtekhez képest nagyobb negatív töltéssel rendelkez tumoros sejtek felületéhez (pl. agytumor, melanoma, rákos tüdsejtek). In vitro vérszérumban végzett kísérletek alapján, a szervezetbe juttatott poliaminosavak felhalmozódásának nyomon követésére, ezáltal a tumoros sejtek kimutatására a 10 származékot alkalmas ágensnek találták. 4
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai Egyre nagyobb érdekldés övezi az MRI kontrasztanyagok új fajtáját, a CEST (chemical exchange saturation transfer = mágneses telítettség kémiai csere útján történ átvitele) anyagokat, amelyek vagy/és protonjának rezonancia frekvenciáján szelektív rádiófrekvenciás gerjesztést alkalmazva, a környez vízmolekulákkal protoncserére képesek, lecsökkentve azok jelintenzitását, és ezáltal zavaró hatását a képalkotásban. A kémiai csere sebességét a környezeti tulajdonságok, mint p, hmérséklet és ion-koncentráció egyaránt befolyásolják. Minél nagyobb a cserélhet protont tartalmazó csoportok és a környez vízmolekulák protonjainak kémiai eltolódása közötti különbség, annál nagyobb CEST hatás érhet el. Mivel bizonyos lantanoida-ionok (pl. Dy 3+, Eu 3+, Yb 3+ ) a környezetükben lév protonok nagymérték hiperfinom eltolódását eredményezik, Aime és társai Ln 3+ -ionok megkötésére alkalmas, amid oldallánccal rendelkez komplexképz vegyületet állítottak el, amely ígéretes CEST-kontrasztanyagként kerülhet alkalmazásba. 54,55 A vegyület etil-észterének Eu(III)-komplexét Zhang és társai vizsgálták (11, 4. ábra). 56,57 R 2 R R Ln R =, Et (11) R 4. ábra CEST kontrasztanyagként alkalmas DTA-amid származék szerkezete 2.1.2. Radioaktív izotópokkal jelzett diagnosztikai szerek Radioaktív izotópokat tartalmazó komplexeket alkalmaznak tumoros sejtek, szövetek kimutatására. Az eljárás lényege, hogy a tumor-antigén ellen termelt ellenanyag klónozása után elállított monoklonális antitestet kinetikailag inert, β- vagy γ-sugárzó radioaktív izotópot tartalmazó vegyülettel jelölik meg. Az így jelzett, biológiailag aktív, szövetspecifikus molekulák a szervezetben az adott fajta antigént tartalmazó tumorhoz lokalizálódnak. A radioaktív 113 I izotóppal jelzett szomatosztatin (=bizonyos szervek normál szabályozását gátló peptid, melynek receptora specifikusan a rákos sejteknél jelenik meg) analóg bioaktív peptidek 32, illetve a nyíltláncú DTPA peptidszármazékainak sikeres gyakorlati alkalmazását 5
2. Irodalmi áttekintés követen, hasonló peptidekkel módosított DTA származékokat állítottak el (DTATC (12), 5. ábra), és alkalmaztak már klinikai szinten is 33. A makrociklusos vegyületek elnye a tumoros sejtek jelzésére használt radioaktív izotópok ( 111 In, 90 Y) stabilabb komplexben tartása. Az 1,4,7-triazaciklononán-1- szukcinát-4,7-diacetát származék (DASA (13)) három karboxilát csoportján keresztül foglalja komplexbe a radioaktív 67 Ga-ot, β-karboxilát csoportjánál fogva pedig alkalmas peptidkötés kialakítására, akár gyakorlatban alkalmazott szomatosztatin analógok kapcsolására. 34 D-Phen Cys Tyr D-Trp Thr(ol) Cys DTATC (12) DASA (13) szomatosztatin analóg 5. ábra Tumoros sejtek jelzésére elállított DTATC és DASA makrociklusok szerkezete, *: biológiailag aktív peptidek kapcsolódási helye Thr Lys * 2.1.3. Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározása Az emberi test diagnosztikai célú vizsgálatának egyik fontos lépése a szervezet számára nélkülözhetetlen kationok szabad mennyiségének gyors és lehetség szerint roncsolásmentes eljárásokkal történ in vivo meghatározása, amely eljárás információt adhat a szervezet egészségi állapotáról, a fémionok hiánya okozta betegségek meglétérl. 31 P MR-es detektálás A stabilitási állandók és a detektálhatóság szempontjából az 1,4,7-triaza-ciklononán metilén-foszfonát (TPME (14)) 16,17 illetve metilénfoszfinát (TMP (15)) 21 oldalláncokat tartalmazó származékai, a Mg 2+ - és Zn 2+ - ionok intracelluláris koncentrációjának meghatározására alkalmas vegyületeknek bizonyultak (6. ábra). Az intracelluláris koncentráció meghatározása 31 P MR nyomkövetés alapján történhet, ugyanis a szervezetbe jutott ligandum, valamint a részvételével létrejöv fém-ligandum komplex az él sejtekben elforduló természetes foszfortartalmú vegyületek (inorganikus foszfát, ATP, AMP, camp) jellemz kémiai eltolódási tartományán kívül, egymástól jól elkülönül jelet ad. A 6
