Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Berki Tímea és Boldizsár Ferenc Jelátvitel INTRACELLULÁRIS/ NUKLEÁRIS RECEPTOR JELÁTVITEL
Történeti háttér G. T. Beatson skót sebész inoperábilis emlőrák regresszióját írja le ovariektómia után Az állatok kasztrációja javítja a hús minőségét Ősi kínai orvoslás placenta extraktumot használ 1926 Kendall ésreichstein kortizon és tiroxin Butenandt/Doisy ösztrogén (terhes nő vizeletében) Androszteron és progeszteron (sertés corpus luteumból izolálták) estrus ~ oistros (Greek) = bögöly 1961 Jensen: ösztrogén receptor 1980-as évek: ER, GR, TR klónozása (Chambon, Evans és Vennström)
Hatásmechanizmus Nukleáris receptorok a sejtekben található fehérjék, amelyek a szteroid és thyroid hormonok és más lipofil molekulák érzékelését végzik Ligand kötődése a nukleáris receptorhoz annak konformációváltozását idézi elő, amely aktiválódva, transzkripciós faktorként viselkedik A receptor aktivációja gének átíródásának fokozását vagy gátlását eredményezi.
Transzkripciós faktorok Transzkripciós faktorok: szekvencia-specifikus DNSkötő faktorok Szabályozzák a DNS genetikai információjának átíródását mrns-re Aktivátorként hatnak (= segítik a génexpressziót) vagy represszorok (= gátolják a génexpressziót) szabályozva az RNS polimeráz toborzását
Transzkripciós faktorok vizsgálata Transzkripciós faktor aktivitás: Luciferáz teszt Kromatin immunoprecipitáció (ChIP) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Transzkripciós faktor interakció: Ko-immunoprecipitáció
Luciferáz riporter assay 1. A célsejt transzfekciója Luc Vectorral 2. A sejtek aktiválása 3. Signaling, TF aktiváció 4. Luciferáz szintézis 5. Fényelnyelődés mérése RNS polimeráz és transzkcripciós faktorok Promóter Reporter gén Transzkripció mrns Transzláció Reporter fehérje
Ligandok 17-b-ösztradiol Ösztrogén receptor (ER) Tesztoszteron Androgén receptor (AR) Kortizol Glükokortikoid receptor (GR) A-vitamin Retinsav receptor (RAR) Trijódtironin (T 3 ) Tiroid hormon receptor (TR) Kalcitriol D-vitamin receptor (VDR) Lipofil hormonok: A keringésben transzport fehérjékhez kapcsolódnak; a plazmamembránon transzport fehérjéhez kötődve vagy passzívan lépnek át
A nukleáris receptorok faji megoszlása TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 A nukleáris receptorok állatokra jellemzőek, algákban, gombákban és növényekben nincsenek A C. elegans-nak 270 ismert receptora van Számos orphan receptor létezik!!! Az emberi nukleáris receptorok száma 48, egérben és patkányban 49 illetve 47 nukleáris receptort találtak
Intracelluláris receptorok Szteroid hormon rec. Ösztrogén rec. (ER) Ösztradiol Glükokortikoid rec. (GR) Mineralokortikoid rec. (MR) Androgén rec. (AR) Progeszteron rec. (PR) Tiroid hormon rec. Tiroid hormon rec. (TR) T3 Kortizol Aldoszteron Tesztoszteron Progeszteron Retinoid rec. Retinsav rec. (RAR) All-transz-retinsav Retinsav X rec. (RXR) 9-cisz-retinsav D-vitamin rec. D-vitamin rec. (VDR) 1,25-hidroxi-kolekalciferol Lipid szenzorok Máj X rec. (LXR) Oxiszterolok PPAR Farnesoid X rec. (FXR) Peroxiszóma proliferátor aktivált rec. Epesavak Zsírsavak, eicosanoidok (pl. LT-k, PG-k)
Nukleáris receptor családok Szteroid Recetorok RXR Heterodimerek GR Glükokortikoid T3R Tiroid hormon MR PR Mineralokortikoid Progeszteron GR GR RAR VDR All-transz RA 1,2,5-(OH)2-VD RXR R AR Androgén PPARa Zsírsavak PPARg 15d-Δ 12,14 -PGJ EcR Ekdizon FXR Epesav CAR Androsztán LXR Oxiszterol PXR/SXR Xenobiotikumok Dimer Orphan - Árva Receptorok Monomer Orphan - Árva Receptorok RXR COUP HNF-4 TR2 TLX GCNF 9-cisz RA RXR RXR NGFI-B SF-1 Rev-erb ROR ERR RXR
A nukleáris receptorok szerkezeti felépítése 50-500 aminosav, variábilis Dimerizáció N-terminális domén Hinge régió C-terminális domén A/B C D E F AF-1 DNS-kötő domén (DBD) Ligand-kötő domén (LBD) AF-2 200-250 aminosav, mérsékelten konzervált 70 aminosav, konzervált AF-1: aktivációs funkció 1 (ligand-független) AF-2: aktivációs funkció 2 (ligand-függő)
A szteroid receptorok hatásmechanizmusai TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 HSP Hormon Plazma membrán Citoplazma GR GR GR HSP GR Sejtmag RXR R Ko-represszor Ko-aktivátor RNS polimeráz HRE Ko-aktivátor RNS polimeráz Ko-represszor GR GR Ko-aktivátor RNS polimeráz Ko-aktivátor Ko-aktivátor RXR R RXR RXR Transzkripció RNS Transzkripció RNS Transzkripció polimeráz polimeráz HRE HRE HRE
A GC hatás időbeli lefolyása Szabályozás szintjei Ezredmásodperc (?) Órák-napok Másodpercek -percek (?) CBG kötés a vérben MDR a membránban Metabolizmus és a nukleáris receptor sorsa Molekulák találkozása? Kötődés TF-ok? Ko-regulátorok Dimerizáció Sejtmag Transzkripció GRE Szteroid MR/GR
NR-ok típusai I-típusú nukleáris receptorokhoz tartoznak a 3-as alcsoport receptorai, mint az androgén receptor, ösztrogén receptorok, glükokortikoid receptor és progeszteron receptor II-típusú nukleáris receptorokhoz főleg az 1-es alcsoport tartozik, mint a retinsav receptor, retinoid X receptor és tiroid hormon receptor
I-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán HSP Citoplazma HSP NR NR NR NR Fehérje Megváltozott sejtműködés mrns Ko-aktivátor Sejtmag RNS polimeráz mrns NR NR Ko-aktivátor RNS polimeráz HRE Célgén
I-típusú NR jellemzői Ligand hiányában a citoszolban találhatóak Hormon kötődése a receptor disszociációját okozza a hősokkfehérjéről (Hsp), majd annak dimerizációja után a receptor nukleáris transzlokációját A sejtmagban specifikus DNS szakaszokhoz (Hormone Response Element, HRE) kapcsolódik A NR-DNS komplex egyéb fehérjék toborzását indítja el, amelyek felelősek a transzkripció és új fehérjék transzlációjának elindításáért, amely végül a sejt funkciójának megváltozását eredményezi
A citoplazmatikus receptor komplex Hsp90, 70, 40 + ko-chaperone p23 + immunophilin (pl. FKBP52): dynein-hez (motorfehérje) kapcsolja a komplexet Dinamikus összekapcsolódás-szétkapcsolódás Ligand-kötött receptorok a mikrotubulusok mentén transzportálódnak a nukleáris pórusokhoz
II-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán Megváltozott sejtműködés Citoplazma Fehérje mrns Sejtmag Ko-aktivátor Ko-represszor RNS polimeráz mrns RXR Ko-represszor TR RXR TR Ko-aktivátor RSA polimeráz HRE HRE Célgén
II-típusú NR-ok A ligand jelenlététől függetlenül a sejtmagban helyezkednek el, általában hetero-dimer formában (általában RXRel) kapcsolódnak a DNS-hez Ligand hiányában a II-típusú nukleáris receptorok gyakran ko-represszor fehérjékkel kapcsolódnak
Nukleáris receptor heterodimer formája PPRgamma (zöld) és RXR alpha (kék) kettősszálú DNS-sel komplexben (lila), NCOA2 ko-aktivátor peptiddel (piros).
DNS kötés DNS kötőhelyek (= Response Elements): 2x6 bázispár Szteroid rec. (homodimer): palindrom, invert ismétlődő szakaszok 3bp spacer-rel elválasztva (IR3) GR, MR, PR, AR: 5 -AGAACA-3 ER: 5 -AGGTCA-3 Nem-szteroid rec.: 5 -AGGTCA-3 direkt ismétlődő szakaszok (DRn, n=spacerek száma) homodimerek (pl. TR, VDR) heterodimerek (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR, CAR, PPAR)
A NR-ok genomikus hatása Ligand LBD RE DBD
A DNS-kötő domén (DBD) szerkezete TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 A humán progeszteron receptor DNS-kötő doménjének dimerje (kék és zöld) és kettősszálú DNS (lila) komplexe. A cinkatomokat szürke pontok jelölik.
Gén szabályozás Transzaktiváció: Ligand-kötött receptor ko-aktivátorokat toboroz transzkripció aktiválása: interakció általános transzkripciós faktorokkal + kromatin felnyitása (ATP-dependens kromatin remodeling/hiszton acetiláció) Ligand-kötés ko-represszor disszociáció ko-aktivátor kötése Transrepresszió: Ligand hiányában a transzkripció folyamatos, ligand-kötés gátolja a transzkripciót
Transzrepresszió ligand szelektivitás TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Bizonyos nukleáris receptorok nemcsak közvetlenül kapcsolódnak DNS szakaszokhoz, hanem képesek transzkripciós faktorokhoz is kötődni. Ez a kötődés általában a másik transzkripciós faktor inaktiválását eredményezi. Bizonyos GR ligandok, un. szelektív glükokortikoid receptor agonisták (SEGRA-k) képesek a GR-t úgy aktiválni, hogy az erősebb transzrepressziós, mint transzaktivációs hatású Ez a ligand-szelektivitás lehetővé teszi olyan ligandok kifejlesztését, amelyek erősebb gyulladásgátló hatásúak, kevesebb nemkívánatos metabolikus mellékhatást okozva
A NR-ok szabályozása A transzkripciós aktivitás növelése: Foszforiláció: Ser maradványok az N-terminális A/B doménen Ciklin-dependens kinázok PKC, PKA ERK PKB/Akt JNK/SAPK p38-mapk AF-1: CDK, ERK, JNK, p38-mapk, PKB AF-2: Src az ER-nál
A NR-ok szabályozása A transzkripciós aktivitás gátlása: A DNS-kötő domén (DBD) foszforilációja PKC vagy PKA által
Terápiás lehetőségek hormon analógok Glükokortikoidok: anti-inflammatorikus, immunoszupresszív kezelések (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció, egyes leukémiák) Szexuál szteroidok: szubsztitúciós terápia (endokrin betegségek), fogamzásgátlás, emlőrák Tiroxin: tiroidectomia után szubsztitúciós therápia A/D-vitamin deficiencia