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai jel alatti területek arányából, a stabilitási állandó és a p ismeretében a sejten belüli szabad fémionkoncentráció kiszámítható. Az TPME-bl (14), amely csak Mg 2+ -ion jelenlétében képes bejutni az emberi vörösvérsejtbe, elállítottak több olyan származékot (elssorban észtereket) is, amelyek fiziológiás körülmények között könnyen hidrolizáló oldalláncot tartalmaznak, és feltehetleg a szervezetben közvetlenül TPME-vé hidrolizálnak. 58 Ez azért fontos, mert ezek a vegyületek már önmagukban, más fémion bevitele nélkül is képesek bejutni a vértestekbe, azaz közvetlenül alkalmasak a vértestekben lév magnézium-koncentráció pontosabb meghatározására. Et Et a P a P P a Et Me Me a P a P P a Me TPME (14) TMP (15) C C P Et TA (16) 2A-EP (17) 6. ábra Intracelluláris fémionkoncentráció meghatározására elállított triaza-ciklononán-származékok és a TA szerkezete Az TPME élettani hatásáról állatkísérletekkel bebizonyították, hogy a szervezetbl a vesén keresztül gyorsan kiürül, ezért nem képes a fémionkoncentrációk megállapításához szükséges mennyiségben felhalmozódni. Az TMP (15) az TPME-nél mind komplexképzés, mind a szervezetben történ felhalmozódás szempontjából sokkal elnyösebbnek bizonyult. Az acetát oldalláncot tartalmazó makrociklusos ligandumok magnéziumkomplexeinek stabilitása a foszfortartalmú ligandumokhoz képest nagyobb (logk TPME 18 : 6,20; TMP 59 : 6,66; TA 60 (16): 9,69). Ezen okok miatt foglalkoztak olyan, vegyes oldalláncot tartalmazó ligandumok elállításával is, amelyekben a detektálhatóságot megkönnyít foszfortartalmú oldalláncok mellett a komplex stabilitását növel acetát oldalláncokat is kialakították. 19 Az elállított ligandumok Mg 2+ -ionnal alkotott komplexeinek stabilitása, valamint Mg 2+ /Ca 2+ 7
2. Irodalmi áttekintés szelektivitása alapján a 2A-EP (17) (Mg 2+ : logk 7,26; Ca 2+ : logk 6,43) bizonyult a legmegfelelbbnek (6. ábra). Fénykibocsátáson alapuló fémion-meghatározás Ciklén-alapú, kinetikailag inert, lumineszcens lantanoida komplexek (18) abszorbciós és emissziós spektruma Zn 2+ - ion hatására a fémion koncentrációjának függvényében megváltozik, ezáltal alkalmasak a fémion koncentrációjának nyomonkövetésére és ellenrzésére szimulált extracelluláris térben (p = 7,4, Mg 2+, Ca 2+, a +, Cl - jelenlétében) (7. ábra). 13 Ln = Eu, Tb C R C 2 Ln Me C Me (18) (19) R R. 4 Cl R: ; C 2 CEt 7. ábra Zn 2+ -ionok meghatározására alkalmas lumineszcens ciklén-alapú komplexképzk szerkezete asonlóan, ciklén-alapú Zn 2+ -specifikus kemoszenzorokat (19) vizsgáltak, amelyek izolált él sejt Zn 2+ -ion tartalmának meghatározására bizonyultak alkalmasnak. Ezek önmagukban meglehetsen gyenge fluoreszcenciája a Zn 2+ -ionok hatására többszörösére n (7. ábra). 15 Paramágneses MR shift-reagens A lantanoida-ionokkal stabilis komplexet képez DTP túlium-komplexe, a TmDTP 5- (20), mint paramágneses shiftreagens, 23 a MR segítségével alkalmas az intra- és extracelluláris nátrium rezonanciák elválasztására, ezáltal az intracelluláris a + -koncentráció meghatározására (8. ábra). A szervezetbe juttatott TMDTP 5- csak az extracelluláris térbe jut be, az ott lév a + -iont megkötve annak rezonancia jelét eltolja, mialatt az intracelluláris a + -ion rezonancia jelének kémiai eltolódása és intenzitása változatlan marad. 27 Az eljárás alkalmas pl. intracelluláris oxigénhiányos állapotok kimutatására. 2-2- 3 P 3 P 3+ Tm P 3 P 3 2-2- 5- Tm(DTP) 5- (20) 8. ábra TmDTP 5-, mint paramágneses MR shift-reagens szerkezete 8
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai 2.1.4. Fémmérgezések terápiás kezelése A megnövekedett ipari tevékenységek, a biológiai rendszerekre toxikus hatást gyakorló fémek (Cd, g, Pb, Cu), fémtartalmú vegyületek környezetünkben történ felhalmozódásához vezettek. A toxikus fémionokat tartalmazó vegyületekkel akaratunktól függetlenül, mindennapjainkban kapcsolatba kerülünk. Gondoljunk csak a szennyezett levegre, talajra, természetes vizeinkre, ivóvízre, a növényekben és állatokban akkumulálódott toxikus fémek táplálékláncba történ bekerülésére 61,62, nem beszélve bizonyos szintetikus fémvegyületeket tartalmazó anyagokról, pl. ólomtartalmú festékek 63,64, vagy az elssorban a kelet-európai országokra jellemz ólomcsövekbl készült ivóvízrendszerek korróziója következtében elidézett ivóvizek ólomszennyezdésérl. A fémionok szervezetben való felhalmozódása folyamatos, természetesen a szennyezett környezetnek tartósan kitett egyedek esetében az ártalom mértéke megsokszorozódik. Magyarországot az utóbbi idben, több esetben is sújtotta akut vagy krónikus ólom- illetve kadmiummérgezés kialakulását kiváltó katasztrófa. Ilyen volt például a kilencvenes években a fszerpaprikába kevert mínium 65, illetve a Tisza vizét és élvilágát veszélyeztet többszöri bányaszerencsétlenségek, amelyek többfajta toxikus fémiont juttattak egyszerre a környezetbe 66-69. Ezáltal egészségi és környezeti katasztrófához vezettek, hiszen a toxikus fémionok a létfontosságú féminokhoz való nagyfokú kémiai hasonlóságukból ereden azokat biológiai folyamataikban utánozzák, azokból kiszorítják, és ezáltal a sejtmködési folyamatokat nagymértékben megzavarják. A toxikus fémek enzimekhez, transzportfolyamatokban résztvev fehérjékhez kötdve gátolják a sejtmködést, végs stádiumban akár sejthalált okoznak, illetve fiziológiailag fontos fémionok kiszorításával és szervezetbe történ beépülésével potenciális biológiai zavart kelthetnek. A fémek szervezetbl történ kiürülésének meggyorsítására olyan komplexképz szereket, többnyire kelátképzket használnak, amelyek donorcsoportjaikon keresztül a fémionnal nagy stabilitású komplexet, fémkelátot képezve meggyorsítják azok szervezetbl történ kiürülését. 63 Az ideális kelátképz nagyobb affinitást mutat a toxikus fémionok felé, mint a szervezeten belüli ligandumok, és az eltávolítani kívánt toxikus fémionnal stabilabb komplexet képez, mint a létfontosságú, fiziológiailag fontos fémionokkal. Elnyös farmakokinetikai sajátsággal rendelkezik, kellen felszívódik a szervezetben, a szöveti megoszlása során a toxikus fémionnal stabilis, vízoldékony komplexet képez, amely komplex vízoldékonysága nagyobb, mint a toxikus fémioné önmagában, ezáltal megnöveli a fémkelát vesén keresztül történ kiürülését. Mindezek mellett nagyon fontos, hogy mind a kelátképz, mind a létrejött fémkelát viszonylag atoxikus legyen. 63,70,71 Az 1. táblázatban és a 9. ábrán láthatók azok a terápiás szerek, amelyeket az emberi vagy állati szervezetben keletkezett, nehézfémek vagy metalloidok okozta mérgezések kezelésére használtak. 70 A leginkább ismert és elfogadott kelátképzkre 9
2. Irodalmi áttekintés általánosságban elmondható, hogy hidrofil tulajdonságuk révén a szervezetbl gyorsan kiürülnek, ezáltal a sejtekbe történ bejutásuk, ahol a toxikus fémionok legfbb része lerakódik, meglehetsen korlátozott. Így pl. az ólommérgezés kezelésére használt EDTA jelents mértékben csak a vérben található ólomszennyezdést képes csökkenteni, de nem elegenden hatékony a sejtekben lerakódott ólomion eltávolítására. 63 1. táblázat Toxikus fémionok vagy metalloidok állati és emberi szervezetbl történ eltávolítására hatékonyan alkalmazott terápiás szerek Terápiás szer Fémion Caa 2 EDTA [a] Pb 2+, Cd 2+ BAL (Dimerkaprol) [a] Pb 2+, As 3+, g 2+, Cd 2+, Bi 3+ Meso-DMSA (Chemet) [a] Pb 2+, g 2+, As 3+, Cd 2+ DMPS (Dimaval) [a] g 2+, Cu 2+, As 3+ D-penicillamin [a] Cu 2+, Pb 2+, g 2+ Desferroxamin [a] Fe 3+, Al 3+ Ditokarbamátok [a] Feltehetleg Pt 4+, Cd 2+ DDM [b] 90 Sr 2+ ( [a] Ref. 70, [b] Ref. 38 ) Dimerkaprolt (BAL, 21) használtak ólom, higany és arzén eltávolításra, amelyet a második világháború idején, eredetileg egy arzén tartalmú vegyifegyver (a Lewisite) ellenszereként fejlesztettek ki. 70-72. Lipofil tulajdonsága révén mind az extra-, mind az intracelluláris tér nehézfémion tartalmát képes megkötni, az epén és a vesén keresztül gyorsan ürül ki. Több hátrányos tulajdonsága van, többek között, hogy jó membrán-permeabilitása miatt egyes nehézfémionok (Cd 2+, Meg + ) felhalmozódását fokozza az agyban, a kezelés rendkívül fájdalmas és kellemetlen mellékhatásokkal jár, ezért ma már csak kivételes esetekben használják ólom és bizmut okozta agykárosodás kezelésére. 70 A dimerkaprol káros tulajdonsága miatt szerepét egyre inkább átvették a ditiol-kelátor szerves savak, mint a dimerkaptopropán-szulfonsav (DMPS, 22), dimerkapto-borostyánksav (succimer vagy DMSA, 23). Intracelluláris térben való megoszlásuk kisebb, ezért szöveti felhalmozódásuk kevésbé jelents. Mindkett eredményesen használható arzén, kadmium, ólom és higany kiürülésének fokozására. 71,72 10
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai C 2 SS C 2 S 3 SS C C SS dimerkaprol (BAL) (21) DMPS (22) succimer (meso-dmsa)(23) C 3 3 C SS D-penicillamin (24) acc 2 C 2 Ca Ca C C Caa 2 EDTA (25) 9. ábra A legtöbbet elforduló, toxikus fémionok eltávolítására használt terápiás szerek szerkezete A D-penicillamin (24) elssorban a Wilson-kór (kóros rézfelhalmozódás) vagy esetleges rézmérgezés kezelésére használt kelátor, amely tiol-csoportjai révén ólom- és higanymérgezések kezelésére is alkalmas lehet. 71 A legelterjedtebben használt kelátképz az EDTA (etilén-diamintetraecetsav). Felhasználása ólom- és kadmiumion szervezetbl történ kiürülésének meggyorsítására történik. 70,72 Különböz létfontosságú és toxikus fémionokkal alkotott stabilitási állandóit a 2. táblázatban tüntettük fel. A kálciumionnal mutatott nagyfokú stabilitása miatt kálcium-só (Caa 2 EDTA, 25) formájában juttatják a szervezetbe, ezzel elkerülve a terápia során a létfontosságú kálcium szervezetbl való kivonását. Az extracelluláris térbe jutva, az ott megkötött nehézfémionokat a vesén keresztül üríti ki, hátránya azonban, hogy a terápia kezdeti szakaszában elsegíti a nehézfémionok felhalmozódását az agyban, amely mellékhatása ugyanakkor a terápia elrehaladásával megsznik. A Caa 2 EDTA-terápia másik hátránya annak magas ára és a kezelés meglehetsen hosszú ideje. 63,70 Az EDTA toxikus fémion/létfontosságú fémion szelektivitása meglehetsen alacsony, ezért a kutatók figyelme olyan kelátorok szintézise felé irányult, amelyek nagyobb fémion-szelektivitással rendelkeznek, így a gyrméretébl adódóan szelektív komplexképzésre hajlamos aza-koronaéterek és származékaik kerültek a figyelem középontjába (10.ábra). 38,39 R: Kryptofix-22 (6) R R -C 2 C - 2- DDA (26) -C(C ) 2-4- DDM (27) 10. ábra Kryptofix-22 és származékai szerkezete 11
2. Irodalmi áttekintés A Kryptofix-22 (6) származékok esetében a szelektivitás már az alap makrociklusnál fennáll, ahogyan azt a 2. táblázat is mutatja, azonban a stabilitási állandók meglehetsen alacsonyak. A nitrogénatomokon ionizálódó acetát oldalláncok kialakítása (DDA 2- (26)) újabb koordinációs helyek létrehozása miatt a stabilitási állandók növekedéséhez, ugyanakkor a szelektivitás csökkenéséhez vezetett. abár az DDA elegenden nagy stabilitású komplexet képez az ólom- és a kadmiumionokkal 73, és létfontosságú ionok jelenlétében (Ca 2+, Mg 2+ és Zn 2+ ) az élszervezetben hatékony komplexképzként alkalmazható lenne, terápiás alkalmazása eddig nem valósult meg. Ennek oka, felteheten a megfelel adagolási eljárás hiánya, amely nélkül a diszubsztituált Kryptofix-22 származék meglehetsen toxikusnak bizonyult. 74 2. tábláza EDTA, Kryptofix-22, DDA, DDM, TA ÉS DTA ligandumok különböz fémionokkal alkotott komplexeinek stabilitási állandói Fémion EDTA [a] Kryptofix-22 [a] DDA [b] DDM [b] TA [c] DTA [d] Ca 2+ 10,6 3,87 8,39 7,54 8,93 11,03 Ba 2+ 7,8 2,97 7,63 9,76 8,81 15,85 Sr 2+ 8,6 3,1 8,29 9,79 18,3 18,90 Zn 2+ 16,1 2,65 8,42 6,28 19,8 19,06 Cd 2+ 16,4 5,28 11,07 10,27 16,0 - Pb 2+ 18,2 6,8 13,55 13,03 16,6 24,3 ( [a] Ref. 75, [b] Ref. 38, [c] Ref. 60, [d] Ref. 76 ) A Brücher és társai által elállított bisz(malonát)-oldalláncot tartalmazó DDM-et (27)), amely már a gyakorlati alkalmazhatóság tekintetében elegenden nagy Pb 2+ /Zn 2+ és Sr 2+ /Ca 2+ szelektivitással rendelkezett, állatkísérletekkel az ólomés radioaktív stronciumionnal mérgezett szervezetek kezelésére ezidáig a legalkalmasabb komplexképznek találták. 38,39,77 A ligandum tetranátrium-só formájában kálciumot von el a szervezetbl, az LD 50 érték ennek megfelelen túl alacsony. Dinátrium-kálcium komplexe formájában azonban a toxicitás a nyolcadrészére csökkent, és jelentsen megntt a 90 Sr 2+ -ion kiürülése a szervezetbeli kálciumion megkötése nélkül. A szervezetbl történ toxikus fémek kiürítésének meggyorsítása mellett, a környezetben felhalmozódó toxikus fémionok eltávolítására is egyre több módszer kifejlesztésével foglalkoznak. Ezek lényege az, hogy a szennyezett környezetben lév toxikus fémionokat még a szervezetbe kerülés eltt, megfelel komplexképz alkalmazásával eltávolítják. Alkalmazható módszer ez, pl. ivóvizek ólomtartalmának csökkentésére, amelyre szintén egy makrociklusos vegyület komplexképz tulajdonságát használták fel. A ciklám-származékkal módosított szilikagél állófázis 12
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai szilárd fázisú extrakciós alkalmazásban az ivóvizek ólomtartalmának csökkentésére használható (11. ábra). 78 szilikagél - - - Si 2 C C 2 C 2 (SZ1) 11. ábra Ciklám-származékkal módosított szilikagél állófázis szerkezete 2.1.5. Fiziológiás körülmények között hidrolizáló észterek alkalmazása Régóta alkalmazzák azt az eljárást, amely során az egyébként rosszul felszívódó ionos vegyületeket, gyógyszerhatóanyagot vagy kontrasztanyagot, labilis hidrolizáló észteresített karboxilátcsoportokat tartalmazó vegyület formájában juttatják az él szervezetbe. A könnyen távozó észtercsoportokat tartalmazó molekulák, az észtercsoportok jó lipofilitása következtében könnyebben áthatolnak a sejtmembránon, ezáltal könnyebben eljutnak a célszervekhez/szövetekhez, és fiziológiás körülmények között, általában enzimatikus hatásra (pl. észteráz enzim) a hidrofil formájú hatóanyaggá alakulnak át. 79-81 Meghatározott körülmények között a hidrolízis folyamata kedvezen tanulmányozható homogenizált szövet- vagy sejtszuszpenzión 1 vagy 31 P MR technikával. 82-85 Ez az eljárás kiemelkeden fontos a brön keresztül felszívódó gyógyszerkészítmények esetében, amikor az észteresítéssel a hatóanyag brön keresztül történ átjutását segítik el. Ilyen készítmények például a 3. táblázatban látható különböz nikotinsav-, és szalicilsav-észterek (28, 29). 86 13
2. Irodalmi áttekintés 3. táblázat Brön át felszívódó gyógyszerkészítmények hatóanyagának szerkezeti képlete és márka neve 86 R (28) R (29) R év R év Trafuril Tranvasin Rubriment Rheumacyl icotherm Salenal Radioaktív jódizotóppal jelzett észteresített vegyületeket alkalmaznak a tüd, az idegsejtek valamint a ciszták szerkezetének tanulmányozására. Ezekben a módosulatokban, a karboxilcsoport észteresítésére általában valamilyen alifás alkoholt, pl. n-butanolt használnak, ami lipofil jellegébl adódóan megnöveli a kontrasztanyag tartózkodási idejét. Az észteresítést sikeresen alkalmazták az -(2-hidroxi-etil)-etilén-diamin-,, -tri-ecetsav (EDTA, (30)) esetében, amelynek a lakton formája (EDTAészter, (31)) hatékonyabb a 144 Ce és a 91 Y radioaktív izotópok májból történ kiürülésének meggyorsításához. EDTA (30) EDTA észter (31) 12. ábra A máj toxikus fémiontartalmának csökkentésére használt EDTA és EDTA-észter szerkezeti képlete abár makrociklusos ligandumok észterszármazékainak klinikai alkalmazására még nincs példa, ilyen fajta származékok elállításával már foglalkoztak, hogy csak a már tárgyalt 14 vegyületet 16,17 vagy egyéb hidrolitikus és 14
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai sejtkísérletekre kifejlesztett makrociklus-alapú foszfonát-acetoximetil(am)-észter származékokat 88 említsük. Lázár és társai elállítottak hidrolízisre érzékeny, tetrahidro-2-oxofuran-3-il(butirolakton) oldalláncot tartalmazó piperazin, homopiperazin, 1,4,7-triaza-ciklononán és Kryptofix-22 vegyületeket. 89 A γ- butirolakton hidrolízisét számos, a szervezetben elforduló enzim elsegíti. idrolízistermékei az emberi szervezet számára elnyös biológiai aktivitást mutatnak, meglehetsen alacsony toxicitással rendelkez altató és fájdalomcsillapító hatásúak. 90 yíltláncú analógjaiknak tekinthet kelátképzket már felhasználtak intracelluláris közegben történ fémionmegkötésre, ami azt jelenti, hogy a közismerten fémionszelektív komplexképz tulajdonsággal rendelkez makrociklusos poliaminopolikarboxilátok (DDA, TA, DTA) észterszármazékai a jövben, potenciálisan alkalmazható terápiás szerek lehetnek. 2.2. Enantiomer szeparáció analitikai eljárások Az optikai izomerek elválasztása az analitikai kémiai kutatások egy kiemelkeden fontos témájává vált, legfképpen a gyógyszerészet területén. agyon gyakran ugyanis a gyógyszerek hatóanyagának enantiomerjei gyógyászatilag különböz tulajdonsággal rendelkeznek. Egy optikailag aktív hatóanyag két enantiomerje különbözhet egymástól aktivitásában, mint például az (±)-epinefrin 91, illetve egészségre gyakorolt hatásában, mint például az 1950-es években a terhes nk körében alkalmazott, és a forgalomból azóta már kivont Contergan nev nyugtatószer hatóanyaga, a (±)-talitomid 92. A hatóanyagok enantiomerjeinek tulajdonságbeli különbsége megkövetelte olyan analitikai eljárások kifejlesztését, amelyek alkalmasak királis tisztaságvizsgálatra, és a hatóanyagok farmakokinetikai tanulmányozására. Az optikailag aktív izomerek elválasztása kiemelkeden fontossá vált a biológiailag jelents gyógyszerhatóanyagok építköveinek tekinthet aminovegyületek pl. aminosavak, β-blokkoló ágensek körében is. apjainkban a legelterjedtebben használt kromatográfiás királis elválasztástechnikák a nagynyomású folyadékkromatográfia (PLC) és a kapilláris elektroforézis (CE). Az elválasztás minden esetben olyan szelektort igényel, amely a vizsgált enantiomerekkel eltér ersség kölcsönhatás kialakítására képes. A két eljárás alapjában abban tér el egymástól, hogy amíg a PLC-ben a királis szelektor az állófázisba van építve, a CE a háttérelektrolitban tartalmazza azt. A CE elektroforézis anyagköltségét tekintve egyre inkább elnyben részesített eljárás a folyadékkromatográfiával szemben. Az elektroforézis során a töltéssel rendelkez részecskék elektromos ertér hatására elmozdulnak. Az elmozdulás mértéke az elektroforetikus mozgékonysággal jellemezhet, amely az 15
2. Irodalmi áttekintés alábbi egyenlet szerint függ a következ tényezktl: z i : az i komponens töltésszáma, e: az elemi töltés, E: elektromos ertér, η: az oldat viszkozitása, r i : a szolvatált ion sugara (1. egyenlet). 93 µ 0 i z. e E z. e 6πηr i i = = 1. egyenlet i A vizsgált minta és az alkalmazott szelektor között kialakuló kölcsönhatás a mintakomponensek mozgékonyságát egymáshoz képest megváltoztatja, és így elválasztást indukál. 2.2.1. Királis szelektorok A királis elválasztáshoz olyan optikailag tiszta makromolekulákat használnak, amelyek üreg vagy gyrméretükbl adódóan az elválasztás során in situ kölcsönhatásba lépnek az enantiomer szubsztrátokkal, például diasztereomer molekulakomplexeket képezve. A legszélesebb körben alkalmazott szelektorok a különböz ciklodextrinek és azok származékai 41-46,94, valamint korlátozott számban koronaétereket 44,47,48,91 és kalixaréneket 95-97 is alkalmaznak. A ciklodextrinek D-glükópiranóz egységekbl felépül oligoszacharidok. 91,98 A vödörhöz vagy csonka kúphoz hasonlítható makromolekulák üregméretét a kapcsolódó D-glükopiranóz egységek száma határozza meg, így attól függen, hogy 6, 7 vagy 8 egységbl épülnek fel megkülönböztetünk α-, β- és γ-ciklodextrineket (13. ábra). A * B C 16 β-cd host-guest komplex 13. ábra β-ciklodextrin, mint királis szelektor, és a kromatográfiás elválasztás során kialakuló hostguest komplexek szerkezete Küls felületük a glükóz egységek hidroxilcsoportjainak orientáltsága miatt hidrofil, míg a belsejük a poliéterhidakkal összekötött metiléncsoportok miatt hidrofób tulajdonságú. 99 Az elválasztás a ciklodextrin és a királis részecske közötti intermolekuláris kölcsönhatásokon keresztül (hidrogénkötés, hidrofób-, dipol-dipol és van der Waals) valósul meg. A vizsgált minta hidrofób része a ciklodextrin
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai üregébe ágyazódik, a hidrofil molekularész pedig a ciklodextrin gyrjének pereménél elhelyezked hidroxil- vagy módosított hidroxilcsoportokkal lép ersebb kölcsönhatásba (13. ábra). Mivel a hidroxilcsoportok a CD-ben optikailag aktív szénatomokhoz kapcsolódnak, a kialakuló molekulakomplexek energiája és térszerkezete különböz, aminek következtében, szelektor jelenlétében a diasztereomerek kromatográfiás vándorlási tulajdonsága is eltér. 98 A ciklodextrinek mellett Pederson és társai 100,101 által felfedezett koronaéterszármazékok is képesek molekulakomplex kialakítására 91. Közöttük a 18-korona- 6 -típusú molekulák (18C6, 32) alkalmazása a legelterjedtebb. A kiralitáscentrumot vagy a gyrn alakítják ki, vagy királis szubsztituenst kapcsolnak a molekulához. A Lehn és társai által elállított (-)-18-korona-6-tetrakarboxilát (18C6 4, (33)) 4 gyrszénatomon hordozza az optikai centrumot. 100 Ezt a vegyületet Kuhn és társai használták elször a CE-ben, amely a mai napig az egyetlen, szélesebb körben használt, kereskedelmi forgalomban is kapható királis szelektorként alkalmazott koronaéter (14. ábra). 47 C C C C - - R + - - 18C6 (32) 18C6 4 (33) host-guest komplex 14. ábra 18C6, 18C6 4 és a kromatográfiás elválasztás során a 18C6 4 -el kialakuló host-guest komplex szerkezete Míg ciklodextrinek esetében az aminok rendsége nem befolyásolja az elválasztást, a koronaéterek csak primer aminocsoporttal rendelkez racém elegyek enantiomerjeinek elválasztására használhatók. Az enantiomer, protonált aminocsoportján keresztül a koronaéter gyrjébe ágyazódik, miközben az oxigének nemköt elektronpárjaival három + hidrogénkötést alakít ki (14. ábra). 47,91,98 A szeparáció mértékét a koronaéter és az aminovegyület enantiomerjeinek kiralitást hordozó szubsztituensei között lév sztérikus gátlás mértéke határozza meg, amely különböz stabilitású diasztereomerek képzdéséhez vezet. 47,103 Magasabbrend aminok esetében a nagyobb sztérikus gátlás, valamint a háromnál kisebb számú hidrogénkötés következtében nem alakul ki megfelel stabilitású komplex. Kuhn és társai megállapították, hogy abban az esetben, amikor önmagában sem a ciklodextrin, sem pedig a 18C6 4 (34) nem elég hatékony szelektor, együttesen alkalmazva szinergista hatást fejtenek ki, pozitívan befolyásolva az elválasztás mértékét. 47 Ugyanezt a szinergista hatást fedezték fel akirális 18C6 (33) esetében, amely kiralitáscentrum hiányában, önmagában nem, azonban 17
2. Irodalmi áttekintés ciklodextrinekkel együttesen alkalmazva jelentsen javította a primer aminok királis szeparációját. 104-107 Megállapították, hogy ezekben a ketts szelektor -t tartalmazó rendszerekben a koronaéter támogatja az amin és a ciklodextrin közötti kölcsönhatást. Az aminovegyület hidrofób része a ciklodextrin üregébe ül, amelyet a koronaéter a protonált aminocsoporton keresztül kialakított host-guest kölcsönhatással stabilizál. Az így kialakult trimolekulás-komplex stabilitását, azaz a lehetséges kölcsönhatások ersségét és irányultságát, a szelektorok és a vizsgált aminok kémiai szerkezete befolyásolja. A komplex kialakulása több egyensúlyi folyamattal értelmezhet (15. ábra). 107 K2 R 2 * R 1 3 + K 1 R 2 * R 1 3 + R 2 * R 1 K 3 K 4 R 2 * R 1 15. ábra Trimolekulás-komplex kialakulásának egyensúlyi folyamata CE és MR vizsgálatokkal megállapított egyensúlyi állandók a pimer amin és 18C6 host-guest komplex kialakulását valószínsítik elször, amely ezt követen képez asszociátumot a ciklodextrinnel. A 33 származék mellett több, hasonló szerkezet királis koronaétert, aza/diaza-koronaétert állítottak el, amelyek kromatográfiás felhasználására még nem került sor 103,108. Ezek közül néhány származék látható a 16. ábrán. 3 C 3 C C 3 3 C C 3 3 C 3 C C 3 (34) (35) (36) 16. ábra Királis koronaéter, aza- illetve diaza-koronaéterek szerkezete 18
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai A kiralitáscentrum kialakítását a koronaétergyr szintézise közben valósítják meg, leggyakrabban a gyrt alkotó szénatomon (17. ábra (a) 108, vagy ritkán az oldalláncon (17. ábra (b) 109 ). Y Y Y = C vagy 1, K 2 C 3 (DMF, melegítés, Ar) 2, R R R = C 3 Ts 3 Ts Ts = p-c 3 C 6 5 S 2 3 C (37) C 3 (a) Ts Ts 10 (R)-(+)- -1-fenil-etil-amin, xilén Ts = p-c 3 C 6 5 S 2 3 C C 3 Pr 3, xilén 17. ábra Kiralitásközpont kialakítása (a) aza-koronaéter gyrszénatomján, és (b) diaza-koronaéter oldalláncán Az aminokkal alkotott komplexeik asszociációs állandóját, valamint a potenciálisan királis szelektorként használható koronaéterek enantiomer-felismer képességét UV-VIS és MR spetroszkópiai mérésekkel határozták meg 103,110-115 Az enantiomerek megkülönböztetése során, a királis koronaéter a két enantiomerrel eltér asszociációs állandóval rendelkez molekulakomplexet alkot. Minél nagyobb a különbség a komplexek asszociációs állandói között, annál jelentsebb a királis koronaéter enantiomer-megkülönböztet hatása. Az MR mérések során a királis koronaéter-származékok ún. MR shift-reagensként mködnek. Az aminovegyületek egyes enantiomerjei kiralitásközpontjának környezetében lév csoportok rezonancia jeleit egymástól elválasztják, ezáltal különbséget tesznek az egyes enantiomerek között. A koronaéterek kromatográfiás felhasználásában a királis szeparáció mellett alkálifémek, alkáliföldfémek és átmenetifémek megkülönböztetésére 116-119, különböz rend szerves aminok 120, valamint aromás aminok pozíciós izomerjeinek 48,120,121 elválasztására is van példa. Ezeknek a meghatározásoknak nem feltétele a koronaéter molekula kiralitása, így egyszer szubsztituálatlan 18C6 (32) 3 C (38) C 3 (b) 19
2. Irodalmi áttekintés is hatékonyan alkalmazható. A szeparáció minden esetben a molekulakomplexek eltér stabilitásából és különböz elektroforetikus mozgékonyságából adódik. A semleges koronaéter származékok csak pozitív töltés részecskék megkülönböztetésére használhatók, de anionok elválasztására is sok esetben igény lehet. Mori és társai negatív töltés pozíciós izomereket (pl. naftalén-1,5- diszulfonát, naftalén-2,6-diszulfonát, naftalén-2,7-diszulfonát vagy ftalát, izoftalát, tereftalát) különítettek el egymástól, amihez kétszeresen pozitív töltés diazakoronaéter származékot (39) szintetizáltak (18. ábra). 122 Me 2 + + Me 2 2Cl - (39) 18. ábra Anionos pozíciós izomerek elválasztására alkalmas kationos diaza-koronaéter szerkezete 2.2.2. Makrociklus komplexképzkkel módosított szilikagél állófázisok A makrociklusos vegyületekkel módosított szilikagél állófázisok, a makrociklus szelektív komplexképz tulajdonságát kihasználva alkalmasak a makrociklussal különböz stabilitású komplexet képz fémionok 123, valamint optikailag aktív makrociklusok esetén királis aminok 124-137 folyadékkromatográfiás elválasztására. A szilikagél módosítása költségkímél eljárás, hiszen a gélhez kötött makrociklus mennyisége sokkal kisebb, mintha a makrociklust tartalmazó eluálószert alkalmaznának, ráadásul a szilikagél állófázisok a megfelel regenerálás után többször felhasználhatók. A módosított szilikagél elállítása háromféleképpen valósítható meg. Az els eljárás szerint a kapcsolódó oldallánccal ellátott makrociklust kötik a szilikagélhez, ahogyan Bradshaw és társai is többféle poliaza- valamint poliazapolioxa-cikloalkán származékkal módosított szilikagélt állítottak el, többek között nehézfémionokkal szennyezett vizek tisztítására. 137-141 Megállapították, hogy a szilikagélhez kötött makrociklusok fémkomplexeinek stabilitása közel azonos a módosítatlan makrociklusok komplexeinek stabilitásával. A szilikagél módosítása az elzleg elállított makrociklusos vegyület szilikagélhez történ kapcsolásával történt (19. ábra). 20
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai szilikagél C 2 C 2 C=C 2 C 2 (C 2 ) 3 -Si(C 2 5 ) 2 C 2 (C 2 ) 3 -Si R Pt kat. R R Si(C 2 5 ) 2 C 3 C 3 szilikagél C 3 R melegítés R R R = benzil; hexil; etil (SZ2) 19. ábra Szilikagél módosítása makrociklusos vegyület szilikagélhez történ kapcsolásával A második eljárás szerint, az elzekben említett szintézistl eltéren, elször klórpropil csoportot alakítanak ki a szilikagélen, majd az aza-koronaétert a már módosított szilikagélhez kapcsolják (20. ábra). 142 szilika + (C 2 5 ) 3 SiC 2 C 2 C 2 Cl kat., toluol reflux szilika Si C 2 C 2 C 2 Cl bázis, DMF melegítés szilika Si C 2 C 2 C 2 ACPS (SZ3) 20. ábra Aza-makrociklussal módosított szilikagél elállítása a makrociklusnak, klór-propil csoporttal módosított szilikagélhez történ kapcsolásával A harmadik módszer szerint a gyrzárást a kapcsolódó oldallánccal módosított gélen viszik végbe, ahogyan azt a 21. ábra mutatja. 143 21
2. Irodalmi áttekintés -() kat., toluol szilikagél -() + (C 3 ) 3 Si(C 2 ) 3 C 2 C C 2 -() reflux - 2 C 2 C 2, kat. szilikagél - Si(C 2 ) 3 C 2 C C 2 DMF, reflux - szilikagél - - - Ts- Si(C 2 ) 3 C 2 CC 2 C 2 C 2 n - Ts a, DMF, TF Ts = p-c 3 C 6 5 S 2 szilikagél - - Si(C 2 ) 3 C 2 - n (SZ4) n = 1 vagy 2 21. ábra Aza-makrociklussal módosított szilikagél kialakítása szilikagélen történ gyrzárással Elállították a már CE-bl ismert és alkalmazott 18C6 4 -tal (33) kapcsolt szilikagél állófázist (CSP-18C6I, SZ5), amelynek 3-aminopropil csoporttal módosított szilikagélhez történ kapcsolása, reaktív csoport hiányában, egy a peptidszintézisben használt kapcsolóágens, az -etoxikarbonil-2-etoxi-1,2- dihidrokinolin (EEDQ) segítségével történik (22. ábra). 129 A koronaéterrel nem reagált aminocsoportokat ecetsavanhidriddel acetilezve lezárták. Különböz primer aminosavak, aminosav származékok, aminoalkoholok, st a kapilláris elektroforézisben tapasztaltakkal ellentétben szekunder aminocsoportot tartalmazó β-blokkoló ágensek elválasztására is használható. 22
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai - - - - Me Si Me Si C 3 C - - - - Me Si Me Si 2 2 (+)-18-korona-6- tetrakarboxilát, EEDQ ecetsavanhidrid - - - - Me Si Me Si C C 3 C 3 C - - - - Me Si Me Si C C CSP-18C6I (SZ5) 22. ábra 18C6 4 -el módosított királis szilikagél állófázis kialakítása Makrociklusos vegyületek (koronaéter- és ciklám-származékok) és ciklodextrinek királis elválasztásra gyakorolt együttes szinergista hatását a makrociklussal szubsztituált β-ciklodextrinnel módosított szilikagél állófázisok UPLC-s és CEC felhasználásával igazolták (23. ábra). 131,135,144 (C()C 2 Br) y C 2 CC 2 (C 2 ) 3 Si (C()C 2 Br) z - - - (C()C 2 Br) y C 2 CC 2 (C 2 ) 3 Si (C()C 2 Br) z - - - (x+y+z ~ 3,2) (x+y+z ~ 2,4) (C 2 C()C 2 Br) x (C 2 C()C 2 Br) x 2 AQ2D18C6-CD-PS (SZ6) (SZ7) 23. ábra Makrociklussal szubsztituált β-cd-nel módosított királis szilikagél állófázis szerkezete Az enantiomer elválasztás során a puffer-oldatban lév fémiont a szilikagélen kötött makrociklus-egység komplexbe foglalja, ezáltal pozitív töltést alakít ki a módosított 23
2. Irodalmi áttekintés szilikagélen. A pozitív töltés makrociklussal szubszitutált β-cd extra elektrosztatikus és dipoláris kölcsönhatások kialakítására képes a mintakomponenssel, amely ersebb host-guest kölcsönhatást eredményez, ezáltal javítja a királis elválasztás és a szelektivitás mértékét. Az irodalmi adatokból látható, hogy nagyon sok fejlesztés történik a kromatográfiás királis állófázisok elállításának és alkalmazásának irányába. Analitikai alkalmazhatóságukat és jelentségüket a legjobban az mutatja, hogy egyik származékuk, a (3,3 -difenil-1,1 -binaftil)-20-korona-6-tal (40, 24. ábra) szubsztituált CRWPACK CR (+) szilikagél állófázis már kereskedelmi forgalomban is kapható (Daicel Chemical Industries), és elterjedten használt primer aminocsoportot tartalmazó, racém származékok ennatiomerjeinek elválasztásához. 48,132,145-147 24. ábra A CRWPACK-CR (+) királis állófázis kialakításához használt (3,3 -difenil-1,1 -binaftil)- 20-korona-6 szerkezete (40) 24
Potenciálisan biológiailag aktív makrociklusok szintézise, analitikai alkalmazásuk és koordinációs kémiai 3. Kísérleti eredmények és értékelésük 3.1. idrolizáló oldalláncot tartalmazó észterszármazékok elállítása Munkánk els részében széleskör szintetikus kutatást végeztünk labilis, hidrolizáló oldalláncot tartalmazó gyrs diaminok, polioxa-diaza-koronaéterek és poliaza-makrociklusos származékok elállítására, amely során a kereskedelemben megtalálható valamennyi potenciálisnak számító kiindulási anyag alkalmazhatóságát megvizsgáltuk. Az oldalláncok kapcsolására használt α-bróm-karbonsav-észterszármazékát, bróm-acetil-bromid és a megfelel hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületek nukleofil szubsztitúciós reakciójában állítottuk el (1-3. egyenlet). Elssorban olyan észtereket szintetizáltunk, amelyek önmagukban vagy valamely rokonvegyületként gyógyszerhatóanyagok módosítására az irodalomban már elfordultak. Ilyenek voltak például a gyakorlatban elterjedten alkalmazott, brön keresztül felszívódó észterszármazékok közül az etoxi-karbonil-metil-acetát, a benzil-acetát illetve a 2-hidroxi-etil-acetát oldalláncok. 86 A hidroxil-csoportot tartalmazó vegyületek egy részét, amelyek kereskedelmi forgalomban nem voltak elérhetk, vagy magas áruk indokolttá tette, magunk szintetizáltuk. Az etil-glikolátot (41) és a benzil-glikolátot (42) Fisher módszere alapján 148 állítottuk el glikolsavból és a megfelel alkoholból kiindulva (1. egyenlet) sósav katalízissel. A 2-benziloxi-etanolt (43) Butler eljárása szerint készítettük 149 etilén-glikolból, benzil-bromidból és kálium-hidroxidból. (2. egyenlet). Ezt követen bróm-acetil-bromidot és a kiválasztott hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületet ((etil-glikolát (41), butil-glikolát, benzil-glikolát (42), 3-hidroxi-dihidrofurán-2-on, 2,2,2-trifluoro-etanol, 2-benziloxi-etanolt (43)) vízmentes diklórmetános közegben, a forrás hmérsékletén reagáltatva jutottunk el a megfelel α- bróm-karbonsav-észterekhez (41-49). 